BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
LÊ LAN HƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM BÀO TỬ
BACILLUS SUBTILIS BẤT HOẠT HẤP PHỤ KHÁNG
NGUYÊN CÚM A/H5N1 VÀ ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH
ðÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT
iiiLỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn,
giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của toàn thể cán bộ nghiên cứu của phòng Vi sinh
vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam. Và sự hướng dẫn, góp ý của quý thầy cô cùng
toàn thể cán bộ Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Khoa Công nghệ Sinh
học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô Trường ðại học
Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS. TS. Nguyễn Quang Thạch
ñã truyền ñạt những kiến thức mới và giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất ñến PGS.TS. ðinh
Duy Kháng ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu
ñể tôi hoàn thành khóa luận, mà trên tất cả là truyền ñạt cho tôi kinh nghiệm
làm việc và tư duy nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều
kiện, giúp ñỡ tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này.
Hà Nội, ngày 12 tháng 09 năm 2013
Học viên
17
1.3.4 Vaccine phòng cúm A/H5N1 19
1.3.5 Chất bổ trợ dùng trong vaccine cúm A/H5N1 21
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 Vật liệu nghiên cứu 24
2.1.1 Sinh phẩm nghiên cứu 24
2.1.2 Các dung dịch, hoá chất, môi trường dùng trong nghiên cứu 24 v2.1.3 Các trang thiết bị và dụng cụ dùng cho nghiên cứu 25
2.2 Phương pháp nghiên cứu 27
2.2.1 Ấp trứng 27
2.2.2 Soi trứng 27
2.2.3 Tiêm trứng 27
2.2.4 Thu hoạch trứng 28
2.2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (kiểm tra hiệu giá HA) 29
2.2.6 Phương pháp sản xuất kháng nguyên virus tinh chế 30
2.2.7 Phương pháp ñiện di protein 31
2.2.8 ðịnh lượng HA bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch (SRD) 32
2.2.9 Phương pháp ELISA 33
2.2.10 Phương pháp phân tích khả năng hấp phụ hạt virus bất hoạt trên
bào tử B.subtilis 34
2.2.11 Phương pháp chuẩn bị chế phẩm bào tử B.subtilis PY79 hấp phụ
hạt virus cúm NIBRG-14 tinh chế bất hoạt
35
2.2.12 Gây miễn dịch trên chuột thí nghiệm và thu mẫu ñể phân tích ñáp
ứng miễn dịch
1 Kết luận 49
2 Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 57
CÔNG TRÌNH ðà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN VĂN 61 viiDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1. BSA: Albumin from Bovine Serum (Albumin từ huyết thanh bê)
2. CDC: Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm soát
và Ngăn ngừa dịch bệnh)
3. FAO: Food and Agriculture Organisation of United Nations (Tổ chức
lương thực và nông nghiệp của Liên hiệp quốc)
4. HPAI: Highly pathogenic avian influenza (Cúm gia cầm ñộc lực cao)
5. IVI: International Vaccine Institute (Viện Vaccine Quốc tế)
6. MDCK: Madin – Darby Canine Kidney (Tế bào thận chó Madin – Darby)
7. NIBSC: The National Institute for Biological Standards and Control (Viện
Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh Sinh học)
8. OIE: World Organisation for Animal Health (Tổ chức Thú y Thế giới)
9. PBS: Phosphate Buffered Saline (Muối ñệm phosphate)
1.1 So sánh diện dịch cúm qua các năm 10
1.2 Số lượng các ổ dịch xuất hiện trung bình trong 1 năm chia theo
các tháng
10
1.3 So sánh mức ñộ dịch cúm qua các năm 11
1.4 Cấu trúc hạt virion và hình thái của virus cúm A 13
3.1 Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu của dịch niệu 36
3.2 Hai dải băng virus xuất hiện sau khi li tâm phân vùng 37
3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra protein của virus NIBRG-14 sau tinh chế 39
3.4 ðồ thị biểu diễn ñường chuẩn tương quan giữa giá trị OD
595nm
và
nồng ñộ BSA
42
3.5 Kỹ thuật SRD ñịnh lượng kháng nguyên HA. 43
3.6 Kết quả hấp phụ hạt virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tinh chế lên
bào tử B. subtilis PY79 bất hoạt.
45
3.7 Kết quả ñáp ứng kháng thể của chuột gây miễn dịch với kháng
nguyên cúm NIBRG-14.
47
1
2
truyền ngược, người ta bắt buộc phải sử dụng chất bổ trợ vaccine. Hiện nay,
Viện Công nghệ sinh học ñã sản xuất thành công vaccine cúm gia cầm H5N1
với chủng NIBRG-14 nhận của NIBSC (Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và
Kiểm ñịnh sinh học), Vương Quốc Anh. Vaccine ñã ñược thử nghiệm công
cường ñộc tại viện thú y và ñã chuyển giao công nghệ sản xuất cho
NAVETCO, Thành phố Hồ Chí Minh. Chất bổ trợ vaccine dùng cho vaccine
cúm gia cầm ñược sử dụng ở Việt Nam là Montanide ISA 50 và Montanide
ISA 70. ðối với vaccine cúm cho người, các cơ sở sản xuất ñều dùng chất
chất bổ trợ vaccine là hydroxide nhôm. Tuy nhiên, ñây là những chất bổ trợ
có giá thành tương ñối cao. Hơn nữa, cho ñến nay, các vaccine cúm H5N1
dùng cho gia cầm và cho người ở Việt Nam ñược ñưa vào cơ thể qua ñường
tiêm bắp, chưa có công trình nào nghiên cứu về khả năng tìm kiếm phương
thức ñưa vaccine vào cơ thể qua ñường hô hấp bằng phương pháp khí dung và
ñánh giá tính sinh miễn dịch của vaccine.
Việc tiếp tục tìm kiếm các chất bổ trợ vaccine có ưu thế hơn, ñặc biệt
các chất bổ trợ ñưa vaccine qua ñường mũi bằng khí dung ñể tạo ñáp ứng
miễn dịch tại chỗ là công việc ñã và ñang ñược nhiều phòng thí nghiệm trên
thế giới quan tâm. Các chất bổ trợ ñể ñưa vaccine vào cơ thể qua ñường hô
hấp – khí dung tạo ñáp ứng miễn dịch tại chỗ có ý nghĩa ñặc biệt vì giá thành
hạ và ít tác dụng phụ. Bào tử Bacillus subtilis ñã ñược nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới chứng minh là chất bổ trợ vaccine tạo ñáp ứng miễn dịch
tại chỗ có tiềm năng. ðây sẽ là phương pháp có lợi thế vì dễ thực hiện, giá
thành rẻ, dễ triển khai rộng rãi, ñặc biệt ñối với gia cầm.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành ñề tài: Nghiên cứu tạo
chế phẩm bào tử Bacillus subtilis bất hoạt hấp phụ kháng nguyên cúm
A/H5N1 và ñánh giá khả năng sinh ñáp ứng miễn dịch trên chuột.
1998). Theo thông báo của WHO, tới cuối năm 1997, ñã có 18 trường hợp
nhiễm cúm H5N1 tại Hong Kong, trong ñó có 06 ca tử vong. Tình hình ñặc
biệt trở nên nghiêm trọng từ cuối năm 2003 ñầu năm 2004, khi dịch cúm gia
cầm ñã lan rộng ra nhiều nước châu Á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung
Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan và Indonesia. Tại các nước này,
hàng triệu gia cầm ñã bị chết và bị tiêu huỷ do virus cúm H5N1.
Năm 2009, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 17 quốc gia và vùng lãnh
thổ bao gồm: Afghanistan, Bangladesh, Cămpuchia, Trung Quốc, ðức, ðặc
khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Nhật Bản, Lào, Mông Cổ, Nepal,
Nigeria, Nga, Tây Ban Nha, Thái Lan, Togo, Việt Nam.
Năm 2010, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 16 quốc gia và vùng lãnh
thổ bao gồm: Bangladesh, Bhutan, Bungari, Cămpuchia, Trung Quốc, ðặc
khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Israel, Lào, Mông Cổ, Myanmar, Nepal,
Rumani, Nga, Tây Ban Nha và Việt Nam.
Năm 2011, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại các quốc gia và vùng lãnh
thổ bao gồm: Bangladesh, Cămpuchia, Trung Quốc, Ấn ðộ, Indonesia, Iran, 5Israel, Nhật Bản, Mông Cổ, Myanmar, Hàn Quốc, Hy Lạp, ðặc khu hành
chính Hồng Kông và Việt Nam.
Từ ñầu năm 2012 ñến nay, dịch cúm trên gia cầm ñã xảy ra tại: Ai Cập,
Bangladesh, Nepal, Bhutan, Ấn ðộ, ðặc khu hành chính Hồng Kông, ðài
Loan (Trung Quốc), Myanmar, Israel, Việt Nam, Bangladesh, Indonesia,
Nepal, Bhutan.
Tính ñến nay, virus H5N1 ñã lan rộng ra hơn 60 nước thuộc châu Á,
châu Âu và châu Phi (Peiris JSM et al. 2007; Cục Thú y, 2012).
Tình hình càng trở nên rất ñáng lo ngại khi H5N1 có thể nhiễm từ gia
Chết
Mắc
Chết
Mắc
Chết
Mắc
Chết
Azerbaijan 8 5 0 0 0 0 0 0 0 0 8 5
Bangladesh 1 0 0 0 2 0 3 0 1 1 7 1
Cambodia 9 7 1 1 8 8 3 3 11 8 32 27
China 38 25 2 1 1 1 2 1 2 2 45 30
Djibouti 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Egypt 90 27 29 13 39 15 11 5 4 3 173
63
Indonesia 162
134
9 7 12 10 9 9 0 0 192
160
7Phi trong giai ñoạn 2006-2007 và hiện vẫn ñang tồn tại trong quần thể gia
cầm ở một số nước thuộc châu Á và châu Phi (Li Y et al. 2011). Trong thời
gian này, clade lưu hành chủ yếu ở ðông Nam Á là clade 2.3.4. Gần ñây,
clade 2.3.2 lại ñược phát hiện trên chim hoang dại ở Hồng Kong, Nhật Bản,
Nga và Mông Cổ. Người ta cũng phát hiện sự xuất hiện lặp ñi lặp lại của
clade 2.3.2 ở chim hoang dại tại châu Âu, ñồng thời cũng thấy các vụ dịch do
clade này xuất hiện thường xuyên hơn ở các nước ðông Nam Á (Kang HM et
al. 2011; Reid SM et al. 2011). Các chủng virus cúm ñược phân lập và xác ñịnh từ
ngày 16 tháng 2 ñến ngày 19 tháng 9 năm 2011 thuộc các clade sau: Clade 1.1,
Clade 2.2.1, Clade 2.2.1.1, Clade 2.2.2, Clade 2.3.2.1, Clade 2.3.4, Clade 2.3.4.2
(WHO- www.who.int/csr/disease/avian_influenza/
uidelines/ 011_09_h5_h9_
accinevirusupdate.pdf). Tuy nhiên, cho ñến nay, các chủng virus cúm H5N1 nhiễm
sang người chỉ tìm thấy ở 4 clade: clade 1, clade 2.1, clade 2.2, and clade 2.3.4
(Webster RG and Govorkova EA, 2006).
Vụ ñại dịch cúm H1N1 xuất hiện vào mùa xuân năm 2009 làm cho
hàng trăm ngàn người mắc trên toàn thế giới (Qiu J, 2009; Stone R, 2009).
Người ta sợ rằng nếu cứ tồn tại ñồng thời hai phân type (subtype) cúm
H5N1 ñộc lực cao và H1N1 ñại dịch có khả năng lây truyền cao từ người
sang người thì nguy cơ tạo ra một chủng tái tổ hợp vừa có ñộc lực cao vừa
có khả năng lây truyền từ người sang người là một hiểm họa ñối với nhân
loại (Huang YH, 2009).
1.1.2. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng
12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau ñó ñã nhanh chóng lan tới hầu hết các
Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam ðịnh, ðồng Tháp, Hải Phòng, Bắc
Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên,
Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ ñược khống chế hoàn toàn vào 8/2007.
Dịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng
3/2008. Cho ñến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản ñã ñược
khống chế trên toàn quốc (
).
Năm 2009, cả nước ñã có 129 ổ dịch tại 71 xã, phường, thị trấn của 35 9huyện, thị xã thuộc 18 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và
tiêu huỷ là 112.847 con.
Năm 2010, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 62 xã, phường của 36 huyện,
quận thuộc 23 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là
75.769 con, trong ñó gà là 21.938 con (chiếm 28,95 %), vịt là 52.809 con
(chiếm 69,7 %) và ngan là 1022 con (chiếm 1,34%).
Năm 2011, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 82 xã, 43 huyện, quận thuộc
22 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 110.311 con gia cầm trong
ñó có 39,126 con gà, 70,020 con vịt và 1.165 ngan con tổng số gia cầm chết
và tiêu hủy là 151.356 con gia cầm.
Từ ñầu năm 2012 ñến nay, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 296 xã, 121
huyện, quận thuộc 32 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu
hủy là 616.109 con gia cầm trong ñó 117.946 con gà (chiếm 19,14%),
479.859 con vịt (chiếm 77,89%) và 18.304 con ngan (chiếm 2,97%).
()
Bảng 1.2. Tổng hợp tình hình bệnh cúm gia cầm trong 5 năm (2008-2012)
Năm
Qua 5 năm từ 2008 – 2012, trung bình mỗi năm có khoảng 118 xã tại
58 huyện thuộc 25 tỉnh có dịch. Số gia cầm bệnh chết tiêu hủy là hơn 212
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
10
ngàn con, chủ yếu là vịt chiếm 72,30%, gà chiếm 25,03% và ngan là 2,67%.
Như vậy, bình quân mỗi năm, mỗi tỉnh có dịch có khoảng 5 xã có dịch và tiêu
hủy khoảng 8.500 con gia cầm bệnh.
Hình 1.1: So sánh diện dịch cúm qua các năm
(Cục Thú y, 2012)
Từ năm 2008 ñến 2011, số xã, huyện, tỉnh có ổ dịch là tương ñương
nhau, tuy nhiên năm 2012, số huyện có dịch tăng lên gấp 2 lần và số xã có
dịch tăng lên gấp 3 lần so với những năm trước ñó.
Hình 1.2: Số lượng các ổ dịch xuất hiện trung bình trong 1 năm
chia theo các tháng (Cục Thú y, 2012) 11Như vậy, các tháng mùa xuân (tháng 1 ñến tháng 3) và mùa hè (tháng
7, tháng 8) là cao ñiểm xuất hiện nhiều ổ dịch cúm gia cầm.
Hình 1.3: So sánh mức ñộ dịch cúm qua các năm
(Cục Thú y, 2012)
theo một cơ chế bọc gói rất kỹ lưỡng. Do thông tin di truyền chứa trong các
sợi RNA kích thước nhỏ nên ít xảy ra sự sai lệch thông tin. Nếu một phân tử
bị hư hỏng thì cũng không ảnh hưởng ñến quá trình nhân lên của virus.
Genome của virus cúm A có chiều dài tổng số khoảng 13500
nucleotide, gồm 8 phân ñoạn mã hoá cho 8 protein: Phân ñoạn 1 – 3 mã hoá
cho các protein không cấu trúc (enzyme polymerase – protein sớm phục vụ
cho sao chép nucleic) gồm PB1 (87 kDa), PB2 (84 kDa) và PA (83 kDa);
phân ñoạn 4 mã hoá cho hemaglutinin (HA) (protein bề mặt gắn vào thụ thể tế
bào, gây ngưng kết hồng cầu) (63 kDa khi chưa ñược glycosyl hoá và 77 kDa
nếu ñược glycosyl hoá); phân ñoạn 5 mã hoá cho nucleoprotein (NP) (protein
muộn ñóng vai trò cấu trúc dưới ñơn vị nucleocapsid) (56 kDa); phân ñoạn 6
mã hoá cho enzyme neuraminidase (NA); phân ñoạn 7 mã hoá cho protein
ñệm (M) (matrix protein), gồm 2 tiểu phần M1 (28 kDa) và M2 (11 kDa);
phân ñoạn 8 mã hoá cho protein không cấu trúc (NS) (non – structural
protein) với chức năng chưa rõ, gồm 2 tiểu phần NS1 (27 kDa) và NS2 (14
kDa) (Murphy, Webster, 1996; Luong, Palese, 1992).
Axit nucleic và protein của virus sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung
quanh một trục tạo nên câu trúc ñối xứng xoắn hình cầu (ñường kính 89 – 120
nm) hoặc hình sợi kéo dài (tới vài µm) của virion. Một hạt virion có trọng
lượng phân tử khoảng 250 triệu Da. Nucleocapsid ñược bao bọc bởi màng 13protein nền M1; phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh
chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn ñịnh cấu trúc của virus. Lớp vỏ
ngoài vủa virus còn có các glycoprotein (protein ñã ñược glycosyl hoá).
Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm ñã ñược ñặc
biệt hoá ñể gắn protein màng của virus vào, gồm: protein M2 ñâm xuyên và
xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ. Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình
thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng chung
là giảm hoạt ñộng, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu. Trường hợp nặng có biểu
hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật
hoặc ở tư thế không bình thường. Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng
một lúc hoặc riêng rẽ (Lê Văn Năm, 2005).
Tuy nhiên, virus cúm A ñặc biệt là chủng virus A/H5N1 hiện ñang lưu
hành có thể xâm nhiễm gây bệnh ở các loài ñộng vật có vú khác như hổ, mèo
ngựa, lợn và người (Murphy, Webster, 1996; Alexander, 2007). Bệnh lây
truyền nhanh chóng từ cơ thể bệnh sang cơ thể khỏe mạnh bằng ñường hô hấp
thông qua các hạt aerosol có chứa virus trong không khí và/hoặc qua ñường
tiêu hóa do tiếp xúc trực tiếp với các bề mặt (không khí, ñất, nước, phương
tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi bị ô nhiễm (dịch bài xuất, xác vật bệnh,
chất thải) của cơ thể bệnh (Alexander, 2007; Lê Thanh Hòa, 2004).
ðối với người, sau khi nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 1 ñến 5 ngày trung
bình là khoảng 3 ngày. Lúc ñầu bệnh nhân sốt cao 39
o
C và kéo dài từ 1 ñến 3
ngày, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho, sổ mũi nhức ñầu
khủng khiếp, có thể tiến tới khó thở rồi nghẹt thở, kèm theo các rối loạn về
thính giác và thị giác. ðặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỉ lệ tử vong rất
cao cả ở gia cầm và trên người, có người có thể nhiễm cả ñường hô hấp trên
và dưới (Claas et al., 1998). Trong trường hợp không xảy ra những biến
chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong 15vòng một tuần. Tuy nhiên, nếu trường hợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể trở
HA trên bề mặt màng tế bào ñích. Vùng nối giữa HA
1
và HA
2
gồm một số
amino acid mang tính kiềm. ðây chính là ñiểm cắt của protein HA (HA
cleavage site) dưới tác dụng của enzyme protease và trình tự amino acid tại
vùng này có vai trò quyết ñịnh ñộc lực của virus (Bosch et al., 1979;
Gambotto et al., 2008). HA có khối lượng phân tử khoảng 63.10
3
Da (nếu
Copyright: Tài liệu đại học ©