VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------*_*----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm
nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5”
--------------------------------------------

Giáo viên hướng dẫn : Ts.Hồ Tuyên
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Diệu Linh
Lớp

: 1302

Hà Nội-2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------*_*----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm
nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5”
--------------------------------------------

Giáo viên hướng dẫn : Ts.Hồ Tuyên
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Diệu Linh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1 Giới thiệu về nattokinase ......................................................................... 4
1.1.1 Nguồn gốc đặc tính của nattokinase .................................................. 4
1.1.2 Cơ chế hoạt động của nattokinase ..................................................... 7
1.1.3 Ứng dụng của nattokinase ................................................................. 9
1.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase...................................................... 10
1.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase trên Thế giới và tại Việt Nam ......... 11
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới ................................................. 11
1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................. 12
1.3 Giới thiệu về Bacillus Subtilis natto 5 ................................................... 14
1.3.1 Hệ thống phân loại và sự phân bố trong tự nhiên ............................ 14
1.3.2 Đặc điểm hình thái ........................................................................... 15
1.3.3 Đặc điểm sinh hóa............................................................................ 16
1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy ........................................................................... 17
1.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ tới sự sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật .............................................................................................. 18
1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon .......................................................... 18
1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................. 19
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận nattokinase .................... 19
1.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................... 19
1.5.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường ........................................... 20
1.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường ........................................................ 20


B.subtilis natto 5 ....................................................................................... 36
PHẦN 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................... 39

iii


4.1 Kết luận .................................................................................................. 39
4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT

Từ viết tắt

Tên đầy đủ

1

AA

Amino acid

2

ACE


Huyết áp tâm thu

8

HATTr

Huyết áp tâm trương

9

LDL

Low-density lipoprotein

10

MT

Môi trường

11

NK

Nattokinase

12

PAI-1


Vi sinh vật

18

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc điểm của nattokinase.................................................................. 6
Bảng 1.2 Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis .......................................... 17
Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ...... 22
Bảng 2.2 Thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu ............................... 24
Bảng 2.3 Thành phần nguồn carbon và nitơ của môi trường MT2 ................ 25

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Natto truyền thống Nhật Bản............................................................. 5
Hình 1.2 Mô phỏng cấu trúc không gian của nattokinase. ............................... 5
Hình 1.3 Huyết khối được hình thành thông qua các nút tiểu cầu. .................. 7
Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý của nattokinase trên fibrin. .............................. 8
Hình 1.5 Mô phỏng hệ thống phân loại của Bacillus subtilis natto 5. ........... 14
Hình 1.6 Hình thái của Bacillus subtilis. ........................................................ 16
Hình 3.1 Ảnh hưởng của các nguồn carbon trong môi trường lên men đến


. Huyết khối là hiện tượng máu

đông trong các động mạch hay tĩnh mạch nằm bên trong cơ thể. Cục huyết
khối là sản phẩm cuối cùng của quá trình đông máu. Bình thường nó có tác
dụng cầm máu trong các trường hợp chảy máu do tổn thương mạch máu (đứt
rách). Khi quá trình đông máu xảy ra trong mạch máu không bị đứt rách thì
được gọi là chứng huyết khối bệnh lý và có thể dẫn tới các bệnh tim mạch
như: nhồi máu cơ tim, tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ…và nguy hiểm hơn
là dẫn đến tử vong đột ngột.
Theo WHO mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do mắc phải
các bệnh tim mạch và dự đoán đến 2020 con số này có thể đạt tới 25 triệu
người, mà nguyên nhân là hậu quả của các cục máu đông (huyết khối). Theo
ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỉ USD
[12]

. Các loại thuốc làm tan huyết khối như Alteplase, Streptokinase,

Urokinase… có hiệu lực tức thì sau khi tiêm vào tĩnh mạch. Tuy nhiên hiệu
lực hoạt động sinh học của các loại thuốc này chỉ là tạm thời, tồn tại không
lâu sau khi tiêm, giá cao mà chỉ tác động vào triệu chứng, không chữa được
nguyên căn của bệnh, đồng thời cũng có nguy cơ biến chứng gây xuất huyết.
Trong khi đó nattokinase được coi như một thực phẩm chức năng hỗ trợ làm
tan huyết khối sở hữu nhiều ưu điểm như an toàn, chi phí thấp dễ sử dụng
kèm theo đó là khả năng ngăn ngừa được bệnh.

1


Fibrin là protein dạng sợi không tan được hình thành do chuyển hóa của

Chungkook- Jang và Bacillus sp. DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc

[16]

; hay

B.natto từ Natto, Nhật Bản [17].
Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng
chứa nattokinase dưới dạng viên nhộng nhập khẩu từ Nhật Bản, Hoa Kỳ như
Nattospes (3000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g),
Dosaka (300 FU/g)... với đơn giá rất cao (trên 10 triệu đồng/kg). Dạng thực
phẩm truyền thống của Nhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng không được
dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khó ăn, không phù hợp với khẩu vị
người Việt Nam, hoạt tính nattokinase cũng thấp [1].
Phòng Công nghệ Lên men, viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn lâm
Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tuyển chọn và nghiên cứu thành công
2


điều kiện ban đầu thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase
của chủng B.subtilis natto 5 lần lượt là: pH 7,5; nhiệt độ 37oC; tỉ lệ giống 5%;
độ thông khí 25%. Ở thời điểm hoạt tính enzyme cao nhất theo phương pháp
Astrup và Mullertz (1952) hoạt tính protease đạt 2700 U/ml.
Tuy nhiên, để thu hồi được tối đa lượng enzyme nattokinase và ứng dụng
vào làm chế phẩm phục vụ cho con người lại là một thách thức không nhỏ đối
với các nhà nghiên cứu. Chế độ lên men, điều kiện thu nhận enzyme hay cách
thức tạo chế phẩm đều là những công đoạn có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu
suất thu hồi và hoạt tính của enzyme. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu điều kiện thu
hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto 5” được chúng tôi quan
tâm và đi sâu nghiên cứu.

mạch máu [17]. Cũng có một số tài liệu cho rằng món ăn này được du nhập từ
Trung Hoa vào Nhật Bản với cái tên tan-shih.
Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của natto là tiến sĩ
K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông
về sự lên men của natto vào năm 1894

[39]

. Đến năm 1980, Hiroyuki Sumi,

nhà nghiên cứu tại Đại học Chicago qua nhiều năm nghiên cứu, thí nghiệm
trên 173 mẫu thực phẩm khác nhau, ông đã thành công khi phát hiện ra một
enzyme có hoạt tính cực kỳ mạnh mẽ giúp làm tan cục máu đông. Ông đặt tên
cho nó là “nattokinase”, nghĩa là “enzyme có trong natto” [20].
Trong quá trình lên men natto sẽ hình thành chất nhầy là chất gây liên
kết cho đậu. Trong các phương pháp truyền thống, người ta lên men đậu
tương từ vi khuẩn trên rơm rạ (hình 1.1). Trong quá trình sản xuất hiện đại,
4


các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên đậu tương, vì vậy mà việc sử dụng
rơm rạ là không còn cần thiết [21].

Hình 1.1 Natto truyền thống Nhật Bản
Nattokinase là một enzyme tiêu protein thuộc nhóm Subtilisin, có trọng
lượng phân tử 27.728 Da, gồm 275 AA [39], hoạt động ở pH từ 7-10, nhiệt độ
từ 30-70 °C, có trọng lương phân tử từ 27,7 – 44 kDa, điểm đẳng điện (pI)
8,0. Cơ chế hoạt động của nattokinase là trực tiếp cắt fibrin trong huyết khối
và gián tiếp bằng cách hoạt hóa sự sản xuất urokinase và plasmin trong mô.
Nattokinase làm giảm fibrin trực tiếp, trong các xét nghiệm ly giải huyết khối

Cấu
trúc
Pr

Trạng thái trình tự
Quá trình hình thành
trình tự
Sự tồn tại Pr

86092
Bacteria> Fimicutes> Bacillales>
Bacillaceae> Bacillus
275 AA
Hoàn thành
Các trình tự hiển thị là một quá trình hình
thành từ tự nhiên
Bằng chứng cấp độ Pr

Chú thích chung
Chức năng

Subtilisin là một protease ngoại bào, nó xúc
tác cho quá trình thủy phân protein và
peptide amid, Subtilisin NAT cũng có hoạt
tính tiêu sợi huyết

Hoạt động xúc tác

Thủy phân protein với nồng độ đặc hiệu
rộng với peptide và một lượng dư trong thủy

của tụ huyết khối còn phụ thuộc vào một số yếu tố khác như mức độ tổn
thương mạch máu, áp lực bao sức, hiện diện của các thuốc kháng huyết khối
[24]

.

Hình 1.3 Huyết khối được hình thành thông qua các nút tiểu cầu.
Huyết khối phát triển và được duy trì thông qua sự tích tụ dần dần của
nhiều sợi fibrin hoặc lớp niêm mạc của các mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu
sẽ tập trung vào các vùng bị thương đó để tạo thành nút tiểu cầu (hình 1.3).
Các yếu tố đông máu trong cơ thể được kích hoạt, mạng lưới fibrin được hình
thành và tạo nên cục máu đông. Nhờ tác dụng phân giải sợi fibrin, nattokinase
đã ngăn chặn sự ngưng kết của các tiểu cầu giúp làm tan các cục máu đông.
Vì vậy vai trò của nattokinase là làm tan sợi huyết fibrin. Khi fibrin bị phân
hủy thì sự đông máu trở nên khó khăn.

7


Trong quá trình làm tan huyết khối, prokinase được chuyển đổi thành
urokinase, một quá trình được tăng cường bởi nattokinase. Phá vỡ fibrin thành
các sản phẩm phân hủy cũng được nâng cao, khi lượng fibrin thấp tác dụng
chuyển hóa plasminogen thành plasmin thấp. Nattokinase tăng plasminogen tế
bào và chất hoạt hóa, tăng cường phân hủy fibrin và giảm thời gian đông máu.
Qua giảm sự hình thành huyết khối, nattokinase làm chậm lại tiến triển của
hình thành các mảng bám và ít gây tổn thương động mạch.

Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý của nattokinase trên fibrin [42].
Cơ chế làm tan huyết khối của nattokinase: Thành phần chính của huyết
khối là các sợi fibrin. Plasmin là enzyme nội sinh duy nhất trong cơ thể có tác

viêm màng dạ con, u xơ tử cung, co thắt cơ, vô sinh, ung thư và bệnh tê
phù do thiếu vitamin B1 [24].
Theo một nghiên cứu, ta có thể sử dụng enzyme này thay thế aspirin với
tác dụng xúc tác cao hơn một số enzyme khác. Enzyme này tác động lên hệ
tuần hoàn, làm quá trình lưu thông máu diễn ra dễ dàng hơn, tránh hiện tượng
tắc nghẽn mạch máu [25]. Đồng thời, enzyme này làm giảm nồng độ fibrinogen
trong huyết tương [26]. Các nhà khoa học đã nghiên cứu lâm sàng chứng minh
khả năng của nattokinase làm giảm cục máu đông sau 8 giờ uống một liều
Natto (khoảng 6000 đơn vị phân giải sợi fibrin) và euglobulin thể hiện khả
năng làm giảm cục máu đông tăng một cách đáng kể sau 12 giờ uống [1]. Một
bệnh nhân đã sử dụng kết hợp aspirin và 400 mg nattokinase trong 7 ngày liên
tục để ngăn chặn đột quỵ, xuất huyết tiểu não [28].
Song song với tác dụng làm tan huyết khối, nattokinase còn góp phần
làm giảm áp lực của máu lên thành mạch. Điều này đã được chứng minh
trong một nghiên cứu của Juan, 2010. Nattokinase có chứa ACE ức chế hoạt
động của chất làm đông máu, đồng thời làm giảm huyết áp tâm thu 11% và
tâm trương 9,7%

[29]

. Ngoài ra, nattokinase có thể ngăn chặn hiện tượng hẹp

động mạch chủ và xơ vữa động mạch do khả năng ức chế cục máu đông. Do
đó, nattokinase hứa hẹn tiềm năng chữa trị các bệnh tim mạch, đột quỵ, xơ
vữa động mạch, huyết áp cao…[23]

9


Một nghiên cứu năm 2009 cho thấy nattokinase có thể có hiệu quả

biểu hiện có hoạt tính và tiết ngoại bào [30,31,32].

10


Nattokinase được tinh sạch từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis natto B-12
(phân lập được từ natto) có độ tinh sạch gấp 51,6 lần và hiệu suất thu hồi
43,2% so với hoạt tính ban đầu, trọng lượng phân tử 29 kDa, hoạt động ở pH
và nhiệt độ tối ưu tương ứng là 8,0 và 40°C, enzyme được hoạt hóa bởi ion
Zn2+ nhưng bị ức chế bởi ion Fe3+ và Al3+

[33]

. Trong môi trường lỏng chứa

peptone từ đậu nành 8,28 g/l, CaCl2 0,64 g/l và cao nấm men 0,74 g/l, B.natto
NLSSE sinh tổng hợp nattokinase đạt 1300 UI/ml

[34]

. B.subtilis LD-8 sinh

tổng hợp nattokinase cao trong môi trường lỏng chứa bột gạo 5%, bột đậu
nành 4%, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,01% (w/w), pH 7 và tỷ lệ giống 5%, sau
72 giờ nuôi cấy, hoạt nattokinase đạt được là 4220 U/ml

[35]

. B.subtilis được


giảm độ nhầy của máu thông qua các nghiên cứu in vitro. Các nhà khoa học
này cũng đã tìm ra tác dụng làm giảm lipid máu của nattokinase khi kết hợp
với gạo nấm men đỏ đối với những người bị tăng lipid máu.
Tại hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/43/5/2006), Masafumi Kitakaze đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ
rệt các chứng Mỡ (Triglyceride và Cholesterols) trong máu cao qua nghiên
cứu chung của 4 cơ quan y tế Nhật Bản, kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện
nếp sinh hoạt và tiêu thụ Natto thiên nhiên trước nguy cơ béo phì do “thừa”
dinh dưỡng và các chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày
càng tăng khắp nơi trên thế giới.
Theo kết quả nghiên cứu của 3 cơ quan y tế: Đại học bang Oklahoma
(Mỹ), JCR Pharmaceuticals (Nhật Bản) và Trường Y khoa Miyazaki, phối
hợp thử nghiệm trên cơ thể người (in vivo) bằng cách cho ăn natto 200g/ngày
và đã kiểm chứng được những hiệu ứng kể trên, đặc biệt phát hiện lượng
plasmin nội sinh giảm sụt ở người cao tuổi không đủ để làm tan huyết khối,
gây vón cục trong động mạch, thì hiệu quả của Natto càng rõ rệt.
1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Trong nước đã có một số nghiên cứu sản xuất thuốc làm tan huyết khối
để điều trị các chứng tắc nghẽn mạch (thrombosis) như: Nhóm nghiên cứu
của Lý Thị Bích Thủy (Viện Công nghệ sinh học) đã nghiên cứu và sản xuất
12


thành công chế phẩm Lumbrokinase (sản phẩm tách từ giun đất Nhật Bản có
tên khoa học là Lumbricus rubellus và từ giun quế Việt Nam có tên khoa học
là Perionyx escavatus) có tác dụng làm tan cục máu đông làm nghẽn động
mạch tạo ra vết thương bị tụ máu [2].
Nông Văn Hải và nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học đã
nghiên cứu tạo thể hoạt hóa plasminogen dạng mô (tPA) tái tổ hợp trong vi
khuẩn E.coli. Vũ Hồng Diệp và cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu sản xuất
streptokinase tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli BL21 [3]. Khuôn khổ đề tài KC

với liều 2010 FU/ngày trong 8 tuần liên tục, kết quả cho thấy giảm đồng thời
13


HATT và HATTr có ý nghĩa thống kê so với placebo ở người tiền THA và
THA độ 1, giảm cứng động mạch thông qua hiệu quả làm giảm PWV và PP
nhiều hơn có ý nghĩa thống kê so với placebo, có hiệu quả tốt lên một số
thành phần lipid máu như làm giảm cholesterol toàn phần và LDLCholesterol.
Trên thị trường Việt Nam đã có một số sản phẩm nattokinase dưới dạng
thực phẩm chức năng được sản xuất trong nước kế thừa các thành tựu khoa
học trong và ngoài nước nhưng chưa phổ biến và giá thành khá cao. Do đó,
việc nghiên cứu sâu về enzyme này là cần thiết và cần được chú trọng hơn.

1.3 Giới thiệu về Bacillus Subtilis natto 5
1.3.1 Hệ thống phân loại và sự phân bố trong tự nhiên
Theo nghiên cứu, B.subtilis natto 5 nằm trong hệ thống phân loại như
sau:
Giới: Prokaryota

Ngành: Protophyta

Lớp: Schyzomycetales

Bộ: Eubacteriales

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis subsp. Natto [12]

1.6). Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giác mạc, lớp bề mặt có tính chất
protein, một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng
tế bào. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông. Khuẩn lạc khô hoặc
nhớt, không màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành màng
mịn lan trên bề mặt thạch. Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu
15


trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống
chịu điều kiện khắc nghiệt cao.

Hình 1.6 Hình thái của Bacillus subtilis [16].
Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 –
0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần
lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH
thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là
đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis [6].
Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid,
có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia
phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục
năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus
subtilis trong 200 – 300 năm [40].
1.3.3 Đặc điểm sinh hóa
Bacillus subtilis lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose,
maltose, saccharose, xylose và arabinose.
Thử nghiệm indol là âm tính (-), các phản ứng nitrate, amylase, MR là
dương tính (+), có khả năng di động và hiếu khí (bảng 1.2).

16