i

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy, ThS.
Khúc Thị An, Ths. Nguyễn Kim Cúc, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh
nghiệm và động viên tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Cô Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm, đã giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện cho tôi có thể thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm thực hành một cách tốt
nhất.
Xin cảm ơn các quý thầy, cô trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận
tình giúp đỡ, giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập, để tôi có thể
tích lũy được kiến thức để thực hiện được đồ án, và xa hơn là phục vụ cho những
chặng đường tiếp theo sau khi rời ghế nhà trường
Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp, 50Sh, 50MT, 50 TP2, các anh, chị cao
học, anh Nguyên, anh Đảm, chị Xuân, và tất cả các anh chị, các bạn, cùng thực hiện đề
tài với tôi tại phòng thí nghiệm, đã cùng chia sẻ bao nhiêu buồn vui của việc làm đề tài
và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.
Cuối cùng, cho tôi được gửi lời cảm ơn đến ba mẹ tôi, đã hỗ trợ tôi về mặt tinh
thần, cho tôi lời khuyên cũng như san sẻ gánh nặng cho tôi trong 4 năm học và thực
hiện đề tài.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn vì sự quý báu đó ! ii LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC HÌNH v

2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 20
a/ Bố trí thí nghiệm thay thế nguồn cacbon 20
b/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ thay thế 21
c/ Bố trí thí nghiệm khảo sát giá trị pH thích hợp 21
d/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ muối thích hợp 22
e/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 22
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện lên men trong hệ thống lên men tự động
BIO FLO 110 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1. Xác định khả năng sinh trưởng 23
3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn 25
3.3. Mô tả đặc điểm hình thái 27
3.4. Định danh chủng B 3.7.1 31
3.5. Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp 33
3.5.1. Khảo sát thay thế nguồn cacbon 33
3.5.2. Khảo sát nguồn nitơ thay thế 33
3.5.3. Khảo sát pH thích hợp 34
3.5.4. Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp 34
3.5.5. Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 36
iv

3.6. Khảo sát lên men của chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39
Tài liệu tham khảo 40

v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh đại diện Bacillus 1
Hình1.2 . Bào tử Bacillus 1

Hình 3.5.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 37
Hình 3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.1 38
Hình 3.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.4 38
Hình 3.5.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.1 39
Hình 3.5.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.2 39
Hình 3.5.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng của 2 chủng B 3.7.4 và B
3.10.2 40
Hình 3.5.9. Khảo sát lên men chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 40
vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kích thước vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio
29
Bảng 3.2. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Bacillus sp. B3.7.1 với các
trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 35 viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ
1 FAO
Food and Agriculture Organization – Tổ chức Nông
Lương Liên Hợp Quốc
2 WHO World Health Organizatin – Tổ chức Y tế thế giới
3 Ct Công thức tính lượng dịch hoạt hóa
4 OD Optical Density (Mật độ quang)
5 TSB Trypticase Soy Broth
6 LB Luria Broth

Vì lý do trên, trong khuôn khổ của một luận án tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện
đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và lên men vi khuẩn Bacillus thu sinh khối
nhằm sản xuất chế phẩm probiotic thủy sản” là cấp thiết.
Mục tiêu của đề tài: Khảo sát điều kiện nuôi cấy và thu sinh khối của các chủng
Bacillus có khả năng kháng khuẩn, mô tả, định danh các chủng đó, ứng dụng vào sản
xuất chế phẩm probiotic, nhằm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.
Nội dung thực hiện:
- Xác định đặc điểm sinh trưởng của các chủng Bacillus
x

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio
gây bệnh
- Xác định đặc điểm hình thái của các chủng có hoạt tính probiotic
- Định danh các chủng có hoạt tính probiotic
- Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng có hoạt tính probiotic
- Khảo sát điều kiện lên men các chủng có hoạt tính trong hệ thống lên men
BIO FLO 110 Sinh viên thực hiện
1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Bacillus
1.1.1. Đặc điểm chung về Bacillus
Bacillus là vi khuẩn hình que, hay trực khuẩn, thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+),
hiếu khí bắt buộc hoặc kị khí tùy tiện, dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, dương
tính với catalase, di động bằng chu mao. Do có khả năng hình thành nội bào tử nên
Bacillus có khả năng kháng nhiệt, kháng điều kiện khô hạn, chịu mặn, chịu chất khử và
các phân tử có hại khác.

khuẩn Bacillus
Hình 1.
2
.
Bào t
ử

Bacillus

2

da giầy, xử lý môi trường, trong chăn nuôi thủy sản….Chẳng hạn Bacillus subtilis
được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong sản xuất enzyme ngoại bào (protease),
ứng dụng dùng để thủy phân protein của thịt, cá, được sử dụng nhiều trong các sản
phẩm nước mắm hay các thực phẩm đóng hộp, hoặc dùng trong tách chiết phá vỡ mô
cơ tế bào.
Vào năm 1947 Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg
(Phadarate và cộng sự,1997), tìm thấy các enzyme thuộc nhóm subtilisin, khi nuôi cấy
chủng B. licheniformis và được đặt tên là subtilisin Carlsberg. Subtilisin, là một nhóm
enzyme protease kiềm (serine protease). Enzyme này có tính đặc hiệu rộng, thủy phân
nhiều loại liên kết peptide, các liên kết ester, nhất là những liên kết được tạo thành từ
các amino acid thơm, cũng như tất cả các serine protease (Govind và cộng sự, 1981),
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp các chất tẩy rửa, thuộc da, và ngay cả
trong y học, do subtilisin có khả năng hoạt động trong phổ pH rộng và nhiệt độ cao.
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại
chất tẩy rửa, bột giặt, chất làm sạch kính, kem đánh răng, hoặc răng giả. Các enzyme
protease thích hợp sẽ được bổ sung vào chất tẩy thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng,
dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do con người tiết ra. Chất tẩy
rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất năm 1956 với tên BIO-40. Đến
năm 1963, Novo industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX

ngày nay.
1.2. Tổng quan về Probiotic trong nuôi trồng thủy sản
1.2.1. Khái niệm probiotic
Theo nghĩa gốc, từ “probiotics” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là
“Cho cuộc sống”. Tuy nhiên, theo thời gian định nghĩa này cũng đã phát triển. LiLy
và Stillwell (1965) đã mô tả “Probiotics” như một hỗn hợp được tạo thành bởi một
động vật nguyên sinh có khả năng thúc đẩy sự phát triển của sinh vật khác. Sau đó định
nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 1970, đó là “ probiotics”
cũng bao gồm cả dịch chiết tế bào có khả năng thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật
(Gomes và Malcata, 1999). Năm 1974 Parker đã áp dụng khái niệm này khi bổ sung
vào trong thức ăn của gia súc và nhận thấy ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ khi sử
dụng nó thông qua việc góp phần vào sự cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của gia súc.
Vì vậy, khái niệm “probiotics” được sử dụng để mô tả “cơ quan và chất góp phần tạo
ra khả năng cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”
Định nghĩa chung này sau đó được định nghĩa chính xác hơn bởi Fuller (1989),
định nghĩa Probiotics như “một chất bổ trợ cho thức ăn chứa vi sinh vật sống mang lại
những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột
của chúng”.
Năm 2001, chuyên gia của FAO và WHO đã định nghĩa về probiotics “là những
cơ thể vi sinh vật sống, khi được đưa vào cơ thể vật chủ với một lượng nhất định sẽ
đem lại lợi ích về sức khỏe cho vật chủ” và đến thời điểm hiện tại, đây vẫn là định
nghĩa được mọi người chấp nhận và sử dụng nhiều nhất.
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu Probiotic trong nuôi trồng thủy sản
a/ Lịch sử nghiên cứu về probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser
(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và tìm thấy trong phân của những đứa trẻ
mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ
khỏe mạnh.
4


(2011); Lê Thị Bích Phượng và cộng sự, (2003); Lê Tấn Hưng và cộng sự, (2003); Võ
Thị Hạnh và cộng sự, )2004) nghiên cứu và thử nghiệm.
 Những nhóm vi khuẩn probiotic có tềm năng được sử dụng trong sản xuất
chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản là: Lactobacillus, Pseudomonas,
Bacillus, Micrococcus, Moraxella…. Thành phần vi sinh trong NTTS gồm những sản
phẩm chính là sử dụng các nhóm vi sinh vật sống như: : Lactobacillus, Pseudomonas,
Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter…
5

 Các nghiên cứu của Ts.Nguyễn Văn Duy và cộng sự, (2011) cho thấy, các
chủng vi sinh vật thuộc Bacillus có khả năng sinh trưởng và phát triển cạnh tranh và
kháng với các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên đối tượng tôm sú.
 Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2000) tìm hiểu tác
dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu
trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m
3
. Theo như thí nghiệm, so sánh giữa không
sử dụng và sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì việc sử dụng hàng ngày
cho kết quả tốt nhất. Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột ở ngày thứ 18,
mật độ vi khuẩn Vibrio tổng số cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng luôn giữ được
ổn định.
 Chế phẩm Biochie dùng để xử lý nước nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại
Đồ Sơn, Hải phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt, tôm phát triển đồng đều, tăng
trưởng nhanh, tỉ lệ sống cao, giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi (Võ Thị Thứ và
cộng sự, 2005).
- Các nghiên cứu ngoài nước
 Theo Nair và cộng sự, (1985) vi khuẩn lactic và một số nhóm vi khuẩn có
khả năng tiết ra các chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và
Vibrio parahaemolyticus.
 Theo nghiên cứu của Foster và cộng sự (1991) sử dụng vi khuẩn phân lập

phải có những khả năng như sau:
1. Là một sản phẩm sống
2. Không mang mầm bệnh và độc tố
3. Tạo ra các tác dụng có lợi trên vật chủ
4. Có khả năng tồn tại và phát triển trong môi trường ruột của vật chủ
5. Duy trì ổn định và tồn tại lâu dài để được sử dụng sau này trong điều
kiện lưu trữ và điều kiện ngoài hiện trường.
Việc sử dụng vi khuẩn đường ruột có lợi trong thức ăn cho người và động vật
trên cạn đã được biết đến nhiều. Lactobacillus acidophilus được sử dụng phổ biến để
kiểm soát và phòng bệnh do các vi sinh vật mầm bệnh trong ống tiêu hóa của nhiều
động vật trên cạn. Vi khuẩn Lactobacillus rhammosus có trong yaourt giúp tăng khả
năng tiêu hóa và kháng lại vi khuẩn có hại trong đường ruột. Lý thuyết kiểm soát sinh
học đã được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản. Nhiều nhà khoa học đã cố gắng sử
dụng một số loại probiotic trong nuôi trồng thủy sản để điều khiển quần thể vi tảo của
nước trong ao, kiểm soát vi sinh vật gây bệnh, để tăng cường sự phân hủy các hợp chất
hữu cơ dư thừa và cải thiện môi trường ao nuôi.
Ngoài ra, việc sử dụng probiotic có thể gia tăng quần thể các sinh vật làm thức
ăn, cải thiện mức dinh dưỡng của các loài thủy sản nuôi và tăng cường khả năng miễn
dịch của vật nuôi với mầm bệnh. Như vậy, định nghĩa của probiotic đối với nuôi trồng
thủy sản được mở rộng, nó bao gồm cả việc bổ sung vi khuẩn sống vào ao nuôi, những
vi khuẩn có lợi này sẽ cải thiện thành phần vi sinh vật của nước và nền đáy nhằm cải
thiện chất lượng nước. Probiotic được giả định là có khả năng tăng cường và cải thiện
sức khỏe của vật nuôi bằng việc loại trừ các mầm bệnh hoặc hạn chế tối đa tác hại của
mầm bệnh. Vi khuẩn probiotic có thể bám vào bề mặt bên ngoài của vật chủ hay đi vào
bên trong ruột hoặc trực tiếp từ nước hoặc qua thức ăn hay qua những hạt có thể tiêu
hóa được. Hơn nữa, sử dụng probiotic sẽ góp phần làm giảm lượng hóa chất, kháng
sinh trong phòng và trị bệnh cho tôm cá.
Probiotic được gọi dưới tên khác nhau như “Chế phẩm vi sinh”, “Vi khuẩn có
lợi” hoặc “Vi sinh vật hiệu quả”, bao gồm các loại vi khuẩn Lactobacillus,
Actinomycetes, Nitrobacteria, vi khuẩn chuyển hóa đạm, Bifidobacterium, nấm men…

(stress) do môi trường hay do thao tác. Trong nuôi giáp xác, probiotic cũng đóng một
vai trò đáng kể. Garriques và Arevalo (1995) cho rằng việc sử dụng Vibrio
alginolyticus, được phân lập từ nước biển, đã làm tăng tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng
của tôm P. vannamei trong trại giống.
Nogami và Maeda (1992) nghiên cứu một dòng vi khuẩn PM-4, phân lập từ ao
nuôi ghẹ, dòng vi khuẩn này đã giảm số lượng Vibrio ssp. trong nước nuôi và Portunus
trituberculatus và làm tăng năng suất ấu trùng ghẹ. Jiravanichpaisal và Chuaychuwong
(1997) sử dụng Lactobacillus sp. trong nuôi tôm sú (P. monodon) để hạn chế bệnh gây
ra bởi nhóm Vibrio và bệnh đốm trắng. Các tác giả đã xác định được hoạt động ức chế
của Lactobacillus sp. trên nhóm Vibrio, E.coli và Staphylococcus sp.
1.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm trong nuôi
trồng thủy sản.
8

1.3.1. Ở Việt Nam
Các nghiên cứu ở Việt Nam đều sử dụng các chủng của Bacillus và kết hợp với
các chủng khác để làm thức ăn thủy sản. Một trong những cơ chế hoạt động của men vi
sinh là các men có tác dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất
hữu cơ đơn giản (Nguyễn Đình Trung và cộng sự, 2004) vi sinh vật thuộc nhóm
Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ trong ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử
dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muối dinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy
trì độ trong của ao nuôi, khi đạt mật độ lớn, nó sẽ cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của
các động vật nguyên sinh, các vi sinh vật có hại cho thủy sản, đặc biệt là Vibrio có hại,
ngăn cản hạn chế sự phát triển của chúng.
Theo nghiên cứu của các tác giả, Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú,
ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu cơ
trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung 3
loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/mL và 1
đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Kết quả cho ta thấy hầu hết các chỉ tiêu chất
lượng nước của các nghiệm thức đều nằm trong khoảng cho phép.

lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B.subtilis cũng tăng nhanh trong hệ
tiêu hóa của tôm .
Boyd (1996) đã công bố việc thử nghiệm thành công chế phẩm vi sinh gồm các chủng
Bacillus subtilis, Nitrobacter, Pseudomonas, Aerobacter, Cellumonas, và
Rhodopseudomonas. Chế phẩm này làm giảm lượng tảo lam, giảm lượng nitrat, nitrit,
và amoni, photpho hạ, tăng nồng độ oxy hòa ta, tốc độ phân giải các chất hữu cơ tăng
dẫn đến tăng hiệu quả nuôi trồng hải sản.
Foster (1991) đã bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis, và nhận thấy, các enzyme
được làm khô và nghiền nhỏ để phân hủy lượng bùn tích tụ dưới đáy hầm.
Một số nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của probiotic.
Nghiên cứu về sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow
trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng
hoạt động thực bào của bạch cầu.
Nghiên cứu của Rengpipat và cộng sự (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho
rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã
tiết ra các chất làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcázar
(2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống
chế V. harveyi và virus đốm trắng. Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei và cộng sự
(2009) trộn B.subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ
lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B.subtilis cũng tăng nhanh trong hệ
tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm.
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn có thể tiết vào môi trường chất có
tính sát khuẩn cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường. nghiên
cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của Bacillus subtilis
được ghi nhận hơn 50 năm qua. Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn
Bacillus subtilis có khả năng tiết ra hơn 20 loại chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau,
10

bao gồm: subtilis, ericin, mersacidin, sublancin, subtilosin, surfactin, iturin,
bacillibactin, bacillmycin, mycosubtilin, fengycin, plipastatin, corynebactin, bacilysin,


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Các chủng Bacillus, và Vibrio được lấy từ bộ sưu tập chủng của Phòng thí
nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nha Trang được bảo quản trong 20%
glycerol ở – 70
0
C. Các chủng Bacillus bao gồm 4 chủng B 3.7.1, B 3.7.4, B 3.10.1,
B3.10.2, và 2 chủng Vibrio đối kháng là V1.1 và V3.3.
2.1.2. Môi trường hóa chất chuyên dụng
Môi trường nuôi vi khuẩn
Môi trường TSB
Casein peptone 17 g
Soya peptone 3 g
NaCl 5 g
K
2
HPO
4
4 g
Glucose 2,5 g
Bile Salts 1,5 g
pH 7,4
Môi trường TSA là môi trường TSB bổ sung thêm từ 15 g- 20 g agar.
Môi trường LB
Bacto-tryptone 10 g
12

Yeast extract 5 g

4
0,25 g
13

Bột sắn 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường peptone
Peptone 2 g
NaCl 2 g
K
2
HPO
4
0,25 g
Glucose 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường rỉ đường
Peptone 2 g
NaCl 2 g
K
2
HPO
4
0,25 g
Rỉ đường 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường amoni sulfat
Amoni sulfat 2 g
NaCl 2 g
K

Nước cất 80 ml
Hòa tan 2 g Crystal violet với 20 ml rượu ethylic để được dung dịch A
0.8 g Ammol oxalate trộn với 80 ml nước cất được dung dịch B
Trộn 2 dung dịch trên lại với nhau ta được dung dịch thuốc nhuộm Violet, bảo
quản trong lọ sẫm màu.
 Dung dịch Iodine
Iodine 1 g
KI 2 g
Nước cất 300 ml
Hòa tan 1 g Iodine trong 3 ~ 5 ml nước cất, thêm 2 g KI. khuấy cho tan
hoàn toàn, thêm nước cất cho đủ 300 ml . Bảo quản trong lọ sẫm màu.
 Dung dịch Fuchsin
Dung dịch A:
- Fuchsin 0,3g
- Ethanol 95% 10 ml
Dung dịch B:
- Phenol nóng chảy 5 ml
15

- Nước cất 95 ml
Trộn đều dung dịch A và B, lọc qua giấy lọc thô sau đó bảo quản trong lọ tối
màu.
 Dung dịch Liugon
Iodine (I
2
) 5 g
Postassium iodide( KI) 10 g
Nước cất 85 ml
Hòa tan 5 g I
2