BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Bùi Thị Nhung

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ
BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Bùi Thị Nhung

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ
BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số

: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:


giúp đỡ và hỗ trợ tôi làm thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
 Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) và toàn thể các bạn học viên cao
học khóa 22 đã luôn giúp đỡ, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
 Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân yêu trong gia đình đã
luôn bên cạnh, ủng hộ tôi, là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có
được ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn
Bùi Thị Nhung

2


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ 6
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................................. 7
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 8
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 8
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10
1.1. Khái quát chung về protease .................................................................................... 10
1.1.1. Khái niệm và phân loại ......................................................................................... 10
1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease ......................................................... 13
1.1.3. Enzyme protease kiềm .......................................................................................... 19
1.1.4. Enzyme Nattokinase ............................................................................................. 26
1.2. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn ....... 30

2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase ..................................................... 43
2.3.8. Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM .......... 44
2.3.9. Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét ....................................... 44
2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................... 44
2.3.11. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ............................... 45
2.3.12. Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân ............. 46
2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến .......................... 47
2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry...................................... 49
2.3.15. Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase ........................................................ 50
2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp
protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................. 51
2.3.17. Phương pháp làm natto ....................................................................................... 54
2.3.18. Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men................................... 55
2.3.19. Phương pháp tách chiết enzyme ......................................................................... 56
2.3.20. Phương pháp thu nhận enzyme ........................................................................... 56
2.3.21. Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol58
2.3.22. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 58

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 60
3.1. Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao ........................... 60
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản............................................... 60
3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao.............................................. 61
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi.... 66
3.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 66
3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái .......................................................................... 68
4


3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử ....................... 68
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease


Bào tử

CPE

Chế phẩm enzyme

ĐN & GL

Đậu nành và gạo lức

ĐN

Đậu nành

G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

GL

Gạo lức

KHV

Kính hiển vi


Axit tricloacetic

TN

Thí nghiệm

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

6


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết
peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy
phân này có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn, nhiều enzyme protease còn
có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc
acid amin. Protease là các enzyme công nghiệp quan trọng hàng đầu, chiếm ít nhất một
phần hai tổng sản lượng thị trường enzyme trên toàn thế giới (Rao et al.,1998). Các
enzyme protease chiếm vị trí quan trọng do được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp khác nhau: Chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, gia cầm, trong ngành công
nghiệp dược phẩm, công nghiệp thuộc da, sản xuất các chất tẩy rửa, công nghiệp dệt và
thu hồi bạc từ phim ảnh…

hoạt hóa plasminogen và bất hoạt plasminogen activator inhibitor (Sumi et al, 1987,
Urano et al. 2001)[52]. Các sản phẩm NK ngày nay đang được bán rộng rãi trên thế giới
và sử dụng như một thực phẩm chức năng, hầu như không có phản ứng phụ.
Nguyên liệu để sản xuất NK chủ yếu là đậu nành, ngoài ra có thể sử dụng các sản
phẩm phụ của công nghiệp chế biến thực phẩm như cám mì, cám gạo, trấu, các loại vỏ đậu
(đậu xanh, đậu đỏ..), vỏ tôm. Công đoạn lên men có thể thực hiện bằng lên men bán rắn
hoặc lên men chìm, nhiệt độ lên men từ 30-40oC...Ngoài các chủng Bacillus subtilis phân
lập từ Natto, chúng ta có thể tìm kiếm ở Việt nam nhiều chủng Bacillus sp khác từ các sản
phẩm lên men truyền thống hoặc trong đất, nước của Việt nam. Tất cả những điều kiện
như vậy đều có thể đáp ứng ở Việt nam.
Với những lý do như trên chúng tôi thực hiện đề tài :
“Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có trong Natto Nhật Bản hướng
tới thực phẩm chức năng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ Natto Nhật Bản và xác định một số điều kiện tạo
chế phẩm protease giàu nattokinase
3. Nội dung nghiên cứu
1) Phân lập các mẫu B.subtilis từ Natto của Nhật Bản
2) Chọn lọc khả năng sản xuất protease của một số mẫu phân lập
3) Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của mẫu chọn lọc
4) Phân loại đến loài hai mẫuh Bacillus đã chọn
5) Xác định một số điều kiện lên men sản xuất protease của chủng chọn lọc
6) Nghiên cứu một số đặc tính của protease đã tinh sạch sơ bộ
8


7) Đề xuất quy trình tạo chế phẩm protease giàu nattokinase dạng bột khô
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013
- Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới

10


Hình 1.1. Cơ chế xúc tác của enzyme protease
1.1.1.2.2. Dựa vào hoạt động của pH
Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme protease
được chia thành 3 loại.
- Loại 1: Protease acid: pHopt trong khoảng 2 – 5. Nhóm enzyme này xúc tác cho sự thủy
phân các peptid và protein ở vùng pH acid. Ngoài ra chúng còn có khả năng thủy phân một
số đi – tri peptid do có sự hiện diện của enzyme carboxylpeptidase.
Loại protease này thường được thu nhận từ các loại nấm sợi như: A. niger, A.
awmori, A.saitoi.
- Loại 2: Protease trung tính: pHopt trong khoảng hẹp, từ 6 – 7,5, không bền với nhiệt độ và
mất hoạt tính khi có mặt của protease kiềm, có trung tâm hoạt động là kim loại, chứa nhiều
Zn2+.
Được thu nhận chủ yếu từ các loại nấm sợi như: A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A.
tericola.
- Loại 3: Protease kiềm: pHopt trong khoảng 8 – 11, thường được tổng hợp nhiều bởi vi
khuẩn và nấm men.
Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá nhiều trong những năm gần
đây vì có thể sử dụng chúng như chất phụ gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da,
xử lý chất thải môi trường. Đa số chúng được thu nhận từ chủng Bac.subtilis hay những vi
khuẩn khác.
1.1.1.2.3. Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động
Đây là cách phân loại chi tiết nhất, cách phân loại này dựa trên đặc điểm cấu tạo
trung tâm hoạt động của enzyme nên phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme đó.
Theo cách phân loại này protease được chia thành 4 nhóm.
Nhóm I: Cystein - protease ( EC.3.4.22)
11


nó thiết lập liên kết với carboxyl trong liên kết peptid và sẽ phân tách liên kết này.
- Hoạt động trong vùng pH 6 – 9
- Các tác nhân vô hoạt là các chất có cấu trúc không gian phức tạp như EDTA hay natri
dodecylsulfate.
12


- Nhóm IV: Serine protease ( EC.3.4.21)
- Đại diện cho nhóm này là các enyme có nguồn gốc từ động vật như trypsin,
chymotrypsin, plasmin và thrombin. Một số khác được tổng hợp từ VSV mà đặc biệt là từ
VK và nấm mốc như B.cereus, B.firmus, B.subtilis, Asp.flavus, Asp. oryzae.
- Hai acid amin hình thành trung tâm hoạt động là serine và histidine.
- Khoảng pHopt là 7 – 11
- Các tác nhân làm mất hoạt tính của enzyme thuộc nhóm này là đi – isopropyl
phosphoroflouridate (DFP) hay phenylmethenesulphosphate ( PMSF), coumarin và một số
chất ức chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành, aprotinin, chymostatin.
- Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực nhất là
nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ trung
tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng của nhóm enzyme này so với các nhóm
protease khác.
1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease
1.1.2.1. Cơ chế phản ứng của protease
Việc thủy phân protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng. Hoạt động của chúng
được chia ra làm 2 loại như sau:
- Thủy phân giới hạn: Enzyme thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các liên
kết peptide có trong phân tử protein và tạo thành các peptid phân tử nhỏ.
- Thủy phân không giới hạn: Protein bị thủy phân thành những acid amin
Dưới tác dụng của protease, liên kết peptide -CO-NH- sẽ bị thủy phân tạo thành sản
phẩm là aminoacid và một ít peptide có phân tử nhỏ.
Với 4 nhóm protease được chia theo đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt động sẽ có 4

chất theo cơ chế được trình bày trong hình 1.7

15


Hình 1.6. Các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease
Cơ chế theo hình 1.7 gồm 3 phản ứng:
- Phản ứng 1: Nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với
nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ diện
(tetrahedral complex).
- Phản ứng 2: Ở trạng thái chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển điện tích
lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide đầu N và
hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme mới.
- Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại
và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease.
1.1.2.2. Ứng dụng của enzyme protease[1][11][16]
Ngày nay việc khai thác và sử dụng enzyme đã phát triển thành một nghành công
nghiệp với kỹ thuật hoàn chỉnh đã đem lại nguồn lợi không nhỏ.
Người ta đã tìm ra trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ có 140 enzyme có thể
thương mại được. Năm 1997, thị trường về enzyme đã đạt 150 triệu USD.

16


Trong đó các enzyme thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất,
chiếm 59% lượng enzyme được ứng dụng. Đặc biệt là enzyme protease kiềm được ứng
dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn so với các loại enzyme khác.
Ngoài ra protease còn được ứng dụng trong các lĩnh vực:
* Trong công nghiệp thịt
Có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt. Ngoài papain có thể dùng

* Trong hương phẩm và mỹ phẩm
Protease sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt,
kem đánh răng… Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết, làm cho da mịn. Thuốc
đánh răng có chứa protease có tác dụng chữa viêm lợi và diệt khuẩn. Các loại xà phòng
chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở áo quần, drap ở
bênh viện… khá tốt.
* Trong công nghiệp y dược
Trong công nghiệp y dược, các chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các MT
dinh dưỡng hỗn hợp có proten dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các VSV khác.
Ngoài ra người ta còn thường dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các
huyết thanh kháng độc tố để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch)
Chế phẩm protease thuần khiết được sử dụng trong y học để loại bỏ các tổ chức hoại
tử, hỗ trợ tiêu hóa, loại trừ cholesterol bám trên thành mạch máu và để chữa bệnh viêm tắc
động mạch.
Tác giả Phạm Thị Trân Châu đã kết hợp cùng với bệnh viện quân y 108 nghiên cứu
sử dụng chế phẩm protease có tên gọi Prozumabo để điều trị bỏng, kết quả cho thấy dả mạc
rụng nhanh, vết thương nhanh khỏi [11].
* Trong kỹ nghệ phim ảnh
Protease vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu ảnh quang khác nhau như
điện ảnh, giấy ảnh, phim rơnghen…Các protease sẽ phân giải và hòa tan lớp nhũ tương
gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy
ảnh quý.
* Ứng dụng protease để sản xuất các sản phẩm lên men giàu đạm
- Tương: Nguyên liệu trong sản xuất tương là gạo nếp, đậu tương. Nấm mốc từ ngoài
không khí rơi vào xôi (được nấu lên từ gạo nếp) và phát triển thành phức hệ enzyme
amylase – protease tham gia vào hai quá trình sinh hóa quan trọng là thủy phân protein của
đậu nành thành các acid amin và thủy phân tinh bột thành đường. Do vậy tương có vị ngọt
của đường, vị đậm đà của chất đạm, vị mặn của muối ăn.

18

Bảng 1.1. Thị trường enzyme toàn cầu dựa trên cơ sở các lĩnh vực ứng dụng (triệu USD)
Lĩnh vực
ứng dụng
Kỹ thuật

2005

2006

2007

2012

1075

1105

1140

1355

19

Tăng trưởng %
2007-2012
3


Thực phẩm


2740

4

ezyme phân
tích và y học,
10%

Protease kiềm,
25%

Lipase, 3%
Carbohydratase
khác, 10%

Các protease
khác, 21%

Amylase, 18%
rennins, 10%

Trypsin, 3%

Hình 1.7. Thị trường của các enzyme trên thế giới (Rao el al., 1998)[47]
1.1.3.1. Nguồn thu nhận protease kiềm
Protease kiềm được thu nhận từ các nguồn VSV khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi và
một số ít nấm men.
Trong tất cả các nguồn vi sinh thu nhận protease kiềm thì vi khuẩn là nguồn đặc biệt
quan trọng do được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt,
công nghiệp da, thực phẩm và thức ăn gia súc…

RM 4

Tẩy lông

Bacillus pumilus Cbs
Streptomyces sp. Ab1

Công nghiệp chất tẩy rửa,
công nghiệp thực phẩm và
công nghiệp dược phẩm
Thuốc tẩy, tẩy lông
Tẩy lông, thủy phân lông vũ

Bacillus subtilis PE-11

Thuốc tẩy

Bacillus sp.SSBi

Công nghiệp chất tẩy rửa
Trích ly chitin, thủy phân
lông vũ, tẩy lông
Ứng dụng

Bacillus sp.Tk1 và TK2

Bacillus licheniformis RP1
Vi sinh vật
Bacillus coagulans
Bacillus licheniformis

thuật di truyền) U 1521
Aspergillus
Aspergillus terreus
Aspergillus aidulans Ha10

Verma et al., 2011
Kuberan et al.,2010
Jaouadi et al.,2011
Jaouadi et al.,2011
Adinarayana et
al.,2003
Singh et al.,2005
Hadda et al., 2011
et al.,
Tài liệu
Asokan et al
al.,2010
Vadlamani et
al.,2011
Abou- elela et al.,
2011
Naidu et al.,2005

Ravindran et
al.,2011
Prakasham eal.,2005
Loại bỏ lông trong công
Mukhtar and Haq et
nghiệp thuộc da
al., 2008


Chellapandi, 2011

Công nghiệp thực phẩm, công
nghiệp y dược và công

Charles et al.,2008

21


Engyodontium album
BTMFS10
Aspergillus flavus

nghiệp da
Chất tẩy rửa, thu nhận bạc
trong trong xử lí phim
Công nghiệp chất tẩy rửa,
tổng hợp peptid

Jasmin et al.,2010
Yadav et al., 2011

1.1.3.3. Sản xuất protease kiềm
Để có thể sử dụng enzyme protease kiềm trong công nghiệp, đòi hỏi phải sản xuất
công nghiệp. Hiện tại phương pháp lên men bán rắn và phương pháp lên men chìm đều
được sử dụng.
Các thành phần môi trường đặc biệt là nguồn carbon và nitơ cũng như các thông số
lên men như nhiệt độ, pH, chế độ oxy hòa tan, chế độ đảo trộn trong lên men bán rắn và chế


10

37

140

Nadeem et
al., 2008

Bacillus
subtilis CR
179

Tinh
bột,
maltose

Cao ngô

8

45

150

Akhavan et
al., 2011

A. niger

et al., 2010

Bacillus subtilis
SVR-07

Glucose

Bột đậu nành
tách dầu

9,0

55

150

Reddy et al.,
2011

Bacillus brevis

Lactose

Bột đậu nành
tách dầu

10,5

37



9

37

150

Akcan et al.,
2011

Vi sinh

22


Pseudomonas
fluorescens
Microbacteriu
m
AR-68
Streptomyces
pulverescens

Cám mì

Peptone

9

37

Jayasree et
al.,2009

Mỗi chủng VSV sản xuất protease kiềm đều đòi hỏi những điều kiện khác nhau, một
số chủng vi sinh đòi hỏi phải có các ion kim loại dưới dạng các muối cho vào môi trường.
Vì chi phí giá cả của môi trường lên men liên quan đến giá thành sản phẩm, đồng
thời theo xu hướng sản xuất sạch hơn, một số chất thải trong nông nghiệp có thể được sử
dụng có hiệu quả trong công nghiệp sản xuất protease kiềm như cám gạo, cám lúa mì, trấu
lúa, vỏ đậu các loại.v.v.. Hầu hết các vi sinh vật sản xuất protease kiềm ở pH 8-9 và nhiệt độ
32 - 45oC.
Để đạt được năng suất tối đa và sử dụng tiết kiệm các nguồn nguyên liệu, vật tư,
năng lượng, các nhà nghiên cứu đã liên tục nghiên cứu tối ưu các điều kiện sản xuất. Theo
truyền thống các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu từng biến số theo thời gian, mỗi biến số cho
một tối ưu độc lập. Điều này tốn rất nhiều thời gian, chi phí tốn kém và không phản ảnh
đúng giá trị tối ưu khi có một số lượng lớn các biến số tham gia và can thiệp bởi sự tương
tác giữa chúng.
Gần đây một số phương pháp thống kê như phương pháp Taguchi, thiết kế PlacketBurman và phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) cho kết quả tối ưu hóa nhanh hơn, giúp ta
hiểu biết tốt hơn sự tương tác giữa các biến số (bảng 1.4).
Bảng 1.4. Các phương pháp thống kê tối ưu hóa sản xuất protease kiềm
(V.K.Nigam et al., 2012) [51]
Phương pháp

Vi sinh

tối ưu hóa

Các thông số

Cải thiện


Burman

DKMNR

Plackett-

Bacillus

Thành phần môi

Burman và

subtilis C4

trường, và tốc độ

Nguồn carbon,
nitơ

23

1,72 lần

4,4 lần

2,2 lần

Tài liệu

Bhuniaa et al.,