BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Phạm Thị Lịch
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME
CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA
SP. PHÒNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN
CÂY CÀ CHUA
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Phạm Thị Lịch
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME
CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA
SP. PHÒNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN
CÂY CÀ CHUA
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 01 07
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
2
MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN .............................................................................................................. 1
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 6
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7
1. Lí do chọn đề tài..............................................................................................................7
2. Mục tiêu ...........................................................................................................................8
3. Nhiệm vụ ..........................................................................................................................8
4. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................................8
5. Ý nghĩa của đề tài ...........................................................................................................8
6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................................9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10
1.1. Nấm Trichoderma spp. ..............................................................................................10
1.1.1. Vị trí phân loại ......................................................................................................10
1.1.2. Đặc điểm sinh học.................................................................................................10
1.1.3. Cấu trúc của Trichoderma spp. .............................................................................11
1.1.4. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng..................12
1.1.5. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp. ............................................14
1.2. Chitin và hệ enzyme chitinase ..................................................................................16
1.2.1. Chitin.....................................................................................................................16
1.2.2. Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase .............................................................17
1.2.3. Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase .............................................................18
1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm........................................................19
1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase ..................................20
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp. ..........21
chitinase của NS ..............................................................................................................40
2.2.11. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến các đặc tính lí hóa của CPE
chitinase ..........................................................................................................................41
2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh bởi
CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác .............................................................42
2.2.13. Phương pháp khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh
cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác ......................................................43
2.2.14. Gây nhiễm nấm bệnh vào cây cà chua bằng phương pháp nhân tạo [6] ............44
2.2.15. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đếm KL [19] .......................................45
2.2.16. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đo mật độ quang [14] .........................45
2.2.17. Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp. phòng vi nấm gây hại trên
cây cà chua ......................................................................................................................46
2.2.18. Phương pháp xử lí số liệu thống kê ....................................................................47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 48
3.1. Kết quả tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao ........................48
3.2. Ảnh hưởng của MT và các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase của chủng
Trichoderma BL2 ..............................................................................................................49
3.2.1. Ảnh hưởng của MT lên men bán rắn ....................................................................49
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng ...............................................................51
4
3.2.3. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất cảm ứng ...................................................................53
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy ..................................................................54
3.2.5 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy..............................................................55
3.2.6. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy .......................................................56
3.2.7. Động thái quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma BL2 ..........58
3.3. Chiết tách dịch enzyme và thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma
BL2 .....................................................................................................................................59
Chế phẩm enzyme
CPSH
Chế phẩm sinh học
DNS
3,5-dinitrobenzoic acid
HLĐK
Hiệu lực đối kháng
KL
Khuẩn lạc
MT
Môi trường
Nxb
Nhà xuất bản
NS
Nấm sợi
điều kiện tốt để các sinh vật gây hại sinh trưởng, phát triển và phá hại nghiêm trọng mùa
màng. Trong đó, bệnh hại cây trồng do vi nấm trong đất là một vấn đề mà người nông dân
còn gặp nhiều khó khăn trong việc quản lý và phòng trừ.
Vi nấm đất gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài kể cả trong điều
kiện không có cây ký chủ. Chúng bảo tồn bằng các sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử
trứng và những bào tử có vách dày ở trong đất và trên tàn dư cây trồng. Nấm xâm nhiễm,
gây hại cây trồng làm cho rễ và các tế bào mạch dẫn của cây không còn khả năng hút nước
và chất dinh dưỡng từ giá thể. Vì vậy mà các triệu chứng của các bệnh do vi nấm trong đất
gây ra thường rất giống nhau, đều héo vàng, còi cọc và chết cây, làm giảm năng suất thu
hoạch. Riêng đối với cà chua, theo thống kê của ngành Bảo vệ Thực vật Lâm Đồng (năm
2012), tại 2 huyện Đơn Dương và Đức Trọng:
Bệnh xoăn lá nhiễm trên diện tích gần 600 ha, tỷ lệ hại 2,9 - 20%.
Mốc sương: bệnh nhiễm trên 1.236,6 ha tại Đơn Dương, Đức Trọng, tỷ lệ hại 8,4 30%, tăng 271,1 ha so với kỳ trước.
Đốm lá vi khuẩn: bệnh nhiễm tại Đơn Dương 1.620 ha, tỷ lệ hại 16,7 - 30%, tăng 120
ha so với kỳ trước.
Để phòng trừ vi nấm gây hại trên cây trồng có rất nhiều biện pháp như cơ giới, canh
tác, hóa học và biện pháp sinh học. Trong đó, biện pháp sinh học được xem là mang lại hiệu
quả, thân thiện, an toàn với môi trường. Biện pháp sinh học tạo môi trường thuận lợi cho
các loại sinh vật có ích (kẻ thù tự nhiên của dịch hại) phát triển nhằm góp phần tiêu diệt
dịch hại, bảo vệ thiên địch tránh khỏi độc hại do dùng thuốc hoá học, tạo nơi cư trú cho
thiên địch sau vụ gieo trồng bằng cách trồng xen, làm bờ rạ cho thiên địch ẩn nấp.... Sử
dụng chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật có tác dụng trừ dịch hại, không độc hại với các loại
sinh vật có ích, an toàn với sức khỏe con người và môi trường.
Trong số các nhóm vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm phòng trừ bệnh hại trên
cây trồng thì Trichoderma là loài nấm đối kháng đang được quan tâm nhiều hiện nay trong
lĩnh vực sản xuất nông nghiệp. Do Trichoderma có khả năng tiêu diệt vi nấm gây hại cây
trồng bằng nhiều cơ chế như kí sinh, sinh kháng sinh, tiết các enzyme ngoại bào,… Hệ
7
5. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
Góp phần tìm hiểu về khả năng phòng trừ nấm bệnh gây hại cà chua của chế phẩm
enzyme chitinase từ Trichoderma sp.
8
Ý nghĩa thực tiễn
Dựa vào kết quả thu được và chế phẩm tạo ra trong đề tài có thể ứng dụng làm chế
phẩm sinh học để phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây cà chua.
6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: 12/2012 – 8/2013
Địa điểm: phòng Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP. HCM
9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nấm Trichoderma spp.
1.1.1. Vị trí phân loại
Trichoderma được xem là nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại vì các
đặc điểm cần thiết cho việc phân loại chưa được phân tích đầy đủ.
Trước đây, người ta cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales,
họ Moniliaceae [64].
Hiện nay, dựa vào việc phân tích trình tự một số gen đặc trưng như ITS, tef, rpb,
ech24, Druzhinina và cộng sự (2006) đã phân loại Trichoderma như sau [30]:
Giới
Fungi
Đa số các chủng Trichoderma phát triển trong đất có độ pH từ 2.9 đến 9.5; pH tối
thích là từ 4.6 đến 6.5. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 30oC. Một vài dòng phát triển tốt ở
35oC, một số ít phát triển ở 40oC [64].
KL nấm có màu trắng hoặc từ trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các
chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, KL có thể đạt đường kính từ 4 – 9 cm sau 4
ngày nuôi cấy ở 25oC.
10
Hình thái KL và BT của Trichoderma khác nhau khi ở những điều kiện nhiệt độ
khác nhau. Ở 35oC chúng tạo ra những KL rắn, dị thường với sự hình thành BT nhỏ và mép
KL bất thường, ở 37oC không tạo ra BT sau 7 ngày nuôi cấy. Hầu hết các loài Trichoderma
không có giai đoạn sinh sản hữu tính, chúng sinh sản vô tính bằng BT đính từ khuẩn ty.
Khuẩn ty của Trichoderma không màu, cuống sinh BT phân nhánh nhiều. Ở cuối nhánh
phát triển thành một khối tròn mang các BT trần không có vách ngăn, thường không màu.
BT có dạng hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ ngắn. Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 10 µm,
được bao bọc bởi thành tế bào. Thành tế bào không chứa cellulose như thực vật mà chứa
chitin và một số thành phần khác như polysaccharide, lipit, protein, hexozamin, chất màu.
Màng tế bào chất dày khoảng 7 µm chứa lipit (40%) và protein (38%) [62].
Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại bào như
chitinase, glucanase, xylanase, pectinase, cellulase…để phân hủy các nguồn xác bã hữu cơ
thực vật và vách tế bào nấm bệnh [13].
1.1.3. Cấu trúc của Trichoderma spp.
Bề mặt tế bào của hầu hết các loại nấm bao gồm 3 lớp: màng nhày, vách tế bào,
màng tế bào. Cấu trúc vách tế bào của Trichoderma thuộc dạng chitin-β-glucan. Tuy nhiên,
chitin hiện diện ở hệ sợi nấm lại không có ở BT của T. viride. Vách tế bào của một vài
chủng Trichoderma đã được phát hiện chứa galactose và N-acetyl-β -D-galactosimin lectin
[43], [66].
Trichoderma spp. có nhân điển hình, được bao quanh bởi một màng đôi. BT đính
học do nấm chủ tiết ra. Khi tơ nấm Trichoderma đến gần tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng
tiếp xúc và cuộn xung quanh sợi nấm chủ, sau đó hình thành cấu trúc móc hoặc ép sát sợi
nấm kí chủ và phát triển song song với nấm kí chủ [68].
Giai đoạn 2: Sau khi vây quanh, sợi nấm Trichoderma sẽ thủy phân vách nấm kí chủ
bằng cách tiết ra các enzyme ngoại bào như: chitinase, glucanase, cellulase [68].
Giai đoạn 3: Cuối cùng sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng màng sinh chất
của tế bào nấm kí chủ, làm cho chất nguyên sinh trong nấm kí chủ bị phân hủy và dẫn đến
nấm bệnh bị chết [68].
Cơ chế cạnh tranh
Một cơ chế khá phổ biến đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là sự
cạnh tranh của nấm đối kháng với nấm bệnh tại vùng rễ. Trichoderma spp. có thể biểu hiện
tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú.
Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nguồn gây bệnh cây. Do đó, chúng
chiếm chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh [27].
Cơ chế tiết kháng sinh
12
Một số chất như trichozianine, trichothecene, trichotoxin A, viridin, ergokonin A…
là kháng sinh có hoạt tính kháng nấm được phát hiện nhiều ở loài T. harzianum, T.
polysporum, T. viride, T. longibrachiatum [27].
Cơ chế tiết enzyme
Cơ chế quan trọng giúp Trichoderma đối kháng hiệu quả với nấm gây bệnh cây trồng
là nhờ vào khả năng tiết ra nhiều loại enzyme.
Các loại enzyme do Trichoderma tiết ra gồm có: Endochitinase, glucanase 1,3-βglucosidase, chitobiosidase, trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, N-acetyl- β glucusaminidase (NAGase)...[46].
Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase Trichoderma phổ biến hiện nay là dựa vào
vị trí thủy phân, gồm 3 nhóm:
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer tạo
thành sản phẩm là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng
Kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật
Trong trường hợp này, Trichoderma spp. đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với
rễ, kích thích hệ thống miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Khả năng đề kháng của
thực vật tăng khi tăng: nồng độ của chất chuyển hoá; các enzyme liên quan đến cơ chế tự
bảo vệ (phenylalanine ammonio-lyase, chalcone synthase); các enzyme liên quan tới sự tổng
hợp phytoalexin, chitinase và glucanase. Sự có mặt các chất trao đổi của Trichoderma kích
thích sự tổng hợp phytoalexin ở thực vật. Đây là những protein liên quan đến sự kháng bệnh
của cây. Nhờ đó, hệ thống gen thực vật có thể chủ động phản ứng lại các tác nhân gây bệnh
và các nhân tố kích thích khác.Cơ chế tự bảo vệ thực vật có thể hoạt động mà không nhất
thiết đòi hỏi sự kích thích của các sinh vật sống [41].
Ví dụ, lúa mạch có sức đề kháng với sự nhiễm Fusarium tăng lên khi có mặt của
endochitinase từ T. atroviride. Thuốc lá và khoai tây mang gen mã hóa chitinase từ T.
harzianum có sức chịu đựng cao hơn với điều kiện bất lợi của MT và hoàn toàn kháng lại
nấm bệnh Alternaria alternate, Alternaria solani, Botrytis cinerea trên lá và với nấm bệnh
từ đất như Rhizoctonia solani. Những kết quả tương tự đã đạt được với enzyme chitinase
trong dâu tây; chitinase và β-1,6-glucanase trong dưa và cây cà chua. Sự kích hoạt các phản
ứng tự bảo vệ thực vật sử dụng các nhân tố kích thích có thể là một chiến lược có giá trị như
một thay thế cho việc sử dụng các thực vật biến đổi gen, để bảo vệ thực vật chống lại tác
nhân gây bệnh [8].
Kích thích sự tăng trưởng của thực vật
Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khi cây được xử lí và rễ bị xâm nhiễm bởi
những loài Trichoderma một cách thường xuyên sẽ làm tăng cường sự phát triển hệ rễ và
năng suất cây trồng, tăng sức đề kháng với những điều kiện vô sinh, tăng khả năng hấp thu
14
và sử dụng dinh dưỡng. Năng suất cây trồng trong các cánh đồng có thể tăng lên đến 30%
sau khi bổ sung T. hamatum hay T. koningii. Các thử nghiệm tiến hành trong điều kiện nhà
kính, đã cho thấy có sự tăng sản lượng đáng kể khi hạt giống cây được xử lí với các
1.2. Chitin và hệ enzyme chitinase
1.2.1. Chitin
Khái niệm
Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polymer sinh học được
tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới
chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g/ 1 năm/1 m2 bề mặt trái đất. Trong
tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào
của nấm và một số tảo Chlorophiceae. Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu
trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn
thể, giáp xác và giun tròn… Ở động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai
mực, hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm,
cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng
[30], [53].
Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau. Mặc dù
chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là từ vỏ
cua và tôm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất
như: CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ… nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm
bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính
chất của chitin [30], [53].
Cấu trúc phân tử
Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc, người ta thấy
rằng chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết
với nhau bởi liên kết 1- 4 glucoside [53].
Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ; sự khác nhau này thể hiện ở sự
sắp xếp các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau; nhưng có một cặp xếp
cùng chiều. Ở chuỗi β–chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định. Chuỗi γ–chitin có
các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc [53].
Tính chất của chitin
Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch.
Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid loãng, dung dịch kiềm loãng, trong cồn
và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase này hoạt động thông qua một cơ chế
kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-monomer. Các
chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas
hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serrati
marcescens…[50].
-
Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19
Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn
Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với
một vòng xoắn. Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV [50].
-
Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 20
17
Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-glucosamine acetyl hexosaminidase từ
vi khuẩn, Streptomyces và người [50].
Dựa vào trình tự amino acid
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận
biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm [61]:
Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với
tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine hoặc proline ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận
biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin
nhưng không cần cho hoạt động xúc tác.
Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn
giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase
có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III
và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu
đựng nhiệt độ cao đến 800C. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin
mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp. từ 30 – 450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus
sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40 – 600C [49].
Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng T. harzianum Rifai
nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25 – 600C,
nhiệt độ tối ưu là 400C [54].
Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH tối thích của hệ enzyme chitinase từ 4 – 9 đối với các enzyme chitinase ở
thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4.8 – 7.5 và ở VSV là 3.5 – 8.0.
pH tối thích của enzyme chitinase có thể phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Đa số các
enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối ưu khoảng 5.0 khi cơ chất là chitin. Các
nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4.0 – 8.5 [53].
Chitinase của vi nấm cho hoạt tính cao nhất ở pH = 5.0 trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là
8.0 [48].
Sự ổn định hoạt tính
Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2
năm. Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 37oC trong trường hợp không có mặt của cơ
chất. Chu kì bán hủy ở 37oC là 40 ngày và ở 5oC là 230 ngày [49].
1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm
Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật: thực vật, động vật, vi khuẩn, vi
nấm. Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy nhiên trong
các MT nuôi cấy VSV, người ta đều cho thêm chitin – cơ chất của enzyme chitinase để làm
tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính enzyme chitinase sau
quá trình chiết tách [37], [41].
Ở vi nấm, chitinase chủ yếu được tổng hợp bởi các loại NS. Các chủng NS cho
enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia… Riêng đối với
Phương pháp này có ưu điểm:
- NS được cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ
tiếp xúc với dịch dinh dưỡng.
- Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa.
Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:
- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối.
20
- Trong quá trình nuôi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục.
- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ.
- Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất cảm ứng
để NS sinh enzyme ở mức tối đa.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt – MT bán rắn
Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT. Nguyên liệu chính
thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, hoặc tấm gạo,… được bổ sung trấu để
làm tăng độ thoáng khí. MT được bổ sung chitin và một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến
hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60%. Hấp thanh trùng ở 1 – 1,5 atm /45
– 60 phút, để nguội rồi cho BT nấm vào. MT đã cấy giống được trải lên các khay sạch với
chiều dày từ 2 – 5 cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp. Sau khoảng thời gian nuôi cấy,
người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 400C để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ. Hoặc thu
dịch chiết enzyme, li tâm loại bỏ BT, sợi nấm và các tạp chất; sau đó lắng tủa bằng tác nhân
tủa phù hợp; sấy khô, xay mịn. Đây chính là chế phẩm enzyme dạng thô [16].
Phương pháp này có nhược điểm là:
- Tốn diện tích mặt bằng.
- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình.
- Chi phí nhân công, điện nước... cho một đơn vị sản phẩm cao.
Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao
hơn, vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đó nuôi trên MT này thì độ thoáng khí cao. Nồng
độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm. MT không cần điều kiện vô trùng
(2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ NS Aspergillus sp. đã chỉ ra rằng hoạt tính
chitinase cao khi sử dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4 [25].
Theo Nampoothiri và cộng sự (2003), khi bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào MT
nuôi cấy bán rắn thì khả năng tạo chitinase ở Trichoderma harzianum tăng đáng kể. Tuy
nhiên, theo Kovacs và cộng sự (2003), trong nuôi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào
MT cám gạo-chitin không ảnh hưởng đến khả năng tạo chitinase. Suresh và
Chandrasekharan (1999) cũng ghi nhận sự gia tăng sản lượng enzyme này khi MT nuôi cấy
T. harzianum được cung cấp muối amonium phosphat và cao nấm men.
Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu ... có vai trò quan trọng như tham gia vào
quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia thành phần cấu tạo
protein, enzyme, điều hòa pH của MT nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme nói chung, chitinase nói riêng [26], [57].
1.2.6.2. Điều kiện nuôi cấy
Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 50 – 60%, nếu
độ ẩm dưới 50% thì hoạt tính enzyme sẽ giảm. Độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá
trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng khí của MT, còn khi độ ẩm thấp sẽ kìm
22
hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV. Đối với T. harzianum, hoạt tính chitinase cao
nhất ở độ ẩm MT là 65% [55].
Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH của MT ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của các chủng NS. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH ban đầu của MT
nuôi cấy thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Nhìn chung, các chủng Trichoderma có thể
Myxomyces
Cellulose
23
Copyright: Tài liệu đại học ©