ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
TRƯNG TÂM NGIIIẾN c ứ u VI SINH VẬT HỌC ỨNG DỤNG
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHAM
VI SINH VẬT DIỆT CHUỘT
• • •
ĐỂ TÀI CẤP ĐAI HỌC QUỐC CỈIA
M ã số: &ĩ. ^
Chủ trì đề tài: PGS. PTS. Phạm Văn Ty
Các thành viên tham gia: Thạc sỹ Nguyễn Hoài Ilà
Cử nhân Nguyễn Thế Hoà
TR
/ c tc 3.9
Hà Nội -1998
MỤC LỤC
1 Tóm lắt kết quá để tài la
2 Tóm tắt kêt quá đề tài tiếng Anh lc
3 Mớ đầu 1
4 Tổng quan tài liệu 2
5 Phương pháp nghiên cứu 9
6 Kết qiiíi và thno hirìn 12
7 Kêt IIIộ 11 29
8 Tài liệu tham khán 30
0 Phu lục 33
10 Phiêu đãng ký kôt quá ngliiổn cứu khoa học công nghệ 37
TÓM TẮT
Tén đề tài : Nghiên cứu tạo chẻ phẩm vi sinh vật diệt chuột
Đề tài cấp Đại học Quốc gia . Mã số QT.98.14.
Trong mấy năm gần đày ở Việt Nam cũng như các nước quanh vùng, nạn
chuột hoành hành và gây thiệt hại lớn cho sán xuất nông nghiệp và kho tàng.
Chuột còn là vật trung gian truyền bệnh dịch hạch cho người. Việc săn bắn thiên

Ti!le: StnclV on culturc conditons ỉind rat pnthogcnic' iibilitv of SalmotielỊa
eiìteritidis var Isatchenko H10 fbr procluction of ratsbane
!n the lasl fe\v years. rat (lisastei caused the destruction of agricultural
production and stores in Vietnam and nearby countries. Moreover, rats and mice
nre mtermndinte liost to sprcnđ plngue. Hunting of nnturnl enetny of rnt sncli as
cat. bird and snake make ecology unbalance which gives good conditions for
proliferntion of lat nncl causes tnany sevious problems for natural econorry.
Tinđilionnl nietliods donì gel high effect. Meclianical method is nol only
uneconomic hut also unnpplicahle in large scale. The chemical application is
toxic for nmii and destrovs enviroment.
Using the effective micTongnnisms can prevent these disaclvantages. In
1897. Isntchenko isolated Snlmonella entei it idis which showed strongly
pathogenic nhility, hut doiVt arrect on man and the other aninmls. For 100 yenrs ,
tliis strain hns heen used foi prodution of ratsbane and has heen never producing
any bad consequences so far.
We stiKÌiecl some chnracteiistics of this strain and optimal culture
condition for production of ratsbane. This prnduct contains 10° germs/g. The
optimal pH and temperature of the growth are 7 and 37 °c. respectively. Simple
mnterinl can be Iisecl fni íeimentation.
Rat vvhich \vas eaten 5g ratshane gets disease and dies after 3-1 I clays .
Tliis lal can spreađ disease over his herh. So 2 kg of rntsbane is used for a hectar.
TW
(1
lons of ratshane have heen produced, which is the result nf the cooporation
uilli YVdnn Vietnam companv
-V ; cl" ''bor Jind f~or
Dr- p h n m Vc> I
-1
T y
2

loat triệu chứng. Độc tố tác động vào não gfty triệu chúng li bì của bệnh
thương hàn và gíty ra hiện tượng chênh ỉệch giữa mach và nhiệt độ. Độc tô' tác
đông vào dây thẩn kinh giao cám gây đầy hơi, đi rửa, gây chấm máu dưới da,
ơ.ìy simg loét hav hoai tử lionc pAy sung huvết trong ruột.
Từ máu vi khuẩn vào mát găp điều kiên rluiân lợi phát triển rồi theo ống
dần rnât ra ruột và đào thãi then phân.
Vi khuân còn theo đirờns tiết niệu và ctào thái ra ngoài nlnmg rất ít [4].
2.4. Klui nániỉ "ày bệnh thực nghiệm cùa vi khuân Isatchenko
Vi khuân Isntchenkn là chuna gàv hênh đặc hiệu cho chuột đồng và
chuột nhà.
Một sò nhà nghiên cứu còn thày: Vi khuẩn từ hè thông bach huyêt di
vào tuần hoàn máu. lai xuất hiên phía ngoài thành ruột và vào trong ruột gây
nên bênh nâng ơ các cơ quan nội tang và đường ruột của chuột [3].
IVIỘt sỗ nhà nshiẻn cứu khác còn thấy vi khuẩn xâm nhập vào hệ thông
bach huyèt. sau đó xàm nhập vào tuyến nước bot, amidan và vùng họng [4].
Từ khi vi kluiắn xâm nhập đến khi bắt đẩu xuất hiện triệu chứng bệnh
diễn ra 3 - 20 nơày. Thời kỳ
11
bênh trung bình 3-10 ngày, đổi với một số loài
chuột đổnơ hoăc chuột nhà thì thời kỳ này ngắn hơn khoáng 3 - 6 ngày. Vào
các thời kv tièp theo chuột suy yêu dần, cháy nước mắt, khó thờ, giảm trọng
lương, đi tiêu chay mât khá năng phán xa rồi chết [7].
2 5 Mộf so dặc tính niíi chuột nhà và chuột (tổng
7.5.1. Chuột nhà Ratlvs / ĩavipectiia [7].
4
2.5.1.1. Đác diêm
Thân hình thon nhỏ. đuôi dài hơn thân, tai dài gấp lai phu mắt. Bình
thuờng có 5 đôi vú. Lưng màu nâu sẫm lông lưng mểm màu hung đó. Giữa
lưng có xen lẫn nhũng lông dài màu đen làm thành môt dái thầm ờ giũa limơ.
Bung màu xám. màu săc măt bung thav đổi theo mùa trong năm và theo lứa

4
5
6
7
8
9
10
1 1
12
uc
35
25
17
100 40
24 29
-
44.2 30 30 50
Sư có mật của chuột vừa dẻ và chuột non ờ mùa dông chứng ro chuột
sinh san ca trong mùa đông. Chuột đẻ 3 - 4 lần trong nám. Sn chuột đẻ lun thứ
I và 2 nhiều nhất, chuột đẻ lứa thứ 3 và thứ 4 rất ít. Trung bình chuột đẻ 3-12
con mỗi lứa. Tuổi thọ cua chuột nhà chí giới han trong một năm.
Ch
11
ộr nhà là loni lất tinh khôn và hay cánh giác nên diệt trừ chúng lất
khó. Thường chúng không ăn môi độc, và rất cánh giác vứi các loai bẫv. Vì
thê nên đât hẫỵ trên những nơi chuột buộc phải đi qua.
2.5.2. Chuột đổnẹ ỉóv Raítus haxaensis í6/
2.5.2.1 .Đác điếm
Thân hình thò. đuổi dài hơn thàn. tai ngắn hình hàu duc. bàn chân sau
Bình thương co 10 dôi vú. Lòng mềm mai khòng có ơai. ỊVIăt lưng vàng

đươc dùng khi cẩn táu thoát.
2.5.3.3. Thức ăn cùa chnòt đrìns; bé
Clniòt đồng bé ăn các loai rau. quả. củ. Trong da dày có chứa 60% sắn,
20v/r hạt co và 20% thịt.
2.5.3.4. Sinh sàỉi cùa chuột dồnq bé.
Khòna sinh sán nhiều như chuột đồng lớn. mỗi lứa (tẻ 5 -6
con. Sinh san tâp tnum vào lúc lúa làm đòng và giám đi sau vu gật.
2.6. Su phá hai cùa chuột (lổnự và chuột nhà.
(j nước ta chuột phàn bò à khắp mọi nơi. Trong nhũng nám gán dây nan
chuột phá hai mùn màng đang là mối lo lắng cùa nỏng dan các dịa phương.
Theo háo cáo cua cuc Khuyên nông Bộ nông nghiệp và phát triển nông thòn
thì sỏ thiệt hai do chuột sây ra tại các tỉnh miền Tây Nam Bộ lên tới 300 000
tân thóc/năm [8].
Vu đông xuân 1997 tai các tính, thành miền Bấc và miền Trung có
97 725 ha lúa và rau màu hi chuột phá hai. Trong đó. có 12 046 ha bi thiệt hai
năng, nhiều nơi bi rnât trắng [7].
Theo háo cáo mới nhất FAO (1993), trên phạm vi toàn cáu. hàng năm
chuột oây tốn thất lớn tới 33 000 000 tấn ngũ cốc. Riêng ờ Mỹ La Tinh thiệt
hại hàng nám từ 8 - 10% sán lượng ngũ cốc, mất hơn 1.5 ty đô la mỹ [61.
7
Nạn chuột phá hoai mùa màng đang là mối lo lắng đăc biệt của bà con
nông dân. Đây là một vấn đề nan giải đang được chính phủ quan tâm và ra chỉ
thị, cồng văn hướng dẫn, hoăc thành lộp ban chỉ đao và có chính sách khuyên
khích mọi người tham gia diệt chuột [7].
2.7. Các biện pháp phòng trừ chuột
0 nước ta nhiều biện pháp mang tính tổng hợp đã được sử dụng từ hạn
chê thức ăn. han chế sinh sản của chuột đến việc diệt chuột bằng các biện
pháp thu công, cơ học và sinh học.
2.7.1. Biên pháp thủ còng
Hai tháng đầu năm nay theo công báo của cuc Khuyến nông, các tinh

nhiều nước trên thế giới. Từ 1980 đến nay chế phẩm vi sinh cũng được sán
xuất và sứ dung rộng rãi ờ Cu Ba và còn được xuất sans; một số nước vùng
Caribè và Chàu Mỹ La Tinh, mang tên thương phẩm là Biorat [6].
2.8.2. Tai Việt Nam
ớ Việt Nam việc nghiên cứu sử dung vi sinh vật diệt chuột đang được
tiên hành. Tuy nhiên nhũng công trình nghiên cứu đã công bố còn rất ít và
việc sán xuất bá chuột sinh học mới đang ở giai đoan thử nghiệm.
Từ những năm 1993 trờ lai đcìv, việc nghiên cứu vi sinh vât diệt chuột
đ a n ơ đươc tiên hành ờ mỏt số đơn vị như: Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa
học kỹ thuật nông nghiệp, nhằm muc đích tạo ra được loại bả chuột sinh học
vừa có hiệu quà diệt chuột cao vừa tránh gfty ô nhiễm môi trường.
9
PHẦN 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Nguyên liệu
3.1.1. Chủng vi khuân
Chủng Sơlmonellơ enteriditis Isatchenko nhận được từ Bảo tàng giống
chuẩn của Trung tâm Nghiên cứu vi sinh vật học ứng dụng, ĐHKHTN.
3.1.2. Iỉoá chất
Pepton Trung Quốc
Đỏ phenol Trung Quốc
H2S04 Trung Quốc
3.1.3. Máy móc, dụnẹ cu
Sử dung máy móc, dung cu có tại Trung tâm nghiên cứu vi sinh vât học
ứng dung ĐHKHTN, ĐHQGHN.
Tưàm Osi-Pháp
Máv lắc òn nhiệt Osi Pháp
Tú cấy vô trùng Osi Pháp
Các dung cu thí nghiệm ống nghiệm, bình tam giác 50, 250 ml, đĩa Pet
ri do Trung Quốc sán xuất.
3.2. Phương pháp

3.2.4. Phưoĩtg pháp nhuộm Gram 16]
Gổm các bước:
Nhuộm tiêu bán bằng tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút
Phủ Lugol trong 1 phút
Rứa nước
Tẩy cồn
Rửa nước
Nhuộm bổ sung bằng Saữanin hoặc Fuchsin Ziehl trong 1 phút.
Rửa nước
Làm khô, soi kính với vật kính dầu. Kết quả vi khuẩn Giam (4-) bắt màu
lam tím, vi khuẩn Giam (-) bắt màu dỏ hồng
3.2.5. Xac đinh anh hương cua điêu kiên nuôi cấy tới khả năng sinh trưỏTig
của vi khuân Isatclienko
3.2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt đô.
Chủng vi khuán nghiên cứu được cấy vào bình tam giác chứa lOOml
môi trường 3.2.1.2. nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt với các nhiệt độ: 20; 32;
37; 45; 50°c, pH = 7,0. Sau 48 giờ nuôi cấy đếm số lượng tê bào.
Từ kết quả thu được vẽ hình.
3.2.5.2. Ảnh liưởrtg của pH ban đẩu
Vi khuân nghiên cứu được cấy vào các bình tam giác chứa lOOml môi
trường 3.2.1.2. có điều chinh các độ pH ban đáu: 3.0; 5,5: 7,0; 8.0: 9.0.
Nuôi trên máy lắc ổn nhiệt 220 vòng/phút để tử ấm ờ nhiệt độ 37°c
trong 48 giờ. Sau dó đếm số lượng tế bào.
Từ kêt quá thu được vẽ đồ thi biểu diễn sư ảnh hưởng của pH ban đầu
lèn sinh tnrớna và phát triển cua vi khuân.
3.3. Phương pháp lẽn men bán vò trùng.
Vi khuẩn nghiên cứu dược cấy vào các bình tam giác chứa 100 ml môi
trường 3.2.1.2 nuôi 24 giờ. ờ 37nc. thu được giống cấp 1. lên men 72 giờ
trong bình dung tích 20 lít chứa môi trường 3.2.1.2. Không khí đưa vào qua
dung dịch CuSOị (I %) để khư trùng.

Để xác định khá năng đồng hoá đường, chủng Isatchenko H I0 được cấy
vào ốnơ thạch nghiêng môi trường cơ bản chứa 0,5% một trong các loai đường
sau: mannitol, maltoza, saccaroza. ramnora, arabinoza, dextrin, adonit. lactoza
và glucoza.
c
13
Trong các đặc điểm sinh hoá, chúng tôi xác định: khả năng sinh H,s.
khá năng sinh ureaza, catalaza, oxydaza, khả năng sinh indol, đồng hóa xitrat.
phán ứng đỏ metyl, phản ứng Vorges Proskauer (VPỵ khá năng phan giải
xanh metylen.
Kốt quả ghi ờ bảng I cho thấy chủng Isatchenko H10 có khá năng đổng
hóa glucoza, mannitol, maltoza và dextrin. Không có khá nâng đồng hóa các
đường còn lai.
Chủng Isatchenko H10 có khả năng sinh H?s. nxydaza. đồng hóa xitrat,
phan ứng đó metvl dương tính và phăn giải xanh metylen. Không có khá năng
sinh urerư.íT. indol và phàn ứng vp flm tính.
13
Bảng 1. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của S.enterìditis Isatchenko H10.
Đặc cliổm
Ký hiệu chùng Isatchenko H10
Khả năng đồng hóa hydratcacbon
Gluco7.a
+
Mannit
+
Mant07.a
+
Saccarcv.a
Ramnoza
Arnbimva

4.2.1. Anh hỉ tòng cùa pH ban dấu
pH là một trong nhimg yếu tô mỗi tnrờng có ảnh hưởng quan trọng đên
sinh tiương và phát triên cua vi khuẩn. Chúng tòi sừ dung mòi trườn ơ 3.2.1.2
có điền chính pH ban đầu khác nhau: 3,0 - 9,0, nhiệt độ nuôi cấy 37°c trên
máy lắc ổn nhiệt 220 vòng/phút.
Đêm sò lượng tê hào khi kết thúc kết thúc nuôi cấy.
Kẻt quá thưc nghiêm đươc trình hày n háng 2 và hình I.
nánỊỊ 2. Anh hirong cún plỉ l)i>n (lầu tới khả nĩíriỊ> sinh trương chủng
Isatchenko H 10
pH han dâu
Số lượng tê bào (
10 '/ml)
3.0
0.8
5.5
16.6
7,0
26.4
8.0
3.8
0.0
0.6
Kèt quá ờ báng 2 cho thấy với pH mỏi trường quá axit (pH = 3.0) hoác
quá kiềm (pH = 9.0) chung Isatchenko H10 sinh trưởng kém.
Ó pH từ 5,5 - 8,0 chung Isntchenko HI í) đểu sinh trường tốt. Đác hiệt ờ
pH = 7.0 vi khuân phát triển tôt nhât, dạt 26.4 ' lo ’ tê hào/ml. Tuy nhièn nhìn
chun^ (lều có khà năng sinh trường ờ phạm vi pH rộng tu 5.5 ctên 8.ọ.
16
Hình 1. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sinh trưởng của
chủng Isatchenko H10

45
8.0
50
0
Hình 2. Ánh lnnrnq cua nhiệt (lô tới sư sinh trướng cua
cluìnq Isatchenko H10
□ H10
Nhiệt độ ( C)
4.4. Ảnh hư<mg của nồng (tộ (lường và nước chièt giá (tó lên khá nang sinh
trướng cùa chúng Isatchenko H10.
'Ị -< ! * KT *
/C C 059
18
Mục đích của chúng tôi là tìm ra một môi trường có nồng độ đường và
nước chiết giá đỗ thích hợp cho sư sinh trưởng của chủng vi khuẩn H10.
Xac đinh số lượng tế bào tạo thành sau 48 giờ nuôi ở môi trường 3.2.1.2
trên máy lắc ổn nhiệt 220 vòng /phút, pH = 7,0, nhiệt độ 37°c.
Kết quả được trình bày ở bảng 4 và hình 3a, 3b.
Bảng 4. Anh hưởng của nổng độ đường và nước chiết giá đỗ lên khả
năng sinh trưởng của chủng Isatchenko H10
Số lượng tế bào (x 109/ml)
Đirờng(g/I) X.
50
100
150
200
5
4,8
26,2
26,4

Hình 3h. Ảnh hương của nồng độ (lường và giá đỏ lên
khá năng sinh trưởng cùa chùng Isatchenko H10
0 0
B50
□ 100
□ 150
B 200
Nồng độ đường(g/l)
20
4.3. Nghien cưu động thái sinh trưởng của chủng Isatchenko H10 trong
điều kiện nuôi cấy sục khí đơn giản.
Tiong thí nghiệm này chúng tôi nuôi cấy theo phương pháp sục khí đơn
gian trong chuông thuy tinh. Môi trường được đun sôi để nguội, cho vào
chuông thu ỷ tinh 15-20 lít môi trường 3.2.1.2. Tỷ lệ giống được cấy là 2 -
3% chứa 0,5 X 10 tê bào/ml. Nuôi ở pH = 7,0, nhiệt độ 37°c, không khí được
thôi liên tục qua dung dịch CuS04 1%. Vòng dây dẫn khí bằng nhựa được đục
lô rất nhỏ và cách đều nhẳm tạo cho vi khuẩn tiếp xúc với không khí. Sau đó
kiểm tra sô lượng tê bào trong lml dịch nuôi từ 8 giờ đến 72 giờ (thời điểm
kêt thúc). Kêt quà được trình bày ờ báng 5 và hình 4
Bảng 5. Động thái sinh trưởng của chủng Isatchenko H10 khi nuôi sục
khí.
Thời gian (giờ)
Sô lượng tê bào (x loVml)
8
3.0
16
5,0
24
9,0
32

vi khuẩn trên môi trường thạch 3.2.1.1.