BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
ðÀO THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ASPERGILLUS NIGER KHÔNG
SINH ðỘC TỐ ðỂ PHÒNG CHỐNG NẤM MỐC VÀ ðỘC TỐ
OCHRATOXIN A TRÊN CÀ PHÊ
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số : 60.42.02.01
Giảng viên hướng dẫn : TS. Trần Thị Mai
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii
LỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn,
giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của anh chị em ñồng nghiệp tại Bộ môn nghiên
cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công
nghệ sau thu hoạch. Và sự hướng dẫn, góp ý của quý thầy cô cùng toàn thể
cán bộ Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Trường ðại
học Nông nghiệp Hà Nội
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô Trường ðại học
Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến TS. Trần Thị Mai và TS. Nguyễn
Văn Giang ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và
giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS. TS. Nguyễn Thùy Châu và
ThS. Nguyễn Văn Nguyện - Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu
2 TỔNG QUAN 4
2.1.1 ðại cương về cây cà phê Robusta 4
2.1.2 ðặc ñiểm cây cà phê 4
2.1.3 ðặc ñiểm ñất trồng cà phê 6
2.2.1 Nguồn gốc ñộc tố ochratoxin 8
2.2.2 Các loại ñộc tố ochratoxin 8
2.2.3 Tính chất ochratoxin 9
2.2.4 ðộc tính của ochratoxin A 10
2.3 Sự tạo ñộc tố và sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản 11
2.3.1 Sự tạo ochratoxin A bởi nấm mốc 11
2.3.2 Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A 12
2.3.3 Sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản thực phẩm 14
2.3.4 Mức ñộ nhiễm nấm mốc sinh ñộc tố và ñộc tố ochratoxin A trên
cà phê ở Việt Nam
16
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv
2.3.5 Sự tạo ñộc tố của A niger 17
2.4.1 Tình hình phòng chống ñộc tố ochratoxin A trên thế giới 21
2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt nam 22
2.5.1 Biện pháp ngăn ngừa, hạn chế ñộc tố nấm mốc. 22
2.5.2 Khử nhiễm ochratoxin A bằng hấp phụ sinh học 23
2.5.3 Phòng chống ochratoxin A phương pháp ñối kháng cạnh tranh. 24
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
3.1.1 ðối tượng nghiên cứu: 26
3.1.2 Hóa chất 26
3.1.3 Môi trường 26
không sinh với các chủng sinh OTA hàm lượng cao
42
4.2.1 Hiệu quả giảm ñộc tố OTA của chủng sinh ñộc tố cao bằng các
chủng không sinh ñộc tố 42
4.2.2 ðánh giá khả năng cạnh tranh của chủng A niger AN2 với chủng
A niger pec2 sinh ñộc tố ochratoxin A cao.
44
4.3 Nghiên cứu công nghệ nhân nuôi tạo chế phẩm AN chứa chủng
A niger AN2 phòng chống nấm mốc và ñộc tố ochratoxin A trên cà phê 45
4.3.1 ðiều kiện lên men và thời gian thu hồi sinh khối A niger AN2 45
4.3.2 Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy bề mặt sản xuất bào tử chủng
A niger AN2 quy mô phòng thí nghiệm
46
4.3.3 Nghiên cứu sản xuất bào tử A niger AN2 ở quy mô 100 kg/mẻ 50
4.3.4 Qui trình sản xuất chế phẩm AN từ chủng A niger AN2
ñể phòng chống nấm mốc và ñộc tố ochratoxin A nhiễm trên cà phê 52
4.5.1 Hiệu quả của chế phẩm AN ñến bệnh do nấm, sinh trưởng và
năng suất cà phê tại vùng thử nghiệm 56
4.5.2 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và ñộc tố ochratoxin A trên cà
phê của chế phẩm AN 58
4.5.3 ðánh giá chất lượng chế phẩm AN 61
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 72
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi
4.2 Hiệu quả giảm OTA của chủng A. niger pec2 bằng các chủng A.
niger không sinh ñộc tố
43
4.3 Mật ñộ bào tử của chủng A. niger AN2 tạo ñược trên các môi
trường khác nhau
47
4.4 Khả năng tạo bào tử của chủng A. niger AN2 ở các nhiệt ñộ nuôi
cấy khác nhau
48
4.5 Ảnh hưởng của ñộ ẩm môi trường ñến khả năng tạo bào tử của
chủng A. niger AN2 48
4.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến khả năng tạo bào tử của
chủng A. niger AN2
49
4.7
Ảnh
hưởng của tỷ lệ tiếp giống
tới
mật ñộ bào tử A. niger AN2 50
4.8 Ảnh hưởng của ñộ dày khối ủ tới mật ñộ bào tử A. niger AN2 51
4.9 Mật ñộ bào tử A. niger AN2 trong chất mang ở các thời gian bảo
quản khác nhau
52
4.10 Tỉ lệ rụng quả và năng suất trên cây cà phê 57
4.11 Mật ñộ các vi sinh vật có khả năng sinh OTA trong ñất 58
4.12 Tỷ lệ nhiễm nấm mốc sinh ñộc tố và hàm lượng OTA trong hạt
cà phê sau thu hoạch và sau các thời gian bảo quản khác nhau
59
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
4.5 Khả năng cạnh tranh của chủng A. niger AN2 không sinh ñộc tố
và chủng A. niger pec2 sinh ñộc tố OTA cao
45
4.6 ðường cong sinh trưởng của chủng A. niger AN2 46
4.7 Hiệu quả thử nghiệm trên cà phê sau 12 tháng bảo quản 60
4.8 Sắc ký ñồ hàm lượng ochratoxin A cà phê trong lô thí nghiệm,
KPHð
60
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… x
DANH MỤC ðỒ THỊ STT Tên ñồ thị Trang
4.1 Mật ñộ bào tử AN2 tạo ñược trên các môi trường khác nhau 72
4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng tạo bào tử AN2 72
4.3 Ảnh hưởng ñộ ẩm môi trường ñến khả năng tạo bào tử A. niger AN2 73
4.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy ñến mật ñộ bào tử A. niger AN2 73
4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống ñến mật ñộ bào tử A. niger AN2 74
4.6 Ảnh hưởng ñộ dày khối ủ ñến mật ñộ bào tử A. niger AN2 74
4.7 Lựa chọn chất mang phù hợp cho sản xuất bào tử A. niger AN2
ở thời gian bảo quản khác nhau
75
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
từ 1-10ppb (Nguyễn Thùy Châu & cs, 2010).
Trên thế giới, việc nghiên cứu mức ñộ nhiễm nấm mốc và ñộc tố nấm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2
mốc trên lương thực, thực phẩm là vấn ñề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ
con người và các ñộng thực vật kinh tế. Giới hạn về mức ñộ nhiễm
Ochratoxin A ñã là một trong những tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của
các quốc gia.
ðã có nhiều phương pháp nghiên cứu, áp dụng ñể loại bỏ ochratoxin A
bằng hóa chất, chiếu xạ. Các phương pháp này mang lại hiệu quả nhưng làm
tổn hại ñến chất lượng nông sản, dư lượng hóa chất sau xử lý cũng là một vấn
ñề gây mất an toàn thực phẩm. Ngày nay, việc loại bỏ nấm mốc sinh ñộc tố và
ñộc tố nấm mốc ngay từ trước thu hoạch bằng các chủng nấm mốc ñối kháng
ñang ñược quan tâm. Việc phòng chống nấm mốc sinh ochratoxin A ñã ñược
nhiều nhà khoa học của các nước nghiên cứu. Các tác giả như Ringot và
Bejaoui cho thấy chủng A. niger không sinh ñộc tố ñã có khả năng ức chế
chủng A. niger, A. ochraceus và Penicillium sinh ochratoxin A theo cơ chế
cạnh tranh. Kết quả này ñã ñược cộng ñồng châu Âu công nhận và khuyến
cáo sử dụng chủng A. niger không sinh ñộc tố ñể phòng chống ochratoxin A
trên ngô ở giai ñoạn ngoài ñồng (Ringot, 2006; Bejaoui , 2006).
Ở nước ta, công tác vệ sinh an toàn lương thực, thực phẩm ñã có những
tiến bộ rõ rệt và ngày càng ñược chú ý nhưng các biện pháp phòng trừ ñộc tố
mốc chủ yếu tập trung vào hoá chất. Trong khi ñó, vấn ñề an toàn vệ sinh thực
phẩm và ô nhiễm môi trường ñang trở thành mối quan tâm lớn. Vì vậy, việc
nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm sinh học trong phòng chống nấm sinh ñộc
tố và ñộc tố nấm mốc là rất cấp thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi
tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm Aspergillus niger không sinh ñộc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4
2. TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu cây cà phê và ñất trồng cà phê
2.1.1. ðại cương về cây cà phê Robusta
Cà phê Robusta (hay còn gọi là cà phê Vối) tên khoa học: Coffea
canephora hoặc Coffea robusta là cây quan trọng thứ hai trong các loài cà phê.
Khoảng 39% các sản phẩm cà phê ñược sản xuất từ loại cà phê này.
Nước xuất khẩu cà phê Vối lớn nhất thế giới là Việt Nam. Các nước
xuất khẩu quan trọng khác gồm Coote d’Ivoire, Uganda, Brasil, Ấn ðộ.
Ở Việt Nam, từ năm 1930, cây cà phê bắt ñầu ñược trồng thành những
ñồn ñiền ñể khai thác nhân. Từ ñó ñến nay, diện tích, năng suất và sản lượng
cà phê ở nước ta ñã không ngừng tăng lên.
Những vùng trồng cà phê tập trung chính ở nước ta có ðắc Lắc, Lâm
ðồng, ðồng Nai, Gia Lai, Bình Phước , một số tỉnh miền núi phía Bắc như Sơn
La, Hòa Bình, …
Cây cà phê ñược De Jussien phân loại vào năm 1735. Cà phê thuộc bộ
Long ðởm (Gentianales), họ Cà phê (Rubiaceae), chi Coffea.
Hiện nay ñã có trên 100 loại cà phê ñược phát hiện, trên cơ sở ñặc ñiểm
từng loài, người ta ñã phân ra làm 3 loại giống chính: Cà phê Chè, cà phê Vối,
cà phê Mít.
Cà phê ở nước ta hiện nay trồng cả ba loại cà phê nói trên trong ñó cà
phê Robusta (cà phê Vối ) chiếm phần lớn diện tích và sản lượng tập trung
chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên (Vicofa, 2005)
2.1.2.3. Tình hình sản xuất và xuất khẩu cà phê ở Việt Nam
Tổ chức Cà phê Quốc tế (ICO) trụ sở tại London cho biết sản lượng cà
phê niên vụ 2011/12 của Việt Nam tăng lên mức 21 triệu bao 60kg, hay
15,8% của sản lượng toàn cầu.
Số liệu và các sự kiện về sản lượng và xuất khẩu cà phê của Việt Nam
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 6
ñối với năm niên vụ hiện nay kết thúc vào tháng 9. Việt Nam là nhà sản xuất
cà phê lớn thứ hai thế giới sau Brazil và ñứng ñầu về sản lượng robusta.
Xuất khẩu cà phê của Việt Nam lên mức kỷ lục gần 1,6 triệu tấn trong
niên vụ 2011/12 sau khi ước tính 1,51 triệu tấn ñược xuất trong giai ñoạn
tháng 10/2011 ñến tháng 8/2012 (Vicofa, 2005) .
2.1.3 ðặc ñiểm ñất trồng cà phê
2.1.3.1. Hệ vi sinh vật trong ñất trồng cà phê
Tại ðăc Lăc, phần lớn diện tích ñất là ñất ñỏ bazan nâu ñỏ hình thành
và phát triển trên các cao nguyên bazan phần lớn có ñộ dốc thấp, tầng ñất mịn
dày, có thành phần cơ giới nặng (tỷ lệ sét >40%), tơi xốp khi ẩm, ñộ xốp
trung bình 62-65%, khả năng giữ nước và hấp thu nước tốt Rất thích hợp
với các loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị hàng hoá cao như cà phê.
Hệ vi sinh vật chủ yếu trong ñất ñỏ bazan nâu ñỏ là hệ vi sinh vật phân
giải lân trong ñó phải kể tới sự có mặt của các nấm mốc.
Các nghiên cứu của Cục Khảo sát ñịa chất Hoa Kỳ cho thấy: các chủng
vi khuẩn ñặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus các chủng nấm thuộc
loài Penicillium, Aspergillus có khả năng phân giải các phosphat khó tan
trong ñất nên chúng tồn tại khá phổ biến trong nguồn ñất ñỏ bazan (U.S.
Department of the Interior, 2001).
Sự có mặt của các loài nấm mốc ñặc biệt là Penicillium, Aspergillus
ẩm, %
2,0-0,2
mm
0,2-0,02
mm
0,02-0,002
mm
≤0.002
mm
0-10 1,03 2.70 61.9 33.8 5.0 18.7 33.9 42.4
10-35 0.93 2.72 65.8 33.1 1.4 10.9 24.5 63.2
35-55 10 2.70 56.0 34.1 4.3 15.7 22.8 57.2
55-80 1.20 2.69 59.5 33.2 5.4 15.5 24.4 54.7
80-105 1.11 2.70 59.1 40.4 31.7 29.1 17.6 21.6
Tổng số %
Dễ tiêu,
mg/100g
ðộ chua,
cmol(+)/kg
pH
ðộ sâu
tầng ñất,
cm
OC N P2O5
K2O
P2O5
55-80 0.38
0.07 0.15 0.28 27.5 32.5 0.10 22.30
6.2 4.6
80-105 0.14
0.02 0.14 0.29 167.3
45.00
0.12 21.30
6.5 4.5
Cation trao ñổi, cmol (+)kg ñất
CEC, cmol
(+)kg
ðộ sâu tầng
ñất, cm
Ca++ Mg++
K+ Na+ Tổng ðất Sét
BS,%
0-10 8.91 5.64 1.21 0.14 15.90 29.44 47.99 54.0
10-35 4.50 4.28 0.26 0.14 9.18 21.79 41.84 42.0
35-55 4.20 4.62 0.97 0.14 9.93 20.32 34.34 48.9
55-80 4.62 4.85 0.69 0.14 10.30 20.40 34.48 50.5
80-105 4.32 4.05 0.90 0.23 9.50 18.64 47.90 51.0
Nguồn: Viện Nông hóa Thổ nhưỡng
18
ClNO
6
; ochratoxin A ñộc là
do sự ghép một nhân phenylalanin và một nhân izocumarin khi phân hủy nó
tạo ra dyhydro – izocumarin ñây là chất gây ñộc.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9
* Ochratoxin B: Công thức phân tử C
20
H
19
NO
6
là dẫn xuất dechloro
ochratoxin A
* Ochratoxin C: Công thức phân tử C
20
H
22
ClNO
6
là ethyl este của
ochratoxin A
.Cm
-1
)
Ánh sáng
huỳnh quang
A 403 330 169 5550 Xanh lục
B 369 320 221 6000 Xanh lam
C 431 330 - 6200 Xanh lam
2.2.4. ðộc tính của ochratoxin A
Sự nhiễm ochratoxin A ở một số sản phẩm thực vật và ñộng vật ñã ñược
thông báo rộng rãi, có sự thay ñổi lớn hàm lượng ochratoxin A ở các hạt
lương thực trong thời gian bảo quản do ñiều kiện khí hậu (Nguyễn Văn
Thường, 2006).
Thận là cơ quan nhạy cảm nhất ñối với ochratoxin A như có thể gây ra
thương tổn cấp tính cũng như mãn tính cho thận. Thêm vào ñó, tác dụng của
ñộc tố ñối với hệ miễn dịch và tác dụng gây quái thai của ochratoxin cũng ñã
ñược xác ñịnh. Ochratoxin A cũng là một chất có khả năng gây ung thư. Thí
nghiệm cho chuột uống ochratoxin A trong hai năm ở các liều từ 3500-6000
µg/kg trọng lượng cơ thể chuột cái và 70µg/kg trọng lượng cơ thể/ ngày ở
chuột ñực, ñã kích thích tạo các u ở thận (Abbas Z & cs, 2013).
Tác dụng ñầu tiên của ochratoxin A vào cơ thể là ức chế sinh tổng hợp
protein. Tác dụng là ñặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp
phenylalanin tRNA
Phe
là quá trình cần thiết cho các bước acyl hoá axit amin cơ
bản trong sinh tổng hợp protein.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 12
- Các nấm mốc tạo ochratoxin ở chi Penicillium gồm: P. verrucosum, P.
viridicatum, P. chrysogenum, P. conmune, P. cyclopium, P. expansum, P.
palitans, P. purpurescence, P. nordiceum, P. Variable (Pitt et Hocking,
1997), chủ yếu gây ô nhiễm trên hạt ngũ cốc
- Ochratoxin A ñược sinh ra bởi các loài nấm mốc Aspergillus niger chủ
yếu nhiễm trên ngũ cốc, hạt có dầu, thức ăn chăn nuôi và cà phê (Abarca et al.
Năm 1994; Belli et al, 2004.)
Việc phòng chống nấm mốc A. niger và A. ochraceus sinh ochratoxin A
trên ngô và cà phê ñã ñợc nhiều nhà khoa học của các nước như Brazin, Pháp,
Mỹ nghiên cứu. Fernado E. và Francisco ñã phát hiện rằng trong số 11 chủng
Penicillium sống nội sinh trong cây cà phê, 4 chủng có khả năng tạo ochratoxin
A là P. brevicompactum,
P. crustosum, P. olsonii and P. Oxalicum (Fernando,
Francisco, 2006)
Ochratoxin ñược tạo ở nhiệt ñộ tối thích từ 20°C ñến 30°C và hoạt tính
0,953 (39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt ñộ
thấp 15°C, hàm ẩm yêu cầu cao hơn a
w
= 0.997 hay 52% hàm lượng nước. Các
loài nấm mốc Penicillium thường tạo ochratoxin trong ñiều kiện nhiệt ñộ
thấp, chẳng hạn P. viridicatum có khả năng tạo ochratoxin A ở 5°C – 10°C.
Trong khi ñó, các loài thuộc Aspergillus tạo ochratoxin ở nhiệt ñộ cao hơn.
2.3.2. Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A
Dựa trên một mô hình ñồng phân hóa học theo cấu trúc của OTA một
(DH), enoyl reductase (ER), ketoreductase (KR) và thioesterase (TE)
(Graziani & cs, 2004). Sự hiện diện hay vắng mặt của các phản ứng trong một
PKS quyết ñịnh về loại polyketide hình thành. PKSs sản xuất cao giảm
polyketides có thể tùy chọn trong những KR, DH và ER; PKSs sản xuất một
phần polyketides giảm chứa KR hoặc DH, trong khi PKSs sản xuất
polyketides không giảm thì không hề chứa các dạng này (Fujii & cs, 2001).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 14Hình 2.1. Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A
2.3.3. Sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản thực phẩm
Ochratoxin A ñã ñược tìm thấy trên các loại nông sản như ngô, lạc, lúa
mì, ñại mạch, cà phê, bia, nho, các loại thức ăn gia súc. Ochratoxin A ñã tìm
thấy trong máu của người ở các nước như Bulgari, Hungari, Nhật bản,
Copyright: Tài liệu đại học ©