Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả
năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5.1
tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli Trần Thị Nhài

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS Trƣơng Nam Hải
Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan về virus cúm và biểu hiện gen: cấu trúc và khả năng gây bệnh của
virus cúm; Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ; Cấu trúc,
chức năng của HA và NA; Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A; Vaccine phòng
cúm A/H5N1; Hệ biểu hiện E. coli; Chủng biểu hiện E. coli BL21; Vector biểu hiện
pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin. Trình bày các phƣơng pháp nghiên
cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1
tái tổ hợp biểu hiệu trong Escherichia Coli. Đƣa ra kết quả và thảo luận: thiết kế vector
biểu hiện PET22TRXHA5-1; biểu hiện GEN HA5-1 trong chúng vi khuẩn E. COLI
BL21; lựa chọn điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp TRXHA5-1 trong E. COLI; tinh
chế sơ bộ protein tái tổ hợp TRXHA5-1; kiểm tra tính sinh đáp ứng miễn dịch của protein
tái tổ hợp HA5-1

Keywords: Miễn dịch; Virus cúm; Protein tái tổ hợp; Sinh học Content
MỞ ĐẦU


u tru
́
c của virus cúm
Đặc tính cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ Orthomyxoviridae là hệ gen của
chúng chỉ chứa duy nhất ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu là ss(-) RNA.
Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đƣờng kính 80 -120 nm,
đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da.
V virus với bản chất là protein có ngun gốc từ màng tế bào nhiễm đã đƣợc đặc hiệu
hóa để gắn protein màng của virus vào , bao gồm mô
̣
t số protein đƣơ
̣
c glycosyl ho
́
a va
̀
mô
̣
t số
protein da
̣
ng trần không đƣơ
̣
c glycosyl ho
́
a .

Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B) và phức hợp ribonucleoprotein RNP
(C) của virus cúm A. A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dƣới kính hiển vi điện
tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A; C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ
gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình
phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích.
Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tƣợng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen kháng
nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép
virus có khả năng biến chủng rất cao.
1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine đƣợc coi là biện pháp có tính chiến lƣợc, nhằm ngăn
chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch.
Hiện nay có 3 loại vaccine đƣợc bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là: Vaccine vô hoạt
nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc: đây là loại vaccine dị chủng; vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N1 (Trung
Quốc): là loại vaccine đng chủng; vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5 (Hà lan): là loại
vaccine dị chủng.
Hiện có 3 cơ sở đang nghiên cứu thử nghiệm loại vaccine virus phòng bệnh cúm gia cầm
H5N1 cho cả ngƣời và gia cầm nhƣ:
+ Công ty Vắc xin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) của Viện Vệ sinh & Dịch tễ Trung
Ƣơng;
+ Viện Pasteur TP.HCM,
+ Viện Vaccine & Chế phẩm sinh học Nha Trang.
1.2 BIỂU HIỆN GEN
1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli
Việc sử dụng rộng E. coli dựa vào những ƣu điểm nổi bật là: thao tác trên vật liệu di truyền
dễ, có thể biểu hiện các protein ngoại lai lên đến 50% protein tổng của tế bào, biểu hiện lƣợng lớn
protein ngoại lai khi tốc độ tăng trƣởng của tế bào cao và mật độ tế bào đủ lớn, môi trƣờng nuôi cấy
đơn giản và rẻ.
1.2.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21
Chủng biểu hiện E. coli BL21, gen lon protease (một protease nội bào) và ompT protease (một
protease định khu ở màng ngoài) đã bị đột biến. Vì vậy, protein ngoại lai sẽ ít bị phân cắt bởi
protease của tế bào chủ.

2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy
2.1.4.1 Môi trƣờng và dung dịch sử dụng trong biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli DH5α
2.1.4.2 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli DH5α
2.1.4.3 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose
2.1.4.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn
2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid
2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E. coli
2.2.5 Điện di DNA trên gel agarose
2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose
2.2.7 Điện di protein trên gel polyacrylamide
2.2.8 Biểu hiện protein tái tổ hợp
2.2.9 Tinh sạch sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê
2.2.10 Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1
2.2.11 Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà
2.2.11.1 Gây miễn dịch và thu huyết thanh gà
2.2.11.2 Phản ứng ngăn trở ngƣng kết hng cầu (HI)

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1
3.1.1. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx
Thu nhận đoạn gen ha5-1 từ plasmid pCRha5-1 và mở vòng vector pET22Trx bằng cặp
enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI. Sau đó nối đoạn gen ha5-1 vào vactor biểu hiện pET22Trx
để tạo nên vector tái tổ hợp pETTrxha5-1.

Trên các đƣờng chạy từ số 2 đến số 5 tƣơng ứng với sản phẩm cắt của dòng plasmid tái tổ
Hình 3.2: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid trên gel agarose 0,8%.
1-4: Plasmid ta
́
i tô
̉
hơ
̣
p pET22Trxha1; 5: Plasmid đối chƣ
́
ng (pET22Trx) pET22Trxha5-1
1 2 3 4 5

pET22Trx
5.9 kb
pET22Trx
Ha5-1
1 kb
1 2 3 4 5 M
Hình 3.3: Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha5-1)
bằng enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI . 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng) ; 2-
5: các dòng plasmid tái tổ hợp; M: Thang ADN chuẩn 1Kb (Fermentas).

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng ở nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C và thu mẫu sau 4
giờ nuôi cấy cảm ứng.

Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 mang vector
pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các nhiệt độ khác nhau; 1-4 :
Nhiệt độ cảm ứng tƣơng ứng 22
o
C, 28
o
C, 30
o
C, 37
o
C; 5:Thang protein chuẩn

kDa
116
66
45
35
25

0,5; 1,0; 1,5; và 2 mM).

Nhƣ vậy để đảm bảo thu đƣợc lƣợng lớn protein, đng thời tiết kiệm chi phí sản xuất chúng
tôi lựa chọn nng độ IPTG là 0,5 mM để biểu hiện protein tái tổ hợp.

3.3.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp
Thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lƣợng TrxHA5-1. Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng E.coli BL21 mang vector
pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các thời gian thu
mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu 1, 2, 3, 4, 5 giờ; 6: Thang

18.4
14.4

Kết quả (Hình 3.8) cho thấy lƣợng protein thu đƣợc cao nhất sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng .
3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1

Kết quả (Hình 3.9, đƣờng chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu đƣợc sau khi loại b pha tan là
khá sạch, đƣợc thể hiện một băng protein có kích thƣớc khoảng 57,5 kDa khá đậm và sạch hơn
rất nhiều so với protein ban đầu.
Đối với protein tái tổ hợp sử dụng trong vaccine, một điểm rất quan trọng là phải có
tính kháng nguyên giống với tính kháng nguyên của protein tự nhiên. Vì lý do này, protein
sau khi tinh chế sẽ đƣợc tiến hành thử khả năng đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus
cúm A/H5N1 thu đƣợc từ th bằng kỹ thuật Western blot.
TrxHA5-1
kDa
116
66
45
35
25
18.4
14.4
1 2 3
TrxHA5-1
kDa
116
66
35
25
18.4
14.4

màu có kích thƣớc tƣơng ứng với gen TrxHA5-l. Trong khi đó trên đƣờng chạy số 1 xuất hiện
băng protein rất rõ nét, kích thƣớc khoảng 57,5 kDa có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể
kháng virus cúm A/H5N1. Điều đó chứng t kháng nguyên tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tổng hợp
trong E. coli với trình tự amino acid chính xác chứa các quyết định kháng nguyên nằm trên tiểu
phần ha5-1.
3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-
1
Protein TrxHA5-1 sau khi tinh chế đƣợc trộn với tá chất Freund dùng để tiêm, tá chất Cbt
dùng để nh mũi (gà 2 tuần tuổi). Lƣợng kháng nguyên TrxHA5-1 sử dụng để tiêm và nh mũi
là 100 µg. Sau khi gây miễn dịch lần 1 đƣợc 14 ngày, gà đƣợc gây miễn dịch lần 2. Huyết thanh
của gà sau khi tiêm và nh mũi, mắt đƣợc thu lại sau mỗi tuần trong 5 tuần.

- Protein tái tổ hợp đảm bảo tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch trên gà. Tuy nhiên
hiệu giá kháng thể thu đƣợc sau khi gây miễn dịch với liều 100 g TrxHA5-1 còn thấp. Hiệu giá
tối đa thu đƣợc khi gây miễn dịch bằng đƣờng tiêm là 2,7 log2, gây miễn dịch qua đƣờng nh
mắt, mũi là 2,2 log 2.
ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu liều vaccine thích hợp để thu đƣợc đáp ứng miễn dịch cao trên gà với hiệu
giá HI ngang bằng với vaccine thƣơng phẩm.
References
Tiếng Việt
1. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Nguyễn
Thị Bích Nga và Lê Trần Bình (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the
highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during”, 68-71. Proceedings of
International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006). Nong Lam
University Ho Chi Minh City.
Tiếng Anh
2. Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N. (2007), “Influenza virus susceptibility and resistance to
oseltamivir”, Antivir Ther 12(4B), PP. 603-616, Review.
3. Baigent S. J., McCauley J. W. (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of
neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture”,
Virus Res 79(1-2), PP 177-185.
4. Basler C. F. (2007), “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect
Disord Drug Targets 7(4), PP 282-293, Review.
5. Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W.
and Subbarao K. (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1)
viruses isolated from humans in 1997 – 1998”, Virology 254, pp 115-123.
6. Bosch F. X., Garten W., Klenk H. D., Rott R. (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus
hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2

20. Kash J.C., Goodman A.G., Korth M.J., Katze M.G. (2006), “Hijacking of the host-cell
response and translational control during influenza virus infection”, Virus Res 119(1), PP
111-120, Review.
21. Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S.,
Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R. A., Osterhaus A. D.,
Payungporn S., Theamboonlers A. and Poovorawan Y. (2005), “Characterization of the
hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different
avian species in Thailand”, Acta Virol 49(4), PP 277-280.
22. Li S., Liu C., Klimov A., Perdue M. L., Mo D., Ji Y, Woods L., Hietala S., Bryant M. (1999),
"Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97
(H5N1) viruses", Infect Dis 179, PP 55-60.
23. Macken C.A., Webby R.J., Bruno W.J. (2006), “Genotype turnover by reassortment of
replication complex genes from avian influenza A virus”, J Gen Virol 87(10), PP 2803-
2815.
24. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R. (1999), “The surface glycoproteins of
H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have
distinguishable properties”, J Virol 73, PP 1146-1155.
25. Murphy B. R., Webster R. G. (1996), Orthomyxoviruses, In Fields BN, Knipe DM, Howley
PM, (eds.), Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PP 1397-
1445.
26. Nayak D., Hui E., Barman S. (2004), “Assembly and budding of influenza virus”, Virus Res
106(2), PP 147-165.
27. Neumann G., Hatta M., Kawaoka Y. (2003), “Reverse genetics for the control of avian
influenza”, Avian disease 47, PP 882-887.
28. Nicholson K. G., Wood J. M., Zambon M. (2003), “Influenza”. Lancet 362 (93970), PP
1733-1745.
29. OIE - World organisation for animal health (2005), “Avian influenza. Manual of diagnostic
test and vaccines for terrestrial animals.
30. Robertson B. H., Bhown A.S., Compans R.W., and Bennett J. C. (1979), “Structure of the
membrane protein of influenza virus. Isolation and characterization of cyanogens bromide

43. Yamada S., Suzuki Y., Suzuki T., Le M. Q., Nidom C. A., Sakai-Tagawa Y., Muramoto Y.,
Ito M., Kiso M., Horimoto T., Shinya K., Sawada T., Kiso M., Usui T., Murata T., Lin Y.,
Hay A., Haire L. F., Stevens D. J., Russell R. J., Gamblin S. J., Skehel J. J., Kawaoka Y.
(2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A
viruses to human-type receptors”, Nature 444(7117), PP 378-382.
44. Zhou J. J., Fu J., Fang D. Y., Yan H. J., Tian J., Zhou J. M., Tao J. P., Liang Y., Jiang L. F.
(2007), “Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1
influenza virus isolated from a human in Guangdong, China”, Arch Virol 152(8), 1515-
1521.