1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN THỊ NHÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ
NĂNG SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN HA5-1
TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN TRONG ESCHERICHIA COLI
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Hà Nội – 2012
52
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM 5
1.1.1 Sơ lƣợc về cấu trúc và khả năng gây bệnh của virus cúm 5
1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 7
1.1.3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA 9
1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A 11
1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1 12
1.2 BIỂU HIỆN GEN 14
1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli 14
1.2.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21 15
1.2.3 Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin 16
KẾT LUẬN 45
ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
PHỤ LỤC
3
MỞ ĐẦU
Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm
A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Nhóm virus cúm A có 16 phân type
hemagglutinin (HA) (từ H1 đến H16) và 9 phân type neuraminidase (NA) từ N1
đến N9) có khả năng tái tổ hợp để tạo nên rất nhiều phân type khác nhau về độc tính
và khả năng gây bệnh. Trong đó chủng virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI -
High Pathogenic Avian Influenza) là chủng gây ra dịch bệnh chủ yếu ở nhiều quốc
gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam.
Virus cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên được phân lập từ người ở Hồng
Kông vào năm 1997 sau khi đã có một số vụ dịch bùng phát ở gia cầm. Cho tới nay,
chủng virus A/H5N1 thường xuyên thay đổi kháng nguyên bề mặt thông qua đột
biến và tái tổ hợp di truyền của những biến thể.
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã
(chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó
kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá
trình lây truyền ở tự nhiên [20, 14]. Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong
tự nhiên, virus cúm A biến đổi để có thể xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian
khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và
cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại
loài” như gà - lợn; gà - lợn - người.
Tính đến năm 2011 dịch cúm A/H5N1 đã xuất hiện ở hơn 50 quốc gia khác
nhau ở châu Á, châu Âu, châu Phi và có nguy cơ lan rộng khắp thế giới. Theo thông
5
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM
1.1.1 Sơ lƣợc về cấu trúc và khả năng gây bệnh của virus cúm
Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là:
nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus
cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi các
kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus
cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là
Glycoprotein (GP) [18, 25].
Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm
A gây nên. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA và 9 phân type NA, sự tái tổ
hợp giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác
nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan
trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA) hoặc trao đổi
các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền
giữa các loài vật chủ.
Đặc tính cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ Orthomyxoviridae là
hệ gen của chúng chỉ chứa duy nhất ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu là
ss(-) RNA (negative single stranded RNA).
Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính
80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu
Da. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 -
75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn
giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm [25].
được gọi là virus hướng đa phủ tạng [28, 38]. Khả năng gây bệnh của virus cúm A
phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus. Thông
thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của
chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7 và H1,
H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch
cúm ở gia cầm và ở người [33, 43]. Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất
tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân
type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp
chưa được nhân lên nhiều và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang,
chuột Hamster, chồn đất [14, 17].
Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống
lại virus. Tuy nhiên đáp ứng miễn dịch này có thể không có tác dụng bảo vệ cho
những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên trong quá
trình lưu hành tự nhiên và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus
cúm A [38]. Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng
nguyên khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít có đáp
ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới. Đây là nguyên nhân làm
cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm và các đợt
dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới
[12]. Virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân của các đại dịch cúm trên
người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người [18]. Các chủng này vẫn
thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm ở người và trong quá trình tồn tại,
chúng vẫn biến đổi kháng nguyên liên tục [16]. Đây là nguồn virus có khả năng trao
đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm, để thích ứng lây nhiễm
gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người [10, 37, 38, 40].
1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên
của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ
thể nhiễm [25, 28] và có những nét đặc trưng như sau:
tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.2).
Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên
mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi”
của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với
RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng
“nảy chồi” tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết
giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải
phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [25, 26].
1.1.3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA
Hai protein HA và NA là các protein chính trên bề mặt capsid, đặc trưng cho
bản chất của từng chủng virus cúm A [21, 25].
Protein HA (hemagglutinin)
Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin),
có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm, kháng thể đặc hiệu với
HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết
hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody).
Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích
thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, được coi
là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là
đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể
nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [6, 17, 21, 24].
Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn
phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA
1
(36
10
kDa) và HA
2
gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi
áo giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình
nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [36]. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết
glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô
đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát
11
khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3
khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus
cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế
virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong
tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ
cơ thể [8].
Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích
thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA
[12]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích
chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở điều
chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch
cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [31, 42].
1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
Do kháng nguyên HA và NA của virus thường xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất
khó kiểm soát.
Có hai phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [42].
Hiện tượng lệch kháng nguyên
Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các
phân đoạn gen/hệ gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản
sao - proof reading” trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự
thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ
Hiện nay có 3 loại vaccine được bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là:
- Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc): được tạo ra bằng cách vô hoạt
virus A/Turkey/England/N-28/73 (H5N2). Đây là loại vaccine dị chủng (là vaccine
sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa,
nhưng có kháng nguyên NA dị chủng) .
- Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): là loại vaccine đồng chủng, sử
dụng chủng virus A/Harbin/Re-1/2003 (H5N1).
13
- Vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5 (Hà lan): đây là loại vaccine dị chủng,
sử dụng chủng virus A/Chicken/Mexico/232/94/CPA (H5N2).
Vaccine vô hoạt được tạo ra bằng cách nuôi virus trong trứng và làm vô hoạt
virus bằng hóa chất hoặc nhiệt độ cao. Chủng virus được chọn để sản xuất vaccine
vô hoạt thường là các chủng có độc lực thấp (LPAI) có chung kiểu protein HA với
chủng đang gây dịch [19]. Vaccine vô hoạt thích hợp để bảo vệ gà trưởng thành, gà
tây và các loại chim khác trong các trường hợp cấp thiết như khi thiết lập vòng tròn
bảo hộ trong vùng có dịch. Tuy nhiên, khi dùng cho gà con, hiệu quả của vaccine
chỉ tối ưu với gà 2-3 tuần tuổi. Vaccine không thể kích thích miễn dịch bảo hộ tốt
cho gà một ngày tuổi. Các vấn đề khác thường gặp khi sử dụng vaccine vô hoạt là:
Gây đáp ứng miễn dịch ngắn hạn, không hoàn toàn và cần phải tiêm nhắc lại
nhiều lần;
Trên thị trường hiện giờ chưa có kỹ thuật kiểm tra để phân biệt gà đã nhiễm
bệnh với gà đã được gây miễn dịch với vaccine;
Phản ứng của gà một ngày tuổi với vaccine vô hoạt có thể làm ảnh hưởng xấu
tới thể trạng hoặc khả năng đẻ trứng sau này [7].
Tuy nhiên các loại vaccine trên chỉ đáp ứng miễn dịch với chủng virus cũ là
Clade 1 và Clade 2.3.4. Đối với nhánh virus mới là Clade 2.3.2 (gồm hai nhánh con là
Clade 2.3.2-A và Clade 2.3.2-B đang ngày càng có xu hướng bùng phát rộng, trải dài
từ các tỉnh phía Bắc vào các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt là nhánh 2.3.2-
Sản xuất vaccine phòng cúm A/H5N1 bằng kĩ thuật di truyền ngược cũng đã
đạt được một số thành tựu đáng kể, tuy nhiên mặt hạn chế về quy trình sản xuất
phức tạp, tốn kém và đòi hỏi thời gian sản xuất dài. Vì vậy vaccine dưới đơn vị là
một trong những phương thức tiếp cận mới, cho phép sản xuất vaccine trong một
thời gian ngắn và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất.
1.2 BIỂU HIỆN GEN
1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli
Escherichia coli là vi sinh vật thường được sử dụng và tiêu biểu nhất để biểu
hiện các protein ngoại lai và các protein nội tại. Việc sử dụng rộng E. coli dựa vào
những ưu điểm nổi bật là: thao tác trên vật liệu di truyền dễ, có thể biểu hiện các
15
protein ngoại lai lên đến 50% protein tổng của tế bào, biểu hiện lượng lớn protein ngoại
lai khi tốc độ tăng trưởng của tế bào cao và mật độ tế bào đủ lớn, môi trường nuôi cấy
đơn giản và rẻ.
Bên cạnh những ưu điểm trên, hệ biểu hiện E. coli còn tồn tại những nhược
điểm sau: Thứ nhất, protein quan tâm không chứa methionine hoặc formyl methionine
ở tận cùng đầu N làm mất một số tính chất quan trọng của protein; Thứ hai, các protein
có nguồn gốc từ Eukaryote không bền, cấu trúc không gian không đúng so với dạng tự
nhiên, do hệ biểu hiện E. coli không có khả năng thực hiện quá trình glycosyl hóa hay
phosphoryl hóa sau dịch mã.
Để đạt được mức độ biểu hiện cao, cần có hệ thống vector biểu hiện phù
hợp nhằm cung cấp các yếu tố di truyền cho sự kiểm soát quá trình phiên mã,
dịch mã, độ bền của protein và quá trình tiết protein khỏi tế bào vật chủ. Ngoài
ra, tùy mục đích, mà vector có thể chứa đoạn peptid tín hiệu để làm dấu hiệu cho
sự tiết của protein tái tổ hợp ra ngoài tế bào chất hay đuôi Histidine tạo thuận lợi
cho quá trình tinh sạch sau này.
1.2.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21
Trong quá trình biểu hiện, protein ngoại lai có thể bị phân giải bởi các
galactosidase [22]. Trong trường hợp này, chúng tôi biểu hiện gen ha5-l (gen mã
hóa cho tiểu phần HA1 của virus cúm H5N1) cùng với gen trxA. TrxA là đoạn
peptide nhỏ 109 axit amin có khối lượng phân tử 11,675 kDa. Thioredoxin được
biết như là tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên khi gây miễn
dịch cho gia cầm. Ngoài ra, các peptide, protein dung hợp cũng được biết là có khả
năng giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bởi protease, đồng thời hình thành
cấu trúc bậc 3 chính xác hơn [15]. Giữa đoạn gen mã hóa thioredoxin và vùng đa
nối để nhận gen ngoại lai là đoạn DNA mã hóa enterokinase hay thrombin. Hai
enzyme này có thể được sử dụng để cắt bỏ thioredoxin dung hợp ra khỏi protein
ngoại lai khi cần thiết. Ngoài ra, đoạn peptide dung hợp Thioredoxin còn chứa
DNA mã hóa 6 Histidine nằm ở hai đầu, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tinh chế
protein ngoại lai [30].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pET22trx để biểu hiện gen
ha5-1 trong hệ biểu hiện E. coli BL21 .
17
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α được sử dụng để tách dòng gen trxha5-1;
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 được sử dụng để biểu hiện gen ha5-1
- Plasmid pET22b(+) do hãng Novagen sản xuất, mang gen trx do phòng kĩ
thuật di truyền thiết kế;
- Plasmid pCR2.1 do hãng Invitrogen sản xuất, mang gen ha5-1 (pCRha5-l)
do phòng Kĩ thuật di truyền thiết kế.
2.1.2 Hóa chất và enzym
* Hóa chất:
SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); X-Gal (Sigma, Mỹ); phenol, metanol
isoamylalcohol, EtBr, glyxerol, IPTG, etanol, chloroform (Roth, Đức); agan (Fluka,
Dung dịch II (Sol II): NaOH (0,2 M); SDS (1%).
Dung dịch III (Sol III): potassium acetate 3 M; acetic acid 11,5%.
(Dung dịch I và III được giữ ở 4°C; dung dịch II được chuẩn bị trước khi sử dụng)
TE: Tris-HCl 1 M, pH 8; EDTA 0,5 M, pH 8.
Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol: 50 phenol : 49 chloroform : 1
isoamylalcohol.
Gel agarose 0,8%: 0,8 g bột agarose pha trong TAE và dẫn đến 100 ml.
2.1.4.3 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose
Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml): 24,2% tris-base; 5,71 ml acetic acid;
10 ml EDTA 0,5 M (pH 8).
Đệm tra mẫu (6X) (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 0,25% xylen
cyanol FF; 30% glycerol.
Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml.
19
2.1.4.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS
Bis-Acrylamide 30%: cân 29,2 g acrylamide và 0,8 g bis-acrylamide, hòa
trong nước cất vô trùng ấm cho tan đều, sau đó dẫn đến 100 ml. Bảo quản ở 4°C.
Đệm Tris 1,5 M (pH 8,8): 27 g Tris được hòa vào một ít nước, bổ sung
thêm 2 ml HCl đậm đặc sau đó điều chỉnh pH xuống 8,8 bằng HCl và dẫn
nước tới 150 ml.
Đệm Tris 0,5 M (pH 6,8): 3 g Tris được hòa vào nước, điều chỉnh pH đến
6,8 bằng HCl và dẫn nước đến 50 ml.
SDS 10% (100 ml): cân 10 g SDS hòa tan vào nước và dẫn nước tới 100 ml.
Đệm chạy điện di: Tris 0,025 M pH8,3; glycine 0,192 M; SDS 0,1%.
Dung dịch nhuộm gel: 0,025 g commassie brillian blue; 40 ml methanol; 10
ml acetic acid, bổ sung nước tới 100 ml.
Dung dịch rửa gel 1: 40 ml methanol; 10 ml acetic acid; bổ sung nước cất tới
thể tích 100 ml.
µl bao gồm các thành phần:
¬
- Nước khử ion vô trùng
:
15,8µl
- Dung dịch đệm thích hợp 10x (của enzyme
:
2 µl
- DNA plasmid (100 µg/ml)
:
2 µl
- Enzyme hạn chế (10 u/µl)
:
0,2 µl
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy vào
loại enzyme (thường là tại nhiệt độ 37°c trong 2 giờ). Sản phẩm của phản ứng được
tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Hóa chất
Gel tách (12%)
Gel cô (4%)
l. ddH20
2,00 ml
0,8 ml
2. Tris-HCl 1,5 M
1,50 ml
(1,5 M, pH8,8)
0,5 ml
(0,5 M, pH6,8)
3. Glycerol 50%
0,06 ml
- H
2
O
:
1 µl
- Đệm 10x của T4-ligase
:
1 µl
- Đoạn DNA cần ghép nối
:
6 µl
- Vector pET22Trx
:
1 µl
- T4- ligase (1 µl)
:
1 µl
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 16
o
C trong 3 giờ.
2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp
sốc nhiệt
Tạo tế bào khả biến
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc 200
vòng/phút ở 37
o
C qua đêm.
- Hút 0,5 ml dịch nuôi cấy chuyển sang 50
ml môi trường LB lỏng, tiếp tục cấy
- Đưa mẫu sang bể ổn nhiệt đã đặt trước nhiệt độ 42°C và ủ trong 1,5 phút.
- Lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt rồi đặt trên đá trong 2 phút.
- Bổ sung vào dịch mẫu khoảng 500 - 600 µl LB lỏng, lắc ở 37°C trong 45 - 50 phút.
- Hút 100 µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung
Ampicillin 100 µg/ml. Ủ đĩa ở 37°C qua đêm.
2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E. coli
Cơ sở lý thuyết
Các tế bào E. coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng thì được ly
tâm thu lại. Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt
(SDS, NaOH). Sau đó DNA hệ gen và protein được tủa lại bằng muối potassium
acetate, phần tủa bị loại bỏ khỏi dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm. DNA
plasmid được tủa lại bằng ethanol và loại bỏ RNA bằng cách bổ sung RNase.
Quy trình
- Cấy chuyển một khuẩn lạc riêng rẽ vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường
LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100 µg/ml), nuôi cấy lắc qua đêm ở
37°C, 200 vòng /phút.
23
- Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 5 phút, tốc
độ 5000 vòng/phút, thu tủa tế bào.
- Hòa tan tủa tế bào thu được vào 100 µl dung dịch I bằng máy Vortex. Từ lúc
này, các thao tác với mẫu được thực hiện ở nhiệt độ lạnh.
- Bổ sung 200 µl dung dịch II. Đảo nhẹ nhàng để tránh đứt gãy DNA nhiễm
sắc thể, ủ trong đá 5 phút, hỗn dịch sẽ trở nên trong suốt và quánh.
- Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, lắc nhẹ và ủ trong đá 20 phút, tủa protein
xuất hiện và có màu trắng đục.
- Hút 450 µl phenol/chloroform/isoamylalcohol cho vào mẫu và lắc nhẹ để
các protein nhỏ hòa tan vào dịch có phenol, sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong
15 phút. Lúc này mẫu hình thành 3 pha: pha trên cùng có chứa DNA plasmid, pha
- Nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X
tới khi ngập mặt gel.
Tra mẫu DNA vào giếng
- Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng
độ DNA cao thấp khác nhau.
- Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TAE 1X vào khuôn điện di cho ngập gel. Mẫu
được trộn với loading dye 6X rồi được đưa vào giếng. Chạy điện di bằng dòng một
chiều với hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phút. Quan sát sự di chuyển băng
màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di.
Nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide
Khi băng màu bromophenol chạy được 2/3 bản gel agarose, ngừng chạy điện
di và nhẹ nhàng gỡ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5
µg/ml trong khoảng 10 phút, rửa lại bằng nước.
Quan sát và chụp ảnh
Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát và chụp lại dưới ánh sáng tử
ngoại λ=302 nm.
2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose
Cơ sở lý thuyết
Đây là phương pháp tinh sạch DNA dựa trên nguyên lý sử dụng một cột có
chứa mạng lưới các sợi thủy tinh để bắt giữ các phân tử DNA sợi kép đã được gắn
với các hạt ion trong đệm gắn. Khi hỗn hợp DNA đi qua cột, các phân tử DNA sẽ
bị gắn vào mạng lưới, còn các thành phần khác như protein, muối sẽ bị rửa trôi.
Copyright: Tài liệu đại học ©