PHẠM THỊ THU PHƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
=======***=======

PHẠM THỊ THU PHƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM
SYNBIOTIC TỪ VI KHUẨN SINH BÀO
TỬ VÀ XYLOOLIGOSACCHARIDE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

KHÓA: 2010 - 2012

HÀ NOI - 2012

LỜI CẢM ƠN


Trong quá trình thực hiện luận văn này, em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ, khích lệ, động viên của các Thầy, Cô giáo, các cán bộ nghiên cứu,
bạn bè và những người thân trong gia đình.
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
TS. Nguyễn Thị Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Công nghệ Sinh
học (CNSH), Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (KH&CN), người đã hết
lòng hướng dẫn, chỉ bảo em từng bước đi của đề tài, và cũng là người đã ủng
hộ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em cả về thời gian, kinh phí nghiên cứu và

NỘI DUNG .................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1 Thực phẩm chức năng (Functional foods) ............................................ 4
1.2 Prebiotic .................................................................................................. 5
1.2.1 Khái niệm về prebiotic........................................................................... 5
1.2.2 Oligosaccharide - chất xơ thực phẩm có hoạt tính prebiotic.................. 6
1.2.3 Xylooligosaccharide .............................................................................. 8
1.3 Probiotic ................................................................................................ 10
1.3.1 Giới thiệu về probiotic ......................................................................... 10
1.3.3 Vi khuẩn sinh bào tử Bacilllus ............................................................. 14
1.4 Synbiotic................................................................................................ 18
1.4.1 Giới thiệu về synbiotic ......................................................................... 18
1.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của synbiotic ................................. 19
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 23
2.1 Nguyên liệu .......................................................................................... 23
2.1.1 Chủng vi sinh vật ................................................................................. 23
2.1.2 Mẫu động vật....................................................................................... 23
2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 23
2.1.4 Thiết bị chính....................................................................................... 23
2.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 24
2.2.1 Đo mức độ tăng trưởng tế bào ............................................................. 24
2.2.2 Định lượng xylose và XOS ................................................................... 24
2.2.3 Sắc ký lớp mỏng định tính đường XOS ................................................ 25
2.2.4 Định lượng axit béo bằng sắc ký khí ................................................... 25


2.2.5 Đánh giá độc tính cấp ......................................................................... 26
2.2.6 Đếm quần thể vi khuẩn ........................................................................ 26
2.2.7 Nhận dạng vi khuẩn B. subtilis HU58 trong phân chuột bằng đọc trình
tự gen đoạn mã hoá ARNr 16S ..................................................................... 27

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 67
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CFU: Colony forming unit
FOS: Fructooligosaccharide
GOS: Galactooligosaccharide
NIH: Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health)
OS: Oligosaccharide
PBS: Phosphate-buffered saline
SD: Standard deviation
TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
TPCN: Thực phẩm chức năng
XOS: Xylooligosaccharide
WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Một số sản phẩm probiotic thương mại chứa bào tử Bacillus
Bảng 3.1: Hàm lượng axit butyric trong môi trường nuôi B. subtilis HU58 tại
thời điểm ban đầu (0 giờ)
Bảng 3.2: Hàm lượng axit butyric trong môi trường nuôi B. subtilis HU58 sau
24 giờ
Bảng 3.3: Tỉ lệ hình thành bào tử B. subtilis HU58 ở các thời điểm nuôi cấy
khác nhau.
Bảng 3.4: Số lượng chuột sống sau khi uống liều duy nhất chế phẩm synbiotic
P&P

chứa XOS
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58
Hình 3.8: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của B.
subtilis HU58
Hình 3.9: Ảnh hưởng của sự thông khí đến sinh trưởng của B. subtilis HU58
Hình 3.10:

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của

B. subtilis HU58
Hình 3.11: Khả năng hình thành bào tử B. subtilis HU58 ở các thời điểm nuôi
cấy khác nhau
Hình 3.12: Quy trình lên men B. subtilis HU58 ở quy mô phòng thí nghiệm
Hình 3.13: Hình ảnh khuẩn lạc B. subtilis HU58 trên môi trường LB


Hình 3.14: Hình ảnh bào tử B. subtilis HU58 trên môi trường LB
Hình 3.15: Chế phẩm prebiotic XOS; probiotic B. subtilis HU58; synbiotic
P&P
Hình 3.16: Hình ảnh vi thể cấu trúc thận
Hình 3.17: Hình ảnh vi thể cấu trúc gan
Hình 3.18: Điện di kiểm tra trên gel agarose sản phẩm ADN tổng số của
chủng vi khuẩn B. subtilis HU58
Hình 3.19: Điện di trên gel agarose các sản phẩm nhân bản đoạn gen ARNr
16S của chủng vi khuẩn B. subtilis HU58
Hình 3.20: Sự thay đổi số lượng bào tử vi khuẩn B. subtilis HU58
Hình 3.21: Ảnh hưởng của các chế phẩm chức nghiên cứu lên khả năng thực
bào của macrophage chuột
Hình 3.22: Ảnh hưởng của các chế phẩm nghiên cứu lên hàm lượng INF- 

sinh bào tử và đường xylooligosacharide (XOS).
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử có khả năng đồng hóa
XOS.
- Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn đã lựa chọn ở quy
mô phòng thí nghiệm.


3

- Tạo được chế phẩm synbiotic mới từ bào tử vi khuẩn đã lựa chọn và
XOS.
- Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm synbiotic trên mô hình in vivo
trên chuột.


4

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Thực phẩm chức năng (Functional foods)
Những thập kỷ gần đây, người tiêu dùng phương Tây có xu hướng dùng
thực phẩm không chỉ để chống đói mà để cung cấp những yếu tố dinh dưỡng
thiết yếu và cao hơn nữa là có thể đồng thời phòng chống bệnh tật [38]. Chính
vì vậy, “Thực phẩm chức năng” đã ra đời để phục vụ các nhu cầu trên và ngày
càng phát triển vì con người ngày càng muốn nâng cao sức khỏe, phòng
chống bệnh tật hơn là chữa bệnh để tránh phải trả chi phí y tế rất đắt đỏ [51].
Khái niệm “Thực phẩm chức năng” lần đầu tiên được đề cập vào những
năm 1980 ở Nhật Bản cho thực phẩm chứa những thành phần đặc biệt đem lại

chống lão hóa, TPCN duy trì dinh dưỡng (để giảm cân, tăng cân), TPCN tạo
sức khỏe sung mãn, TPCN tăng sức đề kháng giảm nguy cơ bệnh tật, TPCN
hỗ trợ phòng và điều trị bệnh tật, TPCN làm đẹp… Các TPCN có khả năng
chống lão hóa thường cung cấp các chất chống oxy hóa, chất chống các gốc tự
do, các hormone, các chất chống stress, chống thoái hóa, bổ sung Vitamin, bổ
sung khoáng chất… Các TPCN tạo sức khỏe sung mãn thường bao gồm các
vitamin, khoáng chất, axitamin, hoạt chất sinh học, những chất cần thiết cho
cấu tạo nên các cơ quan tổ chức cơ thể và cần thiết cho quá trình chuyển hóa
vật chất trong cơ thể. Còn các TPCN tăng sức đề kháng thường chứa hoạt
chất có khả năng kích thích miễn dịch thông qua hoạt hóa các tế bào miễn
dịch và tăng sinh interferon [52]. Thực phẩm bổ sung như probiotic, prebiotic
hay synbiotic là một dòng sản phẩm của TPCN và là dòng sản phẩm có khả
năng thương mại lớn nhất của TPCN.
1.2 Prebiotic
1.2.1 Khái niệm về prebiotic
"Prebiotic là một thành phần lên men chọn lọc, cho phép tạo ra những
thay đổi cụ thể, cả về thành phần lẫn hoạt động của hệ vi sinh vật trong hệ
tiêu hóa nhờ đó mang lại cho vật chủ tình trạng sức khỏe lành mạnh" [22].


6

Các prebiotic không bị tiêu hóa và hấp thu ở dạ dày và ruột non, do cơ
thể người không sinh ra các enzyme cần thiết để chuyển hóa chúng. Thay vào
đó, chúng được vận chuyển đến ruột già và được tiêu thụ bởi vi khuẩn có lợi
sống tại đây. Khi đã vào đến ruột già, các prebiotic phát huy tác dụng kích
thích sự gia tăng về số lượng cũng như hoạt động của các vi khuẩn có lợi, ví
dụ như các vi khuẩn loại Bifidobacterium hay Lactobacillus, đồng thời làm
giảm số lượng của các chủng vi khuẩn kị khí tùy ý, có hại như Escherichia
coli và Clostridia [34].

Trong những năm gần đây, nhiều OS được nghiên cứu và sử dụng trong
vai trò là một prebiotic. Điển hình có galactooligosaccharide (GOS),
fructooligosaccharide (FOS).
* Galactooligosaccharide (GOS)
Trong số các chất xơ thực phẩm khác nhau được thử nghiệm hoạt tính
prebiotic thì galactooligosaccharide rất được chú ý. GOS có chứa 3-10 phân
tử bao gồm đường đơn galactose và cuối chuỗi là đường glucose. Đây là hợp
chất có trong sữa người và gắn liền với sự cải thiện đại tràng của trẻ sơ sinh
bú sữa mẹ [7]. Sự có mặt của GOS làm tăng số lượng Bifidobacterium và
Lactobacillus trong đại tràng [54].
* Fructooligosaccharide (FOS)
FOS cũng là một nhóm điển hình có hoạt tính prebiotic đang có nhiều
trên thị trường. FOS là một chuỗi oligosaccharit ngắn từ 2-7 đơn vị bao gồm
D-fructose và D-glucose. FOS không bị tiêu hóa ở dạ dày trên và khi vào đến
đại tràng nó vẫn còn nguyên vẹn [4]. Ở đại tràng, FOS đặc biệt kích thích sự
phát triển của Lactobacillus và Bifidobacterium [67], đồng thời giúp cơ thể
chống lại sự tấn công bởi Salmonella [66].
FOS đã được công nhận là an toàn (thuộc nhóm GRAS-Generally
recognized as safe) [63] và đã được thêm vào các sản phẩm sữa chua, đồ ăn
trẻ sơ sinh, các thực phẩm bổ sung và các sản phẩm thực phẩm khác.


8

1.2.3 Xylooligosaccharide
Xylooligosaccharide (XOS) là các olygomer của đường xylose. Hiện nay
thị trường thương mại cho sản phẩm này đang tăng lên do tính chất prebiotic
đặc biệt của nó. XOS là nguồn cơ chất thích hợp cho các vi khuẩn
Bifidobacterium và Lactobacillus, là những chủng vi khuẩn phổ biến trong
đường ruột của người.. XOS có tính chất hóa lý khá đặc biệt so với các OS

kết và XOS có hiệu quả tác dụng cao hơn FOS.
* Kháng vi khuẩn
Fooks và Gibson [14] đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn Lactobacillus
plantarum 0407 và Lactobacillus pentosus 905 kết hợp với FOS, inulin, XOS
và các hỗn hợp của inulin, FOS hay FOS kết hợp XOS có hiệu quả ức chế sự
phát triển của Escherichia coli và Salmonella enteritidis.
XOS có tính axit được sản xuất từ xylan gỗ bạch dương [3] đã được thử
nghiệm tính kháng các vi khuẩn hiếu khí Gram dương và Gram âm, cũng như
kháng vi khuẩn Helicobacter pylori. Các chất này có hoạt tính kháng Bacillus
cereus ở mức độ trung bình, trong khi axit aldopentauronic, một OS có tính
axit khác, lại có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus. Tuy nhiên, các
nghiên cứu đều không phát hiện thấy ảnh hưởng của XOS lên các vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa và Proteus mirabilis.
* Các tác dụng sinh học khác
Khi cho gà con ăn thức ăn chứa XOS, Graham và cộng sự [19] đã phát
hiện thấy XOS không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của gà con, làm tăng


10

chiều dài ruột mà còn làm giảm nồng độ axit lactic trong hồi tràng và tăng
nồng độ axit butyric trong manh tràng, tăng nồng độ tổng số axit béo không
no mạch ngắn. Nghiên cứu của Hsu và cộng sự [27] trên cá chép Cyprinidae
carassius gibelio đã chứng tỏ XOS có thể sử dụng như là một chất phụ gia
thức ăn cho cá.
Các ảnh hưởng khác đối với XOS có thể kể đến là hoạt tính chống oxi
hóa (có được do sinh ra các chất thay thế phenolic), các tác dụng liên quan
đến máu và da, chống dị ứng, chống nhiễm trùng và chống viêm, hoạt động
điều hòa miễn dịch, chống hội chứng tăng lipid (hyperlipidemic) [3].
1.3 Probiotic

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.
- Tăng hấp thu chất khoáng.
- Làm giảm cholesterol huyết thanh.
- Làm tăng năng suất vật nuôi.
- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.
Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi
trường. Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ
không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức
khỏe người tiêu dùng.
1.3.1.3 Các đặc tính của probiotic
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn probiotic có những đặc tính sau
đây [2]:
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ.
- Dễ nuôi cấy.
- Không sinh chất độc và không gây bệnh cho vật chủ.
- Có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài.
- Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ
có thể sử dụng.


12

- Chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non.
- Biểu hiện hiệu quả có lợi đối với vật chủ.
1.3.1.4 Cơ chế tác động
Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động của probiotic,
nhưng phần lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh
tranh loại trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch [65].
Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi
sinh vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật trong ruột

tiêu hóa của vật nuôi thông qua thức ăn hay nước uống, tùy theo loài mà cơ
chế tác động của chúng đến vật chủ theo các phương thức khác nhau.
Các vi khuẩn lactic (các vi khuẩn chuyển hóa một số loại đường nhờ quá
trình lên men tạo acid lactic) có khả năng sản xuất các chất ức chế sự phát
triển của các vi khuẩn có hại và acid hữu cơ, làm giảm pH môi trường dưỡng
chấp trong ruột, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật hữu ích phát triển.
Chúng sinh sôi, phát triển nhanh chóng, chiếm lĩnh vị trí bám dính trên niêm
mạc đường tiêu hóa, cạnh tranh các chất dinh dưỡng đối với các vi khuẩn gây
bệnh, tăng khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng [59].
Các vi khuẩn Bacillus (nhóm có khả năng hình thành bào tử) khi được
đưa vào đường tiêu hóa (thường dưới dạng các bào tử), chúng nảy mầm và
sinh trưởng như những tế bào thực vật và sản sinh các enzyme tiêu hóa hỗ trợ
cho các enzyme nội sinh, ngoài ra chúng còn kích thích hệ thống miễn dịch ở
ruột [56].
Khác với vi khuẩn lactic và Bacillus, các nấm men probiotic (chủ yếu là
các chủng thuộc Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces boulardii) có
khả năng trung hòa độc tố của vi khuẩn, gắn kết các vi khuẩn có roi, (phần lớn
là các vi khuẩn gây bệnh) nhờ sự hiện diện của các cơ quan cảm thụ mannose
và đẩy chúng ra khỏi cơ thể qua phân, nhờ đó số lượng của các vi khuẩn có
ích tăng lên [12].


14

1.3.3 Vi khuẩn sinh bào tử Bacilllus
1.3.3.1 Giới thiệu chung về bào tử vi khuẩn
Bào tử vi khuẩn được sinh ra trong tự nhiên để giúp chúng có thể tồn tại
lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt, mà ở điều kiện đó vi khuẩn trưởng
thành sẽ bị giết chết [42]. Điểm quyết định để tạo bào tử phụ thuộc rất nhiều
vào sự suy giảm dinh dưỡng trong môi trường nuôi vi khuẩn. Nhận biết được

(kingdom) Bacteria.
Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, người ta tìm thấy bào tử
Bacillus phổ biến trong bụi, đất, nước và không khí [41], với các nhóm có
điều kiện sống đa dạng như ưa nhiệt, ưa lạnh, ưa chua, ưa mặn... [25]

Hình 1.3: Cấu trúc bào tử Bacillus dưới kính hiển vi (2 ảnh đầu), dưới kính
hiển vi TEM (ảnh thứ 3) và dưới kính hiển vi AFM (ảnh thứ 4)
Chính khả năng hình thành bào tử đã giúp các vi khuẩn Bacillus có thể
tồn tại được trong các điều kiện sống bất lợi, khắc nghiệt như nóng, lạnh,
acid, kiềm, muối... [25]
1.3.3.3 Tính an toàn của các sản phẩm probiotic Bacillus
Việc sử dụng bất kỳ một sản phẩm probiotic nào cho con người và động
vật cũng nên được đặt câu hỏi về tính an toàn của sản phẩm đó, nhất là khi nó
được tiêu thụ với số lượng lớn.