BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
٭٭٭٭
٭٭٭٭
LÊ THỊ DUNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA
VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG
KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
Mã số: 60 40 60
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Các thuốc đặc hiệu dùng để điều trị cho người mang HBV mạn tính gồm hai loại là thuốc uống và
thuốc tiêm. Thuốc tiêm gồm Interferon alfa-2b và PEG Interferon alfa-2a, đây là loại thuốc vừa ức chế
siêu vi vừa tăng cường miễn dịch nhưng đắt tiền và nhiều tác dụng phụ. Còn thuốc uống gồm
Lamivudine (LAM), Adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV) và Tenofovir (TDF)... được Cơ quan
Quản lý Thực – Dược Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng.
Ở Việt Nam hiện nay, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm
gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng
LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng
LAM. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm
thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm [26,29,39]. Asparagine (N) được
thay bởi Threonine (T) tại codon 236 trên vùng RT (rtN236T) và alanine (A) được thay bằng Valine
(V) hoặc Threonine (T) tại codon 181 trên vùng RT (rtA181V/T) được nhận biết là kháng ADV [38].
Trên thực tế, có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến như phương pháp dựa vào
kiểu hình, phương pháp dựa vào kiểu gen. Phương pháp dựa vào kiểu gen bao gồm phương pháp lai
mẫu dò Southern blot (Southern, 1975), giải trình tự trực tiếp, tạo dòng, RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), Oligonucleotide Microarrays,
PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi bằng polymerase; Karl Mullis và cộng sự,
1985), phương pháp real-time PCR,… và mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. Tuy nhiên,
do tính ưu việt của phương pháp real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác,
không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real-
time PCR để phát hiện các đột biến kháng ADV ở HBV trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm
gan B mãn.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến
rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real-
time PCR”, nhằm phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc, với giá thành thấp sẽ có ý nghĩa trong
công tác theo dõi và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B.
Mục đích của đề tài: Xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV
tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát
triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai.
1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Bệnh VGB (VG huyết thanh) là một bệnh nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới với nhiều con
đường lây truyền khác nhau. Châu Á và châu Phi là những khu vực có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất
(khoảng 180 triệu dân châu Á và châu Phi đang mang mầm bệnh, chiếm 80% trong tổng số 220 triệu
người mang mầm bệnh trên toàn thế giới) [20]. Một số bệnh nhân đã nhiễm HBV sau khi lành bệnh
vẫn còn mang mầm bệnh trong một thời gian dài, một số khác trở thành VG mạn tính kéo dài nhiều
năm hay suốt đời, dẫn đến xơ gan, ung thư tế bào gan. Do vậy, nhiễm HBV được xem là một vấn đề
sức khỏe toàn cầu.
Theo Dieter Glebe và cộng sự [26,44], HBV được xếp vào 8 kiểu gen A, B, C, D, E, F, G, H phân
bố tùy theo vùng địa dư. Kiểu gen B và C chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam.
Theo Perrillo và cộng sự [34], ADV là chất tương tự nucleoside/tide, được FDA chấp thuận sử
dụng trong điều trị những bệnh nhân mang HBV mạn tính từ năm 2005. Nó đóng vai trò như chất ức
chế lên vùng reverse transcriptase (RT) của gen HBV polymerase, và trong tất cả các trường hợp đã
hoàn toàn làm giảm nồng độ của virus. Tuy nhiên, chất ức chế này chủ yếu tác động vào sự nhân lên
của virus làm cho virus không thể tăng lên được chứ không tiêu diệt virus bằng cách phá hủy cấu trúc
của virus đã được hình thành theo Pawlotsky và cộng sự [33]. Đây là nguyên nhân của sự xuất hiện các
đột biến kháng thuốc của HBV dẫn đến điều trị thất bại và diễn tiến xấu của bệnh. Hiện tượng kháng
ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở
những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm trong các nghiên cứu của Hadziyannis và cộng sự (2005)
[27], Lok và cộng sự (2007) [30], Westland và cộng sự (2003) [40].
Theo Villet và cộng sự (2008) [39], Lok và cộng sự (2007) [30], Pawlotsky và cộng sự (2008)
[33], các đột biến chính dẫn đến hiện tượng kháng ADV của HBV trong điều trị tại vị trí rt181 và rt236
thuộc dạng đột biến điểm thay thế nucleotide này thành nucleotide khác, làm biến đổi acide amine này
thành acide amine khác.
Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện đột biến kháng ADV của HBV như giải trình tự, lai
mẫu dò (line probe assay – LiPA), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Tính đa
hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), PCR (có thể kết hợp với giải trình tự), real-time PCR (PCR định
lượng)… Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng.
PCR kết hợp với giải trình tự có công trình của Yan J. và cộng sự (2006) [39] với độ nhạy là 10
Các phương pháp áp dụng phát hiện các dạng đột biến kháng thuốc của HBV hiện nay là PCR,
giải trình tự, PCR-RFLP, real-time PCR… Một số cơ sở y tế hiện đang sử dụng một số bộ kit của nước
ngoài kết hợp với giải trình tự bằng hệ thống máy tự động.
LAM (1998) được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng điều trị sớm hơn so với ADV (2002), do vậy
ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu và phát hiện tính kháng LAM của HBV trong điều trị.
Công ty Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) sử dụng phương pháp giải trình tự trên máy CEQ8000
(Beckman Coulter) để phát hiện kiểu gen và các đột biến kháng LAM, ADV của HBV. Phát hiện đột
biến tại rt180 và rt204 kháng LAM của HBV sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP có đề tài nghiên cứu của
Nguyễn Chí Vinh [22]; sử dụng phương pháp real-time PCR có công trình nghiên cứu của Nguyễn Sử
Minh Tuyết và cộng sự [19], Nguyễn Thành Khôi và Hồ Huỳnh Thùy Dương [10].
Sử dụng phương pháp PCR và đọc kết quả qua điện di trên gel agarose 3% trong đề tài của Trần
Thiện Toàn (Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) [18]. Trong nghiên cứu này,
tác giả sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu hoang dại tại vị trí rt181, bản mẫu mang đột biến sẽ
cho kết quả âm tính (không xuất hiện vạch) trên gel dưới tia UV. Trong khóa luận tốt nghiệp, Huỳnh
Trường An (Đại học Mở, Tp. Hồ Chí Minh) [2], sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu đột biến tại
rt236 và mẫu dò phát huỳnh quang đọc tín hiệu qua mỗi chu kỳ khuếch đại.
Trên thực tế, việc lựa chọn phương pháp nào cho đúng đắn để đưa vào chẩn đoán thường quy là
không dễ. PCR kết hợp với giải trình tự hay PCR-RFLP đều là những phương pháp đòi hỏi kỹ thuật
viên có trình độ tay nghề cao, thao tác khéo léo, thời gian cho kết quả lâu, thiên về nghiên cứu nhiều
hơn là áp dụng vào thực tiễn và nhược điểm lớn nhất là độ nhạy không cao bằng real-time PCR. Với ưu
điểm trên và có thể phát hiện chính xác nồng độ virus đột biến trong quần thể, real-time PCR được xem
là công cụ hữu hiệu nhất với giá thành thấp, dùng để phát hiện các đột biến kháng ADV tại rt181 và
rt236 của HBV ở những bệnh nhân mạn tính.
1.2 Đại cương về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B
1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B [6,7]
Lịch sử của các loại VGVR thực ra là lịch sử của các bệnh vàng da (hoàng đảm), vì hội chứng
này đã được ghi nhận rất lâu trong lịch sử loài người với nhiều bệnh khác nhau có thể gây nên vàng da.
Vàng da có thể chỉ là một dấu hiệu của một bệnh toàn thân, hay là một bệnh chủ yếu ở lá gan. Bệnh ở
nguyên Australia chỉ được tìm thấy trong huyết thanh người nhiễm VRVGB, từ đó VRVGB mới được
nhận biết và được xác lập đặc điểm.
Blumberg nhận giải Nobel Y học vào năm 1976 nhờ phát hiện này.
Từ năm 1942-1967, các nghiên cứu thực nghiệm viêm gan được thực hiện trên chính con người
(Đức và Mỹ) đã bị nhiều người phê phán do vấn đề y đức. Nhưng cũng nhờ đó mà các đặc điểm dịch
tễ, bệnh sử và phòng ngừa của hai loại VG A và B được hiểu biết rõ hơn.
Năm 1970, hạt tương tự virus được phát hiện (gọi là hạt Dane) mang trên bề mặt của nó kháng
nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân VGB và những hạt này được cho là VRVGB.
Kaplan (1973) phát hiện DNA polymerase nội sinh bên trong vỏ ngoài của các hạt Dane.
Chính DNA polymerase này giúp Robinson (1979) nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã
nucleotide DNA toàn phần, cho rằng HBV là một tác nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao
chép trong môi trường nuôi cấy mô. Từ đó, bộ gen HBV là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản
chất đậm đặc của chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, dù
rằng virion chứa chủ yếu DNA. Do phát hiện này, VRVGB người trở thành kiểu nguyên sinh của họ
hepadnavirus, Hepadnaviridae.
Năm 1972, Magnus phát hiện ra HBeAg.
Mullis K.B. (1983) đã tìm ra phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Đây là một
phương pháp nhân dòng in vitro nhằm tạo ra một số lượng lớn bản sao của một chuỗi mã nhất định.
Nhờ phát minh này, Mullis nhận giải Nobel (1993) và sinh học phân tử có những bước tiến bộ mới. Sự
khuếch đại virus bằng PCR giúp phát hiện trực tiếp và rất nhạy HBV DNA trong huyết thanh, tế bào và
các mô, hơn là phát hiện nhiễm HBV gián tiếp qua đáp ứng miễn dịch ký chủ đối với kháng nguyên
virus.
Nhờ đó trong thập kỷ vừa qua, nhiều tiến bộ đã đạt được về sinh học phân tử, dịch tễ học, sinh
bệnh học, chẩn đoán, điều trị và dự phòng của HBV.
1.2.2 Phân loại và các kiểu gen HBV
1.2.2.1 Phân loại HBV
Hiện nay, virus có tính hướng gan được xếp vào một danh sách ngày càng dài, thường xếp theo
thứ tự mẫu la tinh từ A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV) , E (HEV), G, TTV (đến nay đã có 16
kiểu huyết thanh TTV), virus SENV (phát hiện năm 1999, đến nay đã có 9 kiểu gen), virus SANBAN,
virus nhỏ giống TTV, virus YONBAN, virus Sentinel… [6,7] Trong đó, chỉ có virus A và E là truyền
1.2.3 Tình hình nhiễm virus HBV trên thế giới và Việt Nam
Nhiễm HBV là một bệnh thường gặp nhất trên thế giới gây VG mạn ở người. VGB mạn tính có
thể dẫn đến xơ gan và chết do suy gan; đây là nguyên nhân chính yếu của ung thư tế bào gan trên thế
giới.
1.2.3.1 Thế giới
Theo WHO (1997), có khoảng trên 2 tỷ người nhiễm HBV trên thế giới, hơn 350 triệu người
mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan.
Ngày nay, dù đã có các vacxin hiệu quả chống lại VGB, HBV cũng gây ra khoảng 1,2 triệu cái chết
hàng năm trên toàn thế giới. Đến năm 2000, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu
người [1].
Tỷ lệ người mang HBsAg thay đổi khác nhau trên thế giới từ 0,1% đến 0,2% ở Anh, Mỹ và
Scandinavia, đến hơn 3% ở Hy Lạp và miền Nam nước Ý và có thể lên đến 10% - 11% hoặc hơn nữa ở
Châu Phi và Viễn Đông trong đó có Đông Nam Á. Người mang HBsAg có thể có tỷ lệ rất cao trong vài
cộng đồng sống biệt lập như người Eskimo Alaska và người dân bản xứ Australia.
HBV lưu hành trên toàn thế giới. Người ta ước tính trên thế giới có hơn 50 triệu người nhiễm
HBV mới xảy ra hàng năm [1].
1.2.3.2 Việt Nam
Trên bản đồ dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng
nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao
nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài
nước xác nhận.
Ở Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về VGB. Mức nhiễm HBV của Việt Nam
tương đối cao, tỷ lệ có HBsAg trong cộng đồng nói chung vào khoảng 10-20% (Hoàng Thủy Nguyên,
Nguyễn Thu Vân, 1992; Phạm Song và cs, 1996…) cho thấy nước ta là nước có dịch HBV địa phương
cao [1].
1.2.4 Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B
người mới nhiễm HBV mỗi năm. Nhiễm HBV mới gây ra 8400 đến 19000 trường hợp nhập viện hàng
năm và 140 đến 320 người chết vì viêm gan kịch phát. Ở Mỹ, có từ 1 đến 1,25 triệu người mang HBV
mạn tính, nhiều người trong số họ di cư từ các vùng có tần suất cao và trung bình [6].
1.2.5 Một số đặc điểm sinh học của HBV
HBV thuộc họ Hepadnaviridae, một họ gây viêm gan cho nhiều loài động vật. HBV là một virus
DNA nhỏ với các đặc điểm về siêu cấu trúc, phân tử, kháng nguyên và sinh học độc đáo, khác biệt với
các thành viên của tất cả các họ virus đã được biết. DNA khá nhỏ, tròn, một phần mạch đơn (do cơ chế
sao chép của chúng và do có men phiên mã ngược). Các đặc điểm sinh học đáng chú ý là tính hướng cơ
quan (tropism) nổi bật đối với tế bào gan và có khuynh hướng gây nhiễm virus tồn tại (tình trạng người
mang mạn tính), với nồng độ cao của kháng nguyên virus gồm các thể virus toàn vẹn hay không toàn
vẹn chứa trong máu tồn tại trong nhiều tháng hoặc nhiều năm [6]. HBV là một virus bền vững, nó có
thể sống và gây nhiễm trùng trong vòng 6 tháng ở diều kiện nhiệt độ phòng [3].
1.2.5.1 Hình thái học và cấu trúc của HBV
HBV là VRVG người đầu tiên mà đặc điểm cấu trúc protein và bộ gen được nhận dạng và xác
định một cách cơ bản và đầy đủ.
Hình thái học hạt virus hoàn chỉnh
HBV có 3 kiểu hạt hiện diện trong máu của người nhiễm virus. Virus hoàn chỉnh (virion, hạt
Dane) có hình cầu, đường kính 42-45nm; các hạt cầu và các dạng sợi nhỏ hơn có đường kính khoảng
22nm chứa các protein và lipit vỏ ngoài HBsAg [6].
Hình 1.3: Các dạng HBV trong huyết thanh dưới kính hiển vi điện tử
Nguồn: http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html
Cấu trúc của HBV virion [6]
Dùng phương pháp nhuộm âm bản, virion hấp phụ vào các rây của kính hiển vi điện tử và một
cấu trúc hai vỏ của virion hiện rõ.
Hình 1.4: Cấu trúc của HBV virion
tháng sau khi nhiễm virus). Sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sự lây
nhiễm. Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫn đến tăng khả năng
viêm gan B mạn tính [6,16]. Vì hàm lượng của nó tỷ lệ thuận với lượng virus, do đó qua
kháng nguyên này có thể đánh giá được mức độ nhiễm của người bệnh [20].
1.2.5.3 Cấu trúc bộ máy di truyền
Cấu trúc của DNA virion
Dưới kính hiển vi điện tử, HBV DNA hình vòng, mạch kép không hoàn chỉnh và dài khoảng
3181-3221 base. Việc đánh số bắt đầu ở một điểm phân cắt của EcoRI. Bên trong virion, mạch DNA
mã hóa protein virus gọi là mạch (-), có chiều dài nguyên vẹn nhưng không đóng đồng hóa trị. Có một
phần dư nhỏ từ 9 đến 10 base tại đầu tận. DNA mạch (-) mang tại đầu tận 5’ phần gắn kết đồng hóa trị
của polymerase virus được gọi là protein tận cùng hoặc primase, vì cần thiết khởi động cho sự tổng hợp
mạch (-). Mạch (+) giữ mạch (-) trong cấu hình vòng vì nó tạo cầu nối cho những đoạn không liên tục
của mạch (-) [1]. Đầu tận 3’ của mạch (+) không ở một vị trí cố định và còn nối với HBV DNA
polymerase. Đa số các bộ gen HBV chứa một lỗ hổng mạch đơn có chiều dài từ 300-2000 base do
mạch (+) có chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của mạch (-) [6,20].
Mạch (-) đầy đủ có các đầu tận 5’ và 3’ xác định với một phần dư tận cùng gồm 9 base, trong
vùng mà ở đó bộ gen có mạch ba. Polymerase virus nối đồng hóa trị vào tyrosin 63 qua một cầu
phosphodieste vào đầu 5’ của mạch âm. Đầu tận 5’ của mạch DNA (+) được tạo bởi một
oligonucleotide chiều dài 18 base, được gắn chóp theo cùng một cách như RNA thông tin (mRNA). Bộ
gen chứa 2 chuỗi mã 10 hoặc 11 base được lặp lại một cách trực tiếp, được gọi là các chuỗi mã lặp lại
trực tiếp, DR1 và DR2. Cấu trúc bộ gen này là điển hình cho tất cả Hepadnaviridae, nhưng trong các
hepadnavirus gia cầm, sự gối lên nhau và khoảng cách giữa các đoạn lặp lại (DR) ngắn hơn [6].
Cấu trúc của bộ gen HBV không theo các tiêu chuẩn xếp loại thông thường của virus trong nhiều
khía cạnh: cấu trúc bộ gen có cả DNA và RNA và bộ gen chứa DNA mạch đơn, mạch kép và ngay cả
mạch ba không hoàn chỉnh. Các đặc trưng bất thường này là do hậu quả trực tiếp của cơ chế sao chép
của chúng [6].
Cấu trúc bộ gen của HBV
Định nghĩa các khung đọc mở: Từ chuỗi mã nucleotide của một phiên bản mạch kép của bộ gen
Virus DHBV không có vùng X [6,20].
1.2.5.4 Quá trình sao chép của virus viêm gan B
Quá trình sao chép của HBV và có thể được chia làm nhiều bước:
1. Gắn kết virus vào tế bào ký chủ;
2. Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào);
3. Phóng thích bộ gen virus;
4. Biểu hiện các sản phẩm gen virus;
5. Sao chép bộ gen virus;
6. Lắp ráp các hạt virion (virus hoàn chỉnh);
7. Phóng thích virus.
Gắn kết virus vào tế bào ký chủ
Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ là một trong các bước then chốt xác định tính hướng cơ quan của
virus nhờ vào các điểm gắn virus và các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào [6].
Hạt HBV hoàn chỉnh lưu thông trong máu và tìm cách gắn kết vào tế bào chủ. Nhiều bằng chứng
cho thấy một vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) là nơi gắn kết thụ thể. Các kháng thể đối với PreS1
có thể phong tỏa sự gắn kết của virion HBV vào màng tế bào gan. Sự gắn kết cũng có thể qua trung
gian albumin huyết thanh người đã biến đổi. Vì thế, HBV có thể dùng protein huyết thanh đã biến đổi
như một phương tiện chuyên chở để vào tế bào gan [6].
Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào)
Cơ chế HBV đi vào tế bào chủ chưa được hiểu biết rõ ràng: hoặc vỏ ngoài HBV có protein dung
hợp, protein dung hợp này chèn một chuỗi mã kị nước vào hai lớp lipid của tế bào đích và gây dung
hợp màng virus với màng tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; hoặc virus nhập
nội bào qua trung gian thụ thể [6].
Phóng thích bộ gen virus
Trước đây, người ta cho rằng toàn bộ hạt lõi được vận chuyển vào nhân. Các nghiên cứu gần đây
cho thấy, đường kính tối đa các lỗ nhân là 25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm. Tuy
chuyển đoạn và men phiên mã ngược /DNA polymerase từ DR1 vào DR2. Ở đây, đoạn RNA có chức
năng như một đoạn mồi tổng hợp DNA mạch (+). DNA polymerase có khả năng xuyên qua tính không
liên tục trong khuôn mẫu mạch (-) vì đoạn dư ngắn tận cùng của nó. Sau đó, cấu trúc của DNA virion
được tái sản xuất [6].
Hình 1.6: Quá trình sao chép của HBV trong tế bào gan
Nguồn: http://www1.qiagen.com/Default.aspx
Một số genom trưởng thành sau khi tổng hợp lại quay về nhân để chuyển thành cccDNA nhằm
duy trì một lượng khuôn ổn định cho dịch mã [20]. Các tế bào gan thường chỉ tích lũy khoảng 50 bản
sao HBV cccDNA cho mỗi tế bào [6].
Lắp ráp các hạt virion
Sự tổng hợp HBV DNA chưa được hoàn tất trước khi virus trưởng thành. Tại mạng lưới nội chất,
các phân tử lõi trưởng thành được đóng gói vào trong các protein bề mặt [6,20].
Phóng thích virus khỏi tế bào chủ
Sau khi có vỏ ngoài, virus hoàn chỉnh được tiết ra thông qua bọng vận chuyển [6,20].
1.2.6 Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị HBV
1.2.6.1 Con đường lây nhiễm
Nguồn hoặc ổ chứa HBV người chính là con người. Không có ổ chứa quan trọng nào khác trên
động vật. Một vài bề mặt dụng cụ như kim tiêm, bàn chải đánh răng, dao cạo râu, đồ chơi, dụng cụ y
tế… có thể là trung gian truyền nhiễm người – người của HBV cho một số lớn bệnh nhân. HBV thường
không có trong phân và không có bằng chứng truyền nhiễm theo con đường phân – miệng như virus
viêm gan A. Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong viêm gan siêu vi B là lây qua đường ngoài tiêu hoá.
Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong các dịch tiết của bệnh nhân đã nhiễm có nồng
độ siêu vi B rất cao và khi bệnh nhân tiếp xúc thường xuyên với các yếu tố nguy cơ trong một thời gian
dài. Mặt khác, đa số những người mang siêu vi B mạn tính thường không có triệu chứng và họ không
lượng của tình trạng lây nhiễm này tuỳ thuộc vào hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian
bị nhiễm HBV cấp tính ở mẹ.
Ở Đài Loan, người ta đã ước tính 40-50% người mang HBsAg mạn nhiễm tiên phát trong thời
kỳ chu sinh, chỉ có 5-10% có thể nhiễm trong bào thai, những trẻ khác có thể nhiễm vào lúc sổ nhau do
phơi nhiễm với máu người mẹ nhiễm virus. Vì vậy, việc cần thiết phải tiêm chủng bằng vacxin và có
thể cả globulin miễn dịch viêm gan B (HBIG) ngay sau khi bé chào đời.
Trẻ sinh ra từ người mẹ có HBsAg (+), HBeAg (+) có 60-80% nguy cơ nhiễm HBV phát triển
trong 9 tháng sau khi sinh và 90% trong số đó trở thành người mang HBV tồn tại. Các trẻ sinh ra do
người mẹ mang HBeAg (-), nguy cơ nhiễm trong năm đầu sau sinh thấp hơn (2-15%). Truyền nhiễm
HBV chu sinh thay đổi theo đặc tính lưu hành và tần số HBeAg (+) ở những người mẹ mang HBV.
Trên thế giới, truyền nhiễm chu sinh góp phần quan trọng (15-40%) vào số lượng người mang HBV
trong cộng đồng.
Các đường lây truyền khác [6]
Nhiễm HBV ở trẻ em: Nhiều trẻ không nhiễm HBV vào thời kỳ chu sinh, sẽ bị nhiễm vào vài
tháng đầu sau sinh, có lẽ do tiếp xúc chặt chẽ với mẹ hoặc anh chị em bị nhiễm virus.
Vai trò của nước bọt: Nước bọt là một đường truyền nhiễm HBV cần được nghiên cứu, có thể
gây nhiễm do những tiếp xúc thân mật không phải tình dục. Khảo sát trên hắc tinh tinh cho thấy, nước
bọt có thể gây nhiễm nếu có dây máu nhiễm HBV. Nhưng không truyền nhiễm khi niêm mạc đường
tiêu hóa không bị tổn thương và nước bọt nhiễm HBV được phun khí dung vào mũi, khi uống nước có
nhiễm HBV, hay khi chải răng. Tuy nhiên, truyền nhiễm có thể xảy ra qua vết cắn hoặc qua cơm được
mớm từ người mẹ nhiễm virus.
Nhiễm virus qua đường miệng: HBV không lây nhiễm qua đường phân miệng vì thế phân người
không thể là nguồn lây nhiễm HBV trong cộng đồng. Gây nhiễm sau khi uống một lượng HBV đã
được chứng minh liều lượng virus cần cho việc gây nhiễm thành công qua đường uống cao hơn qua
đường máu; nhưng sự gây nhiễm qua đường uống không xảy ra qua đường tiêu hóa, mà qua những tổn
thương nhỏ thường có trong niêm mạc miệng.
1.2.6.3 Biện pháp phòng ngừa và điều trị
Phòng bệnh
Miễn dịch thụ động: Globulin miễn dịch (Ig – Immunoglobulin) có kháng thể kháng HBs với
hiệu giá cao (Hepatitis B immune globuline, HBIG) có khả năng gây miễn dịch thụ động giúp ngăn
chặn viêm nhiễm cấp tính và mạn tính nếu chúng ta sử dụng HBIG ngay trong vòng 7 ngày sau phơi
nhiễm (liều người trưởng thành là 0,06ml/kg trọng lượng cơ thể), tiếp sau bằng bắt đầu hàng loạt mũi
vaccin HBV. Hiện nay, cách tiếp cận này được khuyến khích đối với những người đã nhiễm chất liệu ô
nhiễm kháng nguyên bề mặt viêm gan B qua niêm mạc hoặc qua vết xước ở da và cho những người có
quan hệ tình dục với những bệnh nhân nhiễm HBV. HBIG cũng có khả năng bảo vệ bệnh nhân khỏi
tình trạng tái nhiễm HBV sau quá trình cấy ghép gan. HBIG cũng được chỉ định cho những trẻ sơ sinh
của những bà mẹ mang HBsAg dương tính [16]. Các kết quả từ việc sử dụng HBIG dự phòng cho
những trẻ em có nguy cơ cao nhiễm VRVGB khá tốt nếu globulin miễn dịch được cho sớm sau sinh
ngay khi có thể, hoặc trong vòng 12 giờ sau sinh và nguy cơ đứa trẻ phát triển tình trạng mang virus
tồn tại được giảm độ 70% [6].
Miễn dịch chủ động: Miễn dịch chủ động có khả năng tạo miễn dịch cao. Vaccine VGB có thể
được sản xuất từ huyết tương của người mang HBsAg dương tính hoặc bằng phương pháp tái tổ hợp sử
dụng động vật có vú hoặc nấm men mang plasmid có chứa HBs hoặc chứa gen preS1 và preS2.
Gần đây, các nghiên cứu dùng kết hợp tiêm chủng chủ động và thụ động cho thấy hiệu quả lên tới
90%. HBIG cùng với vacxin được khuyến cáo dùng trong tất cả các trường hợp như thế nhất là đứa trẻ
của bà mẹ mang HBsAg (+) [6].
Điều trị
Theo thông tin đăng trên tờ Informed (phát hành ngày 13/09/2001) của Tổ chức VGB phi lợi
nhuận (Mỹ), các hợp chất đã và đang phát triển trong điều trị VGB gồm: Interferon (INF), các chất
tương tự nucleotide, thuốc kháng virus không nucleotide, thuốc tăng cường miễn dịch không INF.
Interferon
Interferon là một họ các protein tự nhiên, có hoạt tính chống virus và kích thích hoạt động của hệ
miễn dịch. Điều trị VGB mạn bằng INF-α, được FDA cho phép từ năm 1991 đã là phương tiện điều trị
đầu tiên với các thuận lợi như sau: liệu trình điều trị tương đối ngắn (4 đến 6 tháng); làm chuyển huyết
Nhóm II: acyclic phosphonate gồm adefovir (PMEA), tenofovir (PMPA) và cidofovir
(HPMPC).
Nhóm III: cyclopentane (pentene) ring gồm entercavir và abacavir (carbovir).
Các chất tương tự như nucleodide phải trải qua quá trình phosphoryl hóa và sau đó vào trong phân
tử DNA của virus, ức chế polymerase bằng cách cạnh tranh trực tiếp với chất nền tự nhiên
(Deoxyademosine triphosphate) và làm kết thúc chuỗi DNA của virus. Các nucleotide liên kết với nhau
qua cầu nối phosphodiester được thành lập giữa nhóm 3’-hydroxyl trên phân tử đường và nhóm 5’-
Copyright: Tài liệu đại học ©