41
3.3.5

Giải trình tự sản phẩm RT-PCR
Để kiểm tra độ đặc hiệu của sản phẩm RT-PCR, có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR
dương tính trên điện di, 1 của cây bệnh, 1 của chồi dứa thương phẩm (không có triệu
chứng bệnh) được đem giải trình tự. Do hạn hẹp về thời gian thực hiện đề tài, chúng
tôi không thể trực tiếp tiến hành giải trình tự nên gửi mẫu sản phẩm RT-PCR sang
công ty Macrogene – Hàn Quốc để thực hiện. Sau đó, trình tự sẽ được so sánh với
dữ liệu của đoạn gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 trên GenBank bằng các
phần mềm Clustal X 1.83 và BLAST.

3.3.6Giám định chồi giống dứa
Áp dụng quy trình đã xây dựng được, tiến hành giám định trên 3 giống dứa
Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 mẫu chồi giống dứa thương
phẩm được lấy ngẫu nhiên từ các nông trường. Tất cả được thực hiện phản ứng
RT-PCR và điện di.


hơn giếng 1. Như vậy, kết quả trên cho thấy đã ly trích được RNA tổng số từ mẫu
dứa.
28 S
18 S
1 2

43
4.2

Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR
4.2.1

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của primer
Cặp primer 225, 226 được chúng tôi khảo sát các đặc tính cơ bản và các cấu
trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer
( />). Việc khảo
sát các đặc tính cơ bản của cặp primer cho kết quả như sau
Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226
Primer 225 Primer 226
Trình tự
Số Nu
% GC
Tm
5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3'

20
50 %
57,3
o
C

-

Primer 226 có 1 cấu trúc kẹp tóc, 8 cấu trúc homo dimer.
-

Hai primer có 7 cấu trúc hetero dimer (Phụ lục 1)
Trong đó, các cấu trúc có năng lượng tự do Delta G thấp nhất là:

Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất

Cấu trúc thứ cấp Delta G (kcal/mol)
Kẹp tóc Homo dimer
(Primer 225)

Homo dimer
(Primer 226) Hetero dimer
5' CGCACAAA
|| ::C
3' CTAACGAACTT

5' ACAGGAAGGACAACACTCAC
|| : : ::
3' CACTCACAACAGGAAGGACA



45
Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226

Số Nu tương đồng

STT

Tên trình tự

Primer 225 Primer 226
1
gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119
Pineapple
mealybug wilt associated virus-1, complete cds
20/20 20/20
2
gi|22227|emb|X63205.1|ZMCAB48 Zea mays cab48
gene for chlorophyll a/b binding protein precurso

18/20
3
gi|62630081|gb|AC122311.6| Mus musculus BAC
clone RP23-298B23 from chromosome 6, complete
sequence

18/20
Chú thích: : không có vị trí tương đồng.
Trong đó, hai trình tự 2 và 3 chỉ có vị trí tương đồng với 1 trong 2 primer, chỉ
duy nhất trình tự 1, PMWaV-1, là có 2 vị trí tương đồng hoàn toàn với cặp primer

Chú thích: L: ladder
Giếng 1, 2, 3, 4, 5: lần lượt là sản phẩm RT-PCR của các chu trình
nhiệt 1, 2, 3, 4, 5.
Kết quả trên cho thấy chu trình nhiệt của Sether (chu trình 2) đã khuếch đại
được đoạn gene mong muốn 589 bp. Tuy nhiên, hiệu quả khuếch đại của chu trình
này không cao, phản ứng chủ yếu xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên kết quả
điện di cho thấy cường độ sáng của vạch sản phẩm phụ rất lớn, trong khi vạch sản
phẩm chính lại khá mờ.
Sự thay đổi nhiệt độ bắt cặp của chu trình 2 cũng không cho kết quả tốt hơn.
Ở chu trình 1, nhiệt độ bắt cặp quá thấp nên không xảy ra sự bắt cặp chuyên biệt,
phản ứng chỉ tạo sản phẩm phụ. Ở chu trình 3, nhiệt độ bắt cặp cao hơn giúp ít xảy
ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên lượng sản phẩm phụ ít đi. Tuy nhiên, với nhiệt
độ này, phản ứng RT-PCR xảy ra khó khăn hơn và tạo ra lượng sản phẩm chính ít
hơn chu trình 2. Với chu trình 4, nhiệt độ bắt cặp 58
o
C là quá cao cho cặp primer
225, 226 nên sự khuếch đại chuyên biệt hầu như không xảy ra.
589 bp
L 1 2 5 3 4
500 bp
1.500 b
p47
Trong 5 chu trình, chu trình 5 cho sự khuếch đại đặc hiệu cao nhất, vạch sản
phẩm phụ mờ, còn vạch sản phẩm chính rất sáng và rõ nét. Chu trình này được xây
dựng dựa trên phương pháp Touchdow PCR của Don và ctv (1991) (trích dẫn bởi
McPherson M.J. và Moller S.G., 2000). Phương pháp này rất hữu hiệu cho các phản
ứng PCR có lượng bản sao ban đầu của mẫu thấp. Trong đó, 10 chu kỳ đầu được

48
Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp
Chú thích: L: Ladder
(-) : Đối chứng âm
Giếng 1: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 1 mM
Giếng 2: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,8 mM
Giếng 3: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,6 mM
Kết quả điện di trên cho thấy, với 2 nồng độ primer 1 mM và 0,8 mM phản
ứng RT-PCR đều cho vạch sản phẩm chính sáng và rõ nét, nhưng nồng độ 0,8 mM
cho lượng sản phẩm phụ ít hơn. Còn ở nồng độ 0,6 mM, lượng primer quá ít nên
phản ứng cho hiệu quả khuếch đại thấp. Như vậy, nồng độ primer 0,8 mM chính là
nồng độ thích hợp nhất.

4.2.4

Kết quả khảo sát số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR
.
Vì số lượng bản sao RNA của virus trong RNA thực vật rất thấp nên số chu
kỳ cho một phản ứng RT-PCR thông thường là 40 – 45 chu kỳ. Do đó, chúng tôi đã
tiến hành khảo sát trên 5 mức 41, 42, 43, 44 và 45 chu kỳ để tìm số chu kỳ thích hợp
nhất. Kết quả của thí nghiệm này cho thấy như sau:

chấp nhận lượng sản phẩm phụ cao để tăng độ nhạy cho phản ứng. Vì vậy, mức 45
chu kỳ được chọn là mức thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR. L 1 2 3 4 5
589 bp
500 bp

50
Trong suốt quá trình xây dựng quy trình RT-PCR trên, ngoài vạch sản phẩm
chính 589 bp, còn xuất hiện thêm 1 vệt sản phẩm phụ kích thước khoảng 100 bp.
Bên cạnh đó, ở các phản ứng đối chứng âm (giếng (-), hình 4.3) không thấy có sản
phẩm khuếch đại, chứng tỏ trong quá trình thao tác không xảy ra sự ngoại nhiễm.
Như vậy, chúng tôi tạm lý giải điều này là do các nguyên nhân sau:
-

Primer dư tạo thành các dimer.
-

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR thừa các sản phẩm Mg
2+
, dNTP, RNA mẫu.
-

Trên RNA của cây dứa (thu được chung với của PMWaV-1 trong quá trình ly
trích RNA tổng số) có những đoạn trình tự cũng gần như bổ sung với cặp
primer 225, 226 nên trong phản ứng, ngoài đoạn HSP 70 của PMWaV-1 thì
đoạn trình tự này cũng được nhân bản. Tuy nhiên, trên GenBank không có dữ
liệu về trình tự các đoạn RNA của cây dứa nên chúng tôi không thể kiểm tra
lại giả thuyết này.