- 3 -
 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật để
định lượng tobramycin bằng
phương pháp HPLC.” - 4 - MỤC LỤC

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 -
1.1. TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN 7 -
1.1.1. Công thức cấu tạo 7 -
1.1.2. Tính chất lý hóa 7 -

1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu - 17 -
1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC - 18 -
1.3.3.5. Detector trong HPLC - 18 -
1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả - 18 -
- 5 - 1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký - 19 -
1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký - 21 -
1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] - 21 -
1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18] - 22 -
1.3.5.3. Chọn đệm pH - 23 -
1.3.5.4. Tốc độ dòng - 23 -
1.3.6. Cách đánh giá pic - 23 -
1.3.7. Ứng dụng của HPLC - 24 -
1.3.7.1. Định tính và thử độ tinh khiết: - 24 -
1.3.7.2. Sắc ký điều chế: - 24 -
1.3.7.1. Định lượng: - 24 -
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 26 -
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM - 26 -
2.1.1. Nguyên vật liệu : - 26 -
2.1.1.1. Nguyên liệu và hoá chất: - 26 -
2.1.1.2. Dụng cụ: - 26 -
2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu - 26 -
2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu - 26 -
2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu - 27 -
2.2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 28 -
2.2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng
phương pháp HPLC - 28 -
2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký - 28 - - 7 - PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN
1.1.1. Công thức cấu tạo
C
18
H
37
N

để tránh độc tính. Hiện nay, tobramycin được dùng với chế độ một liều cao và
duy nhất trong ngày. Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít
độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày như trước đây. Đối
với các ca nặng (nhiễm Pseu. aeruginosa ở người giảm neutrophile và các ca
suy thận) cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của
tobramycin: 2 - 5 giờ [6]
1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên
nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc
không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí.
Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính:
chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với
protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận.
Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn
các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin.
Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi
khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của
ribosom [2], [11].
1.1.6. Chỉ định
Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng,
đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn
huyết do vi khuẩn Gr (-).
- 9 - Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm
khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng
phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam.
Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha -
Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc

- Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241.
- Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ± 0,1
Dikali hydrophosphat : 16,75 g
Kali dihydrophosphat : 0,523g
- Môi trường định lượng:
Cao men bia : 3,0 g
Pepton : 6,0 g
Casein pancreatic : 4,0 g
Glucose : 1,0 g
Cao thịt : 1,5 g
Thạch : 15,0 g
Nước cất : 100 ml
pH sau khi tiệt trùng : 8,2 ± 0,2
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử
Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch
đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml;
20 IU/ml và 40 IU/ml.
- Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp hoạt lực kháng
sinh - DĐVN III.
1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20]
- Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phương pháp vi
sinh vật theo BP 2000 hay JP14
- 11 - - Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633
- Môi trường nuôi cấy : Môi trường đặc
- Dung dịch chuẩn
Cân chính xác một lượng tobramycin chuẩn, tương đương khoảng 25
mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành

0
C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang
của các dung dịch này ở bước sóng 425 nm, cuvet dày 1cm.
1.2.2.2. Phương pháp 2: [19]
- 12 - Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2
benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl
3
. Sản phẩm có độ hấp thụ
lớn nhất ở 645 nm. Định luật Lambert-Beer được áp dụng trong khoảng nồng
độ từ 50-500 mUI/ml.
1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC
1.2.2.1 Phương pháp 1 [14]
- Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8µm).
- Nhiệt độ cột: 55
0
C.
- Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nước đã loại CO
2
gồm: 52 g natri
sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung
dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã được chỉnh pH về 3,0 bằng acid
phosphoric.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong
nước đã loại CO
2
. Tốc độ 0,3 ml/phút.

thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 70
0
C.
1.2.2.4 Phương pháp 4 [16]
- Cột Xterra

RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 µm).
- Nhiệt độ cột: 30
0
C.
- Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1
lít nước Milli - Q

. Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH pha
động A đến 11,0.
- Pha động B: Acetonitril.
- Tiến hành sắc ký theo chương trình gradient dung môi như sau:
Thời gian
(phút)
Pha động A
(%)
Pha động B
(%)
0 100 0
10 0 100

- 14 - - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.


dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat
pH 10,4 lắc đều.
- Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900
ml nước. Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nước tới
vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm (pha theo BP 2005).
1.2.2.7. Phương pháp 7 [9]
 Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình
định mức 20,0 ml. Hòa tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch. Lấy
chính xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml. Thêm 0,5 ml
thuốc thử X, đem đun cách thủy ở 80
0
C trong 60 phút. Thêm dung môi vừa
đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
 Dung dịch chuẩn (đối chiếu)
Tiến hành tương tự như dung dịch thử nhưng thay tobramycin nguyên
liệu bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu).
- Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5µm).
- Detector UV : ở = 215 nm.
- Pha động: Methanol : Đệm phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80
- Thể tích tiêm: 10 µl.
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
* Nhận xét: Qua các phương pháp định lượng nêu trên, chúng tôi nhận thấy:
- Định lượng bằng phương pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang
thiết bị phức tạp nhưng có nhược điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc
hiệu do sự có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không
cao.
- 16 -
(trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của
hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân
bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi
ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với
hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân
tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện
gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được
hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in [8].
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với
một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra
khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa
giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký,
chúng ta có sắc đồ [8], [11].
1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao
gồm 6 bộ phận chính sau:
1.3.3.1. Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(0 - 400 bar)
1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung
môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và
đuổi khí hòa tan.
1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột.

Cột
Binh
chứa
pha
đ
ộ
ng

Bơm

Detector Bộ phận tự ghi
Van tiêm
m
ẫ
u

- 19 -


b
: Độ rộng ở đáy pic.
t
t
W
b2
0.5-2
W
0.5-1
W
b1
W
R2
R2
t'
t'
R1
R1
t
o
- 20 - Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng
số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
1.3.4.1. Hệ số dung lượng k
’

[8],[14]
Nếu k' nhỏ thì t

1.3.4.3. Độ phân giải (resolution)
Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:
=
R
(
)
(
)














α
−α
=
+
−
=
+

20/1
=
[8], [14]
Trong đó:
W
1/20
: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng, yêu cầu: 0,9 ≤ AF ≤ 2 [1], [18], [22].
1
t
t
t
tt
t
't
'k
0
R
0
0R
0
R
−=
−
==
- 21 -
H
N
L

1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18]
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có
nhiều thành phần. Nó là một chất rắn xốp có kích thước hạt rất nhỏ, đường
kính cỡ hạt từ 3 - 10 µm, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500 m
2
/g.
Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:
 Phải trơ và bền vững trong môi trường HPLC.
 Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.
 Tính chất bề mặt ổn định.
 Cân bằng động học của sự tách diễn ra nhanh và lặp lại tốt.
 Cỡ hạt phải đồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm
(Al
2
O
3
), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch carbon.
Trong sắc ký hấp phụ, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và sử dụng
nhiều nhất. Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:
|
0 CH
3

1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18]
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là
yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp. Pha động có thể là
nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình
sắc ký như độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, hiệu lực tách của cột, độ phân giải
R
S
, độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp
là rất quan trọng.
Yêu cầu của pha động:
 Phải trơ với pha tĩnh.
 Hòa tan được chất cần phân tích.
 Bền vững theo thời gian.
 Có độ tinh khiết cao.
 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
 Phù hợp với detector.
 Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
- 23 - Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít
phân cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform Các pha
động này thường được bão hoà.
Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như:
nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có
thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Bốn yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động:

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có ba ứng dụng chính:
1.3.7.1. Định tính và thử độ tinh khiết:
Thời gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu
của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ.
1.3.7.2. Sắc ký điều chế:
Qua qúa trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng
riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất.
1.3.7.1. Định lượng:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng rất lớn trong định lượng chất trong
hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất.
Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Một số
phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:
 Phương pháp chuẩn ngoại (external standard method)
Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu
chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau
đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với
pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ.
 Phương pháp chuẩn nội (internal standard method)
Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ
hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn
và
- 25 - mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội.
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation)
+ Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp
nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so
với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX - detector UV Diode array -
PDA 100
- Máy quang phổ UV- VIS Lambda EZ210
- Máy siêu âm SONOREX
- Cân phân tích Mettler AB 204 có độ chính xác 0,1mg
- Máy lọc chân không Satorius
- Bình định mức các loại
- Cốc có mỏ
- Pipet chính xác, pipet thường
- Lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm
2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu
- Tham khảo các phương pháp định lượng tobramycin đã công bố.
- Tham khảo các phương pháp định lượng tobramycin bằng HPLC.
- 27 - - Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất hoá lý của tobramycin cũng như
điều kiện thực nghiệm của nước ta hiện nay để xây dựng quy trình kỹ
thuật định lượng tobramycin bằng HPLC.
2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp:
Chọn cột, pha động, bước sóng phát hiện và tốc độ dòng, thể tích tiêm
thích hợp để định lượng.
 Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng tobramycin nguyên
liệu.
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
- Đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ tobramycin và diện
tích pic trên sắc ký đồ
- Đánh giá tính chính xác của phương pháp

(2.2)
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):
100
x
S
s
x
×=
(2.3)
- Sai số chuẩn:
n
S
s
x
=
(2.4)
- Sai số tương đối:
( )
100
x
%
s
t
x
)1n(
××=ε
−α