BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO
SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY
XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007iii
1 LỜI CẢM TẠ
Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những ngƣời thân đã nuôi dƣỡng và giáo dục con
nên ngƣời.
Tôi xin gửi lòng biết ơn đến:
- Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
- Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại
Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
- Thầy chủ nhiệm, thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học.
Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành
đề tài.
Tôi xin chân thành biết ơn:
- TS. Phan Phƣớc Hiền.

sắc ký lớp mỏng, sau đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn
này với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
- Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế để tách chiết một số
hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.
- Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp
chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,Trung tâm khoa
học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội.
- Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của lá Xuân hoa bằng quy trình DPPH.
Kết quả đạt đƣợc:
- Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với nồng độ
ức chế tối thiểu là :
MIC
E. coli
= 500 µg/ml. v
MIC
salmonella
= 500 µg/ml.
- Tách chiết đƣợc 18 phân đoạn và xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng
khuẩn là XH9, XH10, XH11, XH12, XH13.
- Tiến hành tách chiết trên phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn này thu đƣợc 2
hợp chất XH-K11 và XH-K13.
- Sau khi chạy phổ và tham khảo một số tài liệu, đã định danh đƣợc XH-K11 là
apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử: C
21
H
20
O

vi
SUMMARY

Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi Minh City.
“Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and
antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa
leaves”.
Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center,
Nong Lam University Ho Chi Minh City.
Content:
- Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column
chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that
researching antibacterial property of these fractions for E. coli, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa.
- Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these
antibacterial fractions.
- Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process.
Result:
- Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with :
MIC
E. coli
= 500 µg/ml.
MIC
salmonella
= 500 µg/ml.
- Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction.
- Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin

2.1.3. Phân bố 4
2.1.4. Nhân giống 4
2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa 4
2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian 4
2.2.2. Tác dụng sinh học 5
2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan 5
2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo 10
2.3. Thành phần hóa học 13
2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên 15 viii
2.4.1. Alcaloid 15
2.4.2. Flavonoid 16
2.4.3. Tinh dầu 16
2.4.4. Saponin 17
2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột 17
2.5.1. Định nghĩa 17
2.5.2. Hình thể 17
2.5.3. Tính chất nuôi cấy 18
2.5.4. Đặc tính sinh hóa 18
2.5.5. Sức đề kháng 19
2.5.6. Độc tố 19
2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên 19
2.5.8. Khả năng gây bệnh 21
2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm 21
2.6.1. Staphyl ococcus aureus 21
2.6.2. Pseudomonas aeruginosa 21
2.6.3. Escherichia coli 21
2.6.4. Salmonella 22

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết 44
4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng 45
4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform 45
4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. 47
4.2.2.1. Phân đoạn XH11 47
4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 47
4.2.2.3. Phân đoạn XH13 48
4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết. 49 x
4.3.1. Chất XH-K13 49
4.3.2. Chất XH-K11 50
4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao
chloroform. 52
4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa 55
4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C 55
4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa 56
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58
5.1. Kết luận 58
5.2. Đề nghị 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60
PHỤ LỤC 62
xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Coupling constant: hằng số ghép cặp
LD
50

Lethal dose 50: liều gây chết 50% số cá thể
m
Multiplet: mũi đa
Me
Methanol
MIC
Minimum Inhibitory Concentration: nồng độ ức chế tối thiểu
MS
Mass Spectrometry: khối phổ
Nt
Nhƣ trên
NMR
Nuclear Magnetic Resonnace: cộng hƣởng từ hạt nhân
Rf
Retention factor
s
Single: mũi đơn
t
Tripplet: mũi ba
TSA
Tryptic Soy Agar
xiii
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột 7
Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl
4
/kg thể
trọng 9
Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl
4
/kg thể trọng chuột 9
Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan 10
Bảng 2.5: Ảnh hƣởng của lá tƣơi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trƣởng,
bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo 11
Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy 12
Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm 39
Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa 42
Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ mẫu vitamin C 43
Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao 44
Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên Cao Chloroform 45
Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn 53
Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C 55
Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa 56

chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến
rủi ro do hiện tƣợng kháng thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên
có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phƣơng pháp điều trị một cách hiệu quả đối với
đối với một số bệnh nhiễm khuẩn.
Thêm vào đó, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa có
nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn nhƣ 2
các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…Vì thế trong công trình này chúng tôi cũng
khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá Xuân Hoa.
Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ
thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số
hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)”.
1.2. Mục đích – Yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.
Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ cao chloroform .
Xác định phân đoạn kháng vi khuẩn: E.coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa.
Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn kháng khuẩn.
Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá cây Xuân Hoa.
1.2.2. Yêu cầu
Cô lập 4 loại cao: Ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol, nƣớc. Dùng phƣơng pháp
nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch để xác định cao có hoạt tính kháng
khuẩn mạnh nhất.
Tiến hành sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để tách các phân đoạn và một số hợp
chất từ lá Xuân Hoa.
Sử dụng phƣơng pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng
độ ức chế tối thiểu của các phân đoạn đƣợc ly trích từ cao chloroform.

lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có
Hình 1.1: Cây Xuân Hoa 4
5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nửa chiều dài
của thùy, môi dƣới gồm 3 thùy to, thuỳ giữa của môi dƣới có các chấm màu tím. Quả
nang 2 ổ, mỗi ổ chứa 2 hạt. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch. Cây mọc hoang ra
hoa gần nhƣ quanh năm.
2.1.3. Phân bố [6, 14]
Hiện nay cây Xuân Hoa đƣợc trồng ở nhiều nơi nhƣ một loại cây thuốc gia đình. Cây
mọc hoang ra hoa gần nhƣ quanh năm. Gần đây đƣợc phát hiện mọc hoang ở vƣờn
quốc gia Cúc Phƣơng (Ninh Bình), rừng Bình Nguyên (Phạm Hoàng Lộ, 1999).
Ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa một số bệnh về tiêu
hóa. Ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số nhà trồng cây Xuân Hoa để chữa táo bón.
Đặc biệt gần đây nhất chúng tôi đƣợc biết có một số doanh nghiệp ở Tây Ninh đã dùng
lá và rễ cây Xuân Hoa này làm trà và đƣợc bán rộng rãi ra thị trƣờng với tên gọi trà
Hoàn Ngọc.
2.1.4. Nhân giống [6 ]
Cây Xuân Hoa có thể nhân giống dễ dàng bằng cách giâm cành. Lấy đoạn cành bẻ,
cách ngọn khoảng 20 cm, bỏ bớt vài lá phía dƣới, cắm vào đất ẩm, để chỗ mát, hàng
ngày tƣới đều (khoảng 2-3 lần/ngày). Cây chịu đất xốp và độ ẩm trung bình. Chỉ sau 1
tuần cành giâm đã ra rễ. Cây phát triển nhanh. Trồng khoảng trên 2 tháng là có thể
dùng làm thuốc chữa bệnh.
2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa
2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian
Cây Xuân Hoa đƣợc dùng trong dân gian để chữa nhiều bệnh nhƣ:
- Nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hoá, đau dạ dày, đau bụng không rõ nguyên nhân.
- Loét hành tá tràng, chảy máu đƣờng ruột.
- Khôi phục phục sức khoẻ cho ngƣời ốm yếu, chữa suy nhƣợc thần kinh.

chuột. Quan sát diễn biến hành vi, sau đó giết ngẫu nhiên 3 chuột ở 3 lô khác 6
nhau: quan sát đại thể phủ tạng và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của
thuốc nhƣ tim - gan - thận - dạ dày - ruột.
- Kết quả:
o Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống
thuốc và trong suốt quá trình thử nghiệm thuốc không gây thay đổi trạng thái
hoạt động của chuột: Chuột vẫn bò lui tới, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi…
o Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kh; 11,5 g/kg thể trọng chuột, sau khi
uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhƣng sau 1giờ thì trở lại bình thƣờng,
chuột rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng.
o Tất cả các chuột thí nghiệm (ở liều trên) đều không chết. Chuột sống khỏe
mạnh sau 48 giờ.
o Quan sát đại thể: Các phủ tạng đều bình thƣờng.
o Làm vi thể các cơ quan: Cắt thành miếng mỏng và nhuộm tế bào, quan sát
dƣới kính hiển vi (Bảng 2.1).

Cơquan
Liều

bình thƣờng.
Niêm
mạc dạ
dày và
tuyến
bình
thƣờng.
Niêm
mạc ruột
và các
tuyến
bình
thƣờng.
Không
có tổn
thƣơng
thực thể
ở các
tạng.
9,19g/kg
Cơ tim
bình
thƣờng.
Tế bào gan
hơi to,
nguyên sinh
chất có thoái
hoá nhẹ.
Quản cầu
xung huyết,

Nang
Bowmann
rộng ra, tế
bào thành
ống teo nhỏ.
Niêm
mạc dạ
dày và
tuyến
bình
thƣờng.
Niêm mạc
ruột và
các tuyến
bình
thƣờng.
Có tổn
thƣơng
nhẹ ở
gan và
thận. 8
- Mô hình gây ngộ độc gan: Gây tổn thƣơng gan chuột nhắt bằng carbon
tetrachloride (CCl
4
) theo phƣơng pháp đƣợc dung thông thƣờng (Shibayama,
1989; Yoshitake và cộng sự, 1991) với liều 1ml CCl
4

E
TB
MDA
TB
1
8
0,163
5,0296
2
12
0,458
14,1156 9
3
8
0,348
10,7091
Chú thích:
MDA: Malonic dialdehyde.
E
TB
: E trung bình.
MDA
TB
: MDA trung bình.
Nhận xét:
- Ở lô có sử dụng cao Xuân Hoa hàm lƣợng MDA có giảm so với lô gây mô hình
(giảm từ 14,1156 xuống còn 10,7091).

Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan.
Lô
n (số chuột)
AST(U/l)
ALT(U/l)
1
8
270
432
2
12
9668
10870
3
8
8740
10533 10

Nhận xét:
- Hàm lƣợng men gan giảm nhƣng chƣa đáng kể.
- Xét nghiệm vi thể: ở lô chuột có sử dụng cao Xuân Hoa và lô gây mô hình nhận
thấy rằng các tế bào ở vùng thoái hoá đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hƣớng hồi
phục.
Kết luận:
Cao đặc toàn phần Xuân Hoa có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế
bào, nghĩa là có xu hƣớng tác dụng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm.
2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo [14]

-
-
-
-
T1-1
52
Lá tƣơi
1
miệng
1-7 11
T1-2
52
cai sữa
1
1-30
TN2
C2
60
Heo
chƣa
cai sữa
-
-
-
-
T2-1
60

T3-3
62
0,2

Sự biểu hiện tăng trƣởng đƣợc đo lƣờng dựa vào việc tăng cân và tốc độ tăng trƣởng
chậm lại. Heo tăng ít hơn 4kg/28 ngày đƣợc xem là tăng trƣởng chậm lại. Sự truyền
bệnh tiêu chảy đƣợc đo lƣờng hằng ngày dựa trên tỉ lệ heo mắc bệnh trong những con
heo thí nghiệm, số trƣờng hợp và thời gian mắc bệnh.
Ngoài ra, Huỳnh Kim Diệu và Trần văn Hòa [14] đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị
bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang đƣợc sử
dụng trị bệnh tiêu chảy ở heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol. Sau 3
ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lƣợt: Bột Xuân Hoa 92,86%; Coli-norgen
90,48%; Cotrimxazol 83,33%. Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14%; 9,52%; 14,29%.
Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy.
Loại thuốc
Số heo
thử
nghiệm
Số lƣợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị
Ngày thứ nhất
Ngày thứ hai
Ngày thứ ba
Số con
%
Số con
%
Số con
%
Bột Xuân
Hoa

trọng cho phƣơng pháp này. Liều lƣợng đƣợc sử dụng cho việc ngăn chặn bệnh, nồng
độ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm nhỏ hơn nồng độ gây ức chế thấp nhất để tránh gây
tác dụng phụ. Sử dụng lá hay bột Xuân Hoa có thể cải thiện những thông số đo lƣờng
nói trên và kết quả có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Trƣớc tiên, lá Xuân Hoa chứa một tỉ
lệ cao protein thô (30,8% DM: dry matter), so sánh với cỏ voi (18,6% DM) và cây sắn
dây (18,4% DM). Ảnh hƣởng của liều sử dụng sẽ rất nhỏ bởi vì tỉ lệ nhỏ của nó trong
khẩu phần. Thứ hai, lá Xuân Hoa có hàm lƣợng cao một số loại khoáng nhƣ: Ca (6,5%
DM), K (4,4% DM), Mg (6,3% DM), Fe (0,3% DM). Hàm lƣợng Fe, đặc biệt trong các
chất khoáng cao gấp 4 lần đậu nành và 3 lần gan heo. Fe trong cây sẽ góp phần cải
thiện tình trạng sinh lý máu bởi vì Fe cần thiết cho heo để thúc đẩy hồng cầu, đặc biệt
hemoglobin có chức năng nhƣ một thể mang oxy và cacbonic, vì thế nó đƣợc biết nhƣ
một sắc tố hô hấp và giải thích tình trạng của hồng cầu. Thứ ba, trong lá có chứa một
protein ổn định nhiệt đƣợc gọi là pseuderantin (0,4% trong protein thô) có hoạt tính
mạnh trong việc tiêu hoá casein và do đó việc tiêu hóa sữa sẽ đƣợc cải thiện nếu bổ
sung lá. Thứ tƣ, một số hợp chất hoá học trong lá và một vài tác nhân kháng khuẩn có
thể ảnh hựởng tới sự phát triển và miễn dịch của heo.
Kết luận:
Sử dụng bột lá Xuân Hoa với 0,2 g/kg thể trọng cho 30 ngày đối với heo chƣa cai sữa
và đã cai sữa đã cải thiện sự tăng trọng và ngăn ngừa bệnh dịch tả, cho nên cây trồng
này có nhiều triển vọng thay thế hoặc giảm sử dụng kháng sinh trong tƣơng lai.
2.3. Thành phần hoá học [4, 5]