BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO
SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY
XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007iii
1 LỜI CẢM TẠ
Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những ngƣời thân đã nuôi dƣỡng và giáo dục con
nên ngƣời.
Tôi xin gửi lòng biết ơn đến:
- Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
- Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại
Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
- Thầy chủ nhiệm, thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học.
Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành
đề tài.
Tôi xin chân thành biết ơn:
- TS. Phan Phƣớc Hiền.

sắc ký lớp mỏng, sau đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn
này với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
- Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế để tách chiết một số
hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.
- Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp
chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,Trung tâm khoa
học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội.
- Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của lá Xuân hoa bằng quy trình DPPH.
Kết quả đạt đƣợc:
- Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với nồng độ
ức chế tối thiểu là :
MIC
E. coli
= 500 µg/ml. v
MIC
salmonella
= 500 µg/ml.
- Tách chiết đƣợc 18 phân đoạn và xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng
khuẩn là XH9, XH10, XH11, XH12, XH13.
- Tiến hành tách chiết trên phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn này thu đƣợc 2
hợp chất XH-K11 và XH-K13.
- Sau khi chạy phổ và tham khảo một số tài liệu, đã định danh đƣợc XH-K11 là
apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử: C
21
H
20
O

vi
SUMMARY

Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi Minh City.
“Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and
antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa
leaves”.
Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center,
Nong Lam University Ho Chi Minh City.
Content:
- Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column
chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that
researching antibacterial property of these fractions for E. coli, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa.
- Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these
antibacterial fractions.
- Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process.
Result:
- Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with :
MIC
E. coli
= 500 µg/ml.
MIC
salmonella
= 500 µg/ml.
- Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction.
- Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin

2.1.3. Phân bố ................................................................................................................ 4
2.1.4. Nhân giống .......................................................................................................... 4
2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa ................................................................................ 4
2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian ................................................................................. 4
2.2.2. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 5
2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan ............................................................................................. 5
2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo ............................................................... 10
2.3. Thành phần hóa học ............................................................................................... 13
2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ..................................................... 15 viii
2.4.1. Alcaloid ............................................................................................................... 15
2.4.2. Flavonoid ............................................................................................................. 16
2.4.3. Tinh dầu .............................................................................................................. 16
2.4.4. Saponin ................................................................................................................ 17
2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột ........................................................................ 17
2.5.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 17
2.5.2. Hình thể ............................................................................................................... 17
2.5.3. Tính chất nuôi cấy ............................................................................................... 18
2.5.4. Đặc tính sinh hóa ................................................................................................. 18
2.5.5. Sức đề kháng ....................................................................................................... 19
2.5.6. Độc tố .................................................................................................................. 19
2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên........................................................................................ 19
2.5.8. Khả năng gây bệnh .............................................................................................. 21
2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm .............................................................. 21
2.6.1. Staphyl ococcus aureus ....................................................................................... 21
2.6.2. Pseudomonas aeruginosa.................................................................................... 21
2.6.3. Escherichia coli ................................................................................................... 21
2.6.4. Salmonella ........................................................................................................... 22

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 44
4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết .................................... 44
4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng .................... 45
4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform ................................................................ 45
4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. ................................................ 47
4.2.2.1. Phân đoạn XH11 .............................................................................................. 47
4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 ................................................................................. 47
4.2.2.3. Phân đoạn XH13 .............................................................................................. 48
4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết. ............................................................... 49 x
4.3.1. Chất XH-K13 ...................................................................................................... 49
4.3.2. Chất XH-K11 ...................................................................................................... 50
4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao
chloroform. .................................................................................................................... 52
4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa ................................................................. 55
4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C ....................................................................... 55
4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa .................................................. 56
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 58
5.1. Kết luận .................................................................................................................. 58
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 60
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 62
xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cây Xuân Hoa............................................................................................. 3
Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê ........................................................................ 29
Hình 3.2: Chất phân tích đã đƣợc đƣa vào cột sắc ký ................................................... 33
Hình 3.3: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng ................................................................... 36
Hình 3.4: Sắc ký điều chế ............................................................................................. 37
Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C và mẫu Xuân Hoa sau khi cho DPPH
vào ................................................................................................................................. 43
Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli v à Salmonella ............................. 44
Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng ........................................................................ 47
Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng ........................................................................ 48
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. Coli ................................... 52
Hình4.5 : Các nồng độ kháng E. coli của phân đoạn XH9 ........................................... 53
Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 ........................ 54
Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 .......................... 54
Đồ thị 4.1: Vitamin C .................................................................................................... 55
Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa........................................................................................ 56


Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C.................................................... 55
Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa ........................................... 56
Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của mẫu Xuân Hoa đối với độ hấp thụ của DPPH ................ 57
Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu .................................................................... 28
Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao ............................................................... 30
Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH ............................................ 41
1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) là một loại cây đƣợc dân gian
biết đến nhƣ là một dƣợc liệu có thể chữa đƣợc rất nhiều căn bệnh: bệnh tiêu hóa, tiểu
đƣờng, trĩ nội, chảy máu, suy nhƣợc thần kinh…Tuy nhiên, trên thực tế có rất ít nghiên
cứu về cây này để có thể làm rõ vẫn đề trên.
Hiện nay trên thế giới chƣa có một nghiên cứu nào sâu xa về cây này. Các nhà
khoa học Việt Nam cũng chỉ mới bƣớc đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó. Trần Công
Khánh và cộng sự (1999) đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy cao toàn phần lá
Xuân Hoa không thể hiện độc tính và có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid
màng tế bào, nghĩa là có xu hƣớng bảo vệ tế bào gan. Huỳnh Kim Diệu (2003) đã thử
nghiệm lá Xuân Hoa đối với heo chƣa cai sữa có tác dụng tăng trọng và chữa đƣợc
bệnh dịch tả. Và gần đây, trong Hội Nghị Khoa Học và Công Nghệ Hóa Hữu Cơ Toàn
Quốc lần thứ 3 Hà Nội 11 – 2005, Phan Phƣớc Hiền và cộng sự đã công bố công trình
phân lập Triterpenoid và Steroid từ lá cây Xuân Hoa Psenderanthemum palatiferum họ

Sử dụng phƣơng pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng
độ ức chế tối thiểu của các phân đoạn đƣợc ly trích từ cao chloroform.
Tiến hành ly trích lá cây Xuân Hoa và đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng
517 nm [3] để xác định khả năng chống oxy hóa. 3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa
2.1.1. Đặc điểm thực vật học [2]
Tên khoa học: Pseudranthemum palatiferum.
Họ: Ô rô (Acanthaceae)
Tên thông thƣờng: Xuân Hoa, Hoàn Ngọc, Tú Linh, Nhật Nguyệt, Thần Tƣợng
Linh, Lan Điền,…
2.1.2. Đặc điểm hình thái [2, 6]
Cây có thể cao 1-2 m (nếu trồng trên đất vƣờn nhà), sống lâu năm. Thân cây xanh hoặc
tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều mảnh. Lá mọc đối hình mũi mác,
dài 12-17 cm, rộng 3,5-5 cm, gốc lá hơi men xuống.

- Loét hành tá tràng, chảy máu đƣờng ruột.
- Khôi phục phục sức khoẻ cho ngƣời ốm yếu, chữa suy nhƣợc thần kinh.
- Chấn thƣơng chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thƣơng sọ não.
- Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt. 5
- Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trƣớng, làm
giảm đau khi bị ung thƣ gan giai đoạn phát bệnh.
- Điều chỉnh huyết áp.
- Ở Trung Quốc, ngƣời ta dùng rễ cây Xuân Hoa để chữa đòn ngã tổn thƣơng.
Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng Xuân Hoa để chữa những
bệnh thuộc đƣờng tiêu hóa. Thời gian gần đây, một số Việt kiều ở Mỹ cũng đã
dùng cây Xuân Hoa để chữa bệnh đái tháo đƣờng. Bệnh nhân dùng liên tục cây
Xuân Hoa giữ đƣợc ổn định tỷ lệ đƣờng trong máu.
Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt. Ngƣời ta thƣờng dùng lá tƣơi
rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nƣớc, giã nát lấy nƣớc uống hoặc
nấu ăn. Liều lƣợng phu thuộc vào ngƣời bệnh, từng bệnh, thông thƣờng ăn 2-8
lá/ngày, chia làm 2 lần trƣớc bữa ăn.
2.3.1. Tác dụng sinh học
2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan [9]
Để góp phần xác minh tác dụng đƣợc lƣu truyền trong dân gian và chứng minh tác
dụng của cây thuốc Xuân Hoa, Trần Công Khánh và cộng sự của ông đã tiến hành
nghiên cứu độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá cây Xuân Hoa trên
in vivo.
 Thử độc tính cấp
- Chuột nhắt trắng, chia làm 6 lô, mỗi lô 7 con.
- Thuốc thử: Cao đặc toàn phần đƣợc cân và hòa tan bằng nƣớc cất, thu đƣợc các
dung dịch có hàm lƣợng khác nhau: 33,2 mg/ml; 66,8 mg/ml; 125,2 mg/ml;
222,4 mg/ml; 367,6 mg/ml; 460 mg/ml.

Cơquan
Liều
Tim Gan Thận Dạ dày Ruột Đánh giá 7
Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột

Kết luận: Cao toàn phần Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều. Nhƣ vậy,
trên độc tính cấp cao Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD
50
.
 Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan
- Chuột nhắt trắng, chi làm 6 lô, mỗi lô từ 8 – 12 con.
- Cao toàn phần lá Xuân Hoa đã loại bỏ chlorophyl, hòa tan với nƣớc cất.
0,83g/kg Cơ tim
bình
thƣờng.
Các tĩnh
mạch xoang
và tĩnh mạch
trung tâm
trên thuỳ
xung huyết.
Quản cầu và
các ống thận
bình thƣờng.
Niêm
mạc dạ
dày và

tuyến
bình
thƣờng.
Niêm
mạc ruột
và các
tuyến
bình
thƣờng.
Có thoái
hoá nhẹ
ở gan.

11,5g/kg Cơ tim
bình
thƣờng.
Tế bào gan
hơi to,
nguyên sinh
chất có thoái
hoá nhẹ, tĩnh
mạch trung
tâm trên thuỳ
xung huyết.
Nang
Bowmann
rộng ra, tế
bào thành
ống teo nhỏ.
Niêm

gan, không dung thuốc Xuân Hoa.
o Lô 2: Gây mô hình viêm gan đối chứng, không sử dụng thuốc Xuân Hoa.
o Lô 3: Gây thí nghiệm viêm gan, cho uống thuốc Xuân Hoa trƣớc, sau 1 giờ
thì tiêm CCl
4
vào.
- Nguyên tắc của phƣơng pháp là xác định hàm lƣợng malonic dialdehyde
(MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hoá lipide màng
tế bào. Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo
thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532
nm [9]. Cƣờng độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lƣợng
MDA tính theo công thức:
X = E x 30,8
Trong đó: X: Hàm lƣợng MDA (mM)
E: Độ hấp thụ ở 532 nm.
30,8: Hệ số tắt phân tử.
Bảng 2.2: Hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl
4
/kg thể trọng.
Lô n (số chuột) E
TB
MDA
TB
1 8 0,163 5,0296
2 12 0,458 14,1156
- Xác định hàm lƣợng men gan trên máy Cobas Mira Plus, hãng Roche (Thụy Sĩ).

Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan.
Lô n (số chuột) AST(U/l) ALT(U/l)
1 8 270 432
2 12 9668 10870
3 8 8740 10533 10

Nhận xét:
- Hàm lƣợng men gan giảm nhƣng chƣa đáng kể.
- Xét nghiệm vi thể: ở lô chuột có sử dụng cao Xuân Hoa và lô gây mô hình nhận
thấy rằng các tế bào ở vùng thoái hoá đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hƣớng hồi
phục.
Kết luận:
Cao đặc toàn phần Xuân Hoa có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế
bào, nghĩa là có xu hƣớng tác dụng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm.
2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo [14]
Bệnh tiêu chảy chủ yếu xảy ra ở heo chƣa cai sữa. Nhiều kháng sinh nhƣ avinamycine,
colistin, oxytetracyclin, spectinomycin và trimethoprim là những phƣơng pháp phổ
biến đƣợc áp dụng để điều trị bênh. Tuy nhiên, lƣợng tồn dƣ kháng sinh trong các sản
phẩm động vật đƣợc xem nhƣ là một nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khoẻ con ngƣời bởi
vì tính độc và tính dị ứng của nó. Thêm vào đó, sự phát triển của các vi khuẩn kháng
thuốc dẫn đến sử dụng liều lƣợng quá cao đã trở thành một vài vấn đề trên thế giới. Vì
vậy, cần phải giảm việc sử dụng và thay thế vai trò của kháng sinh trong thức ăn gia
súc bằng cách gia tăng việc sử dụng probiotics và những sản phẩm tự nhiên khác, đặc
biệt ở đây ta sử dụng lá cây Xuân Hoa để điều trị bệnh tiêu chảy ở heo.


T2-1 60 Lá tƣơi 0,5
miệng 1-30 T2-2 60
Bột
0,1
T2-3 60 0,2
TN3
C3 62
Heo đã
cai sữa
- - - -
T3-1 62 Lá tƣơi 0,5
thức ăn 1-30 T3-2 62
Bột
0,1
T3-3 62 0,2

Sự biểu hiện tăng trƣởng đƣợc đo lƣờng dựa vào việc tăng cân và tốc độ tăng trƣởng
chậm lại. Heo tăng ít hơn 4kg/28 ngày đƣợc xem là tăng trƣởng chậm lại. Sự truyền
bệnh tiêu chảy đƣợc đo lƣờng hằng ngày dựa trên tỉ lệ heo mắc bệnh trong những con
heo thí nghiệm, số trƣờng hợp và thời gian mắc bệnh.
Ngoài ra, Huỳnh Kim Diệu và Trần văn Hòa [14] đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị
bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang đƣợc sử
dụng trị bệnh tiêu chảy ở heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol. Sau 3
ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lƣợt: Bột Xuân Hoa 92,86%; Coli-norgen
90,48%; Cotrimxazol 83,33%. Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14%; 9,52%; 14,29%.
Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy.
Loại thuốc
Số heo
thử
nghiệm

thể ảnh hựởng tới sự phát triển và miễn dịch của heo.
Kết luận:
Sử dụng bột lá Xuân Hoa với 0,2 g/kg thể trọng cho 30 ngày đối với heo chƣa cai sữa
và đã cai sữa đã cải thiện sự tăng trọng và ngăn ngừa bệnh dịch tả, cho nên cây trồng
này có nhiều triển vọng thay thế hoặc giảm sử dụng kháng sinh trong tƣơng lai.
2.3. Thành phần hoá học [4, 5]