Trang 1
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học - thực phẩm trong việc tách chiết và khảo sát thành
phần hóa học và đặc tính sinh học của các loại cây có nhiếu ứng dụng trong thiên
nhiên hiện nay đang được quan tâm rất nhiều trên thế giới cũng như tại Việt
Nam. Nhằm tìm kiếm các đặc tính sinh học để ứng dụng vào các lĩnh vực trong
thực tiễn.
Cây Bìm bìm Eberhardt (Ipomoea Eberhardtii) là một loại cây có khả
năng phát triển rất mạnh mẽ, là loài cây leo nguy hiểm này có nguồn gốc ở vùng
khí hậu nhiệt đới. Loài cây này phát triển rất nhanh, xanh tốt quanh năm và có
hiệu suất quang hợp cao. Đây là loài thực vật xâm lấn nguy hiểm cần phải loại
trừ. Tuy nhiên loại cây này cũng có thể tiết ra các chất có khả năng kháng một số
loại vi khuẩn, chống lại sự phát triển của cỏ dại và các chất kháng oxy hóa có
nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa. Tuy nhiên, trên
thực tế có rất ít nghiên cứu về cây này để có thể làm rõ vấn đề trên. Hiện nay trên
thế giới chưa có một nghiên cứu nào sâu xa về loài cây này. Các nhà khoa học
Việt Nam cũng chỉ mới bước đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó.
Xuất phát từ yêu cầu trên, nên tôi chọn đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ
thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của
các hợp chất thứ cấp từ cây bìm Eberhardt (Ipomoea Eberhardtii)” để có thể
góp một phần nào đó giải quyết các vấn đề ở trên.
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Mục đích cơ sở nghiên cứu đề tài
Cây bìm bôi có hai loại là Lang bìm bìm Hoa trắng (Ipomoea
eberhardtii) và Merremia boisiana var. Boisiana. Loài mọc và gây hại mạnh ở
Việt Nam, sát thủ kiều mộc được xác định là Ipomoea eberhardtii. Loài cây này
phát triển rất nhanh, xanh tốt quanh năm và có hiệu suất quang hợp cao. Đây là
loài thực vật xâm lấn nguy hiểm cần phải loại trừ. Khác với cây bìm bìm mà
Đông y dùng làm thuốc chữa phù thũng, dây bìm bìm ở bán đảo Sơn Trà có hoa

hướng về đỉnh thành một mũi nhọn, phía trên co một lớp lông màu bạc ánh kim
mềm, dưới có các đường vân lá nhỏ, đáy thùy, chặt chẽ, xoang cấp tính, hệ gân lá
cơ bản có 7 đường, hệ gân ngang to, xếp song song, cuống dài 5cm, lá mỏng và
xếp dày dọc theo chiều dài của thân.
Chùm hoa:
Cụm hoa ở nách, phát triển theo chùm, đài hoa và cuống mạnh mẽ, dài 12-
15cm, màu vàng nhạt có lông tơ.
Hoa:
Hoa hình chuông rộng, có thể dài đến 18mm, rộng 12-15mm, có lông tơ bên
ngoài, màu vàng nâu, đỉnh có đầu nhọn, bên trong hơi nhỏ hơn, tràng hoa hình
chuông, màu trắng, dài 6cm, rộng 4-5cm, ngoài có lông rất mịn, thùy chi nằm kín
bên trong, các nhị có lông mao ở tràng hoa, sợi dài 7mm, trên có nhiều nhánh và
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 4
bên dưới có nhiều điểm gắn, có thể co giãn và dài hơn 5mm, bao phấn hình elip,
nhụy hoa có bề mặt nhẵn không có lông, bầu nhụy tù, 2 tế bào, bầu nhụy không
suy giảm, bầu nhụy dạng chỉ, các đầu núm nhụy dài 2cm [18][19].
Loài cây này phát triển rất nhanh, xanh tốt quanh năm và có hiệu suất quang
hợp cao. "Dây lang rừng" phát triển nhanh là vì chúng có thể phát tán bằng hạt,
chồi, thân hoặc rễ. Dây bò đến đâu, rễ bén đến đó và phát triển thành gốc mới.
Thân dây có đường kính 15-20 cm thậm chí to hơn tuỳ theo vùng đất chúng bám
trụ. Loại lang này là thức ăn ưa thích của heo, bò và thỏ nhưng chúng bò trên
những tán cây cao hàng chục mét nên rất khó khăn trong việc hái lượm để sử
dụng [13].
1.2.2. Nguồn gốc và phân bố
Loài cây leo nguy hiểm này có nguồn gốc ở vùng khí hậu nhiệt đới đảo Hải
Nam và khu Tự trị dân tộc Choang (Quảng Tây), Vân Nam (Trung Quốc), ở độ
cao từ 100 đến 1500m so với mặt nước biển [17] [19].
Hình 1.3. Tình hình phân bố tại Việt Nam
Bìm bôi phát tán rất nhanh bằng hạt, chồi, rễ và thân. Chim, thú gặm nhấm

Trước tình hình như vậy, Ban quản lý rừng đặc dụng Nam Hải Vân đã làm
tờ trình gửi Chi cục Kiểm lâm, Sở Thuỷ sản nông lâm thành phố. Các cơ quan
chức năng đã vào cuộc, cán bộ kỹ thuật của Sở cũng đã lấy mẫu nghiên cứu,
nhưng vẫn chưa chính thức khẳng định loại cây gì, xuất xứ ở đâu và du nhập vào
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 6
Việt Nam từ khi nào. Chính vì thế mà không tìm được một loại hoá chất hoặc vi
sinh gì để tiệt trừ sự xâm thực của loại cây này.
Trong 2 năm 2000-2001, UBND thành phố đã trích kinh phí để tận diệt dây
lạ bằng biện pháp thủ công: rứt dây, đào gốc, băm vụn thân, lá và phơi khô để
đốt. Tuy nhiên với khoản tiền 300.000 đồng cho 1 ha là quá lớn khi diện tích xâm
thực đã lên đến hơn 1.000 ha trên tổng số hơn 5.000 ha rừng trồng. Sau khi diệt
được 40 ha, hết kinh phí, ngành kiểm lâm và các hộ nông dân trồng rừng đành
khoanh tay nhìn sự tái lấn chiếm của "dây lang rừng" và sự chết dần của những
cánh rừng trồng [17].
Hình 1.4. Bìm hoa trắng (Merremia eberhardtii) xâm hại tại Bán đảo Sơn Trà
Theo Kỹ sư Hồ Ngọc Lượng, Phó ban Quản lý rừng đặc dụng Nam Hải
Vân, một trong những "chuyên gia" đối đầu với giống dây leo lạ từ nhiều năm
nay cho biết: "Không những rừng Nam Hải Vân mà hiện nay "lang rừng" đã phát
tán sang khu bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà và bắt đầu "tấn công" rừng Bà Nà (các
vùng rừng liền kề). Vấn nạn này đã thành nguy cơ cần báo động khẩn thiết [14].
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 7
Hình 1.5. Cây bìm bìm phát triển mạnh vùng đèo Hải Vân
Theo nhận định chung của giới chuyên môn thì ngoài việc "cướp" ánh sáng,
loài thực vật này còn tiềm ẩn nguy cơ cháy rừng do khả năng tích luỹ khối lượng
vật liệu cháy lớn (lá khô, cành khô, bản lá to và nhiều). Thậm chí khả năng bắt
lửa rất nhanh kể cả lá, nhánh còn xanh. Ông Nguyễn Mạnh Tiến, Trưởng phòng
Quản lý Bảo vệ rừng Chi cục Kiểm lâm Đà Nẵng, cho biết: "Từ đầu năm tới nay,
đã có 9 vụ cháy rừng, trong đó phần lớn các vụ cháy xảy ra nơi có bìm bìm. Mới

lược của các loài xâm lấn. Ở Trung Quốc, M. boisiana đã phân phối ở Vân Nam,
Quảng Tây và Quảng Đông, nhưng phân phối của mình ở tỉnh Phúc Kiến đã
không được xác nhận. Thành phố Quảng Châu và vùng phụ cận trở thành một
khu vực phân phối mới của M. boisiana do của nó phía Bắc xâm nhập từ Hải
Nam dưới sự nóng lên toàn cầu. Chúng lây lan là một thảm họa có nguồn gốc từ
các hệ sinh thái nội tại được bị phá hủy bởi các nhiễu loạn, gây bitat ha trở nên
tồi tệ hơn, bị hỏng. Giảm đa dạng sinh học cộng đồng và nhóm đa dạng chức
năng tăng cường khả năng xâm lấn của các cộng đồng kỳ lạ và cung cấp cơ hội
cho các loài xâm lấn. Bảo vệ hệ sinh thái tự nhiên từ sự xáo trộn, và xây dựng lại
một thứ tối ưu hóa hệ sinh thái bị phá hủy sẽ là chiến lược cần thiết [15].
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 9
Loài cây xâm lấn này được phát hiện tại Việt Nam vào năm 1999 và đến
nay chưa có nghiên cứu nào về đặc tính sinh học cũng như tác hại của cây bìm
bôi M. boisiana.
Ngày 14/4/2012, được sự cho phép của UBND thành phố Đà Đẵng, Giáo sư
Steve Adkins thuộc trường Đại học Queenland - Canada cùng các chuyên gia của
Viện Sinh học nhiệt đới và Trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí
Minh đã tiến hành khảo sát, thu mẫu các dây lang bìm bìm đang xâm hại trên địa
bàn thành phố Đà Nẵng [14].
Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã đưa đoàn đi kiểm tra và khảo sát
thực địa tại Bán đảo Sơn Trà, rừng đặc dụng Nam Hải Vân và khu Bảo tồn thiên
nhiên Bà Nà Núi Chúa. Ước tính hiện nay Đà Nẵng có gần 2000 ha rừng bị dây
lang bìm bìm xâm hại chủ yếu là rừng đặc dụng, trong đó có 02 loài chính đó là
Bìm bìm hoa vàng và bìm bìm hoa trắng. Đoàn chuyên gia đã thu thập mẫu, khảo
sát điều kiện lập địa và có báo cáo sơ bộ ban đầu với UBND thành phố, sẽ gửi
báo cáo kỹ thuật cùng với các ý kiến đề xuất để làm cơ sở cho các công tác
nghiên cứu trong thời gian đến [14].
1.3. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên.
1.3.1. Alcaloid

Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glicosid. Các đường thường
gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhamnose; L-Arabinose…
Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp;
flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glicisid flavonol như:
rutin, querciitrin, daempherol. Kaempherol rất thường xuyên hiện diện.
Antocyanidine dạng glicosid thí dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin…tạo
màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái.
Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavone có màu vàng
nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng
đến cam-đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine;
catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu
cho nhiều loại hoa và trái. Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng
khuẩn kém nhưng ở môi trường acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 11
vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng Salmonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực
vật [7].
Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon (trích từ dây thuốc cá
Derris elliptica Benth, họ Đậu) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không
độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng
như hợp chất pyrethrin (trích từ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium,
họ Cúc).
1.3.3. Tinh dầu
Nói chung, tinh dầu trích ly từ thực vật có cấu trúc terpenoid. Từ 2000 năm
trước người ta đã biết sử dụng turpentine để trị ho. Mentol là alcol terpen trích từ
tinh dầu bạc hà có khả năng gây tê cục bộ, nên góp phần vào đặc tính trị ho của
nó. Các gia vị như: hồ tiêu, gừng, nhục đậu khấu, đinh hương…bên cạnh mùi vị
làm chúng có giá trị trong ngành ăn uống, chúng còn có tác dụng kháng khuẩn.
Nhiều tinh dầu có khả năng kháng khuẩn mạnh như: tinh dầu rau ngỗ Enhydra
fluctuans; tinh dầu hồi Illicium verum; tinh dầu quế Cinhamomum; tinh dầu long

Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis

Hình 1.6. Vi khuẩn Bacillus subtilis [9].
 Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường
đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng
sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa
sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis [9].
1.3.3. Đặc điểm hình thái
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 13
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 -
0,8m x 1,5 – 3m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di
động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm
giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự
nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại,
tia phóng xạ [9].
1.3.4. Đặc điểm nuôi cấy
 Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37
0
C
 Nhu cầu O
2
: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng
phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.

) nhiều gốc tự do và các
phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO
●
),
hydroperoxyl (HOO
●
), peroxyl (ROO
●
), alkoxyl (RO
●
), lipoperoxyde (LOO
•
),
H
2
O
2
.
Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng
phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA,… gây rối loạn các quá
trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn
công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với
những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây
chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể. Gốc tự do được tạo ra bằng
nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể
xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời,
thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy.
Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ
cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy
hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu

1.4.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu được kiểm
soát, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần
cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm
trùng, tăng cường miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co
bóp cơ thịt [2] [11].
1.4.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người
mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày.
Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như:
ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm
trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế
bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết.
Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên
mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp
các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở
DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn
nheo, cơ khớp cứng nhắc [2] [11].
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây:
Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và
tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ
nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu
kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được.
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 16
Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây
tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào.
Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây
ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty
lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc,

Nguồn gốc lấy mẫu:
Mẫu cây bìm Merremia eberhardtii tươi được tách trực tiếp từ cây
trên núi, mẫu thường được lấy buổi sáng và được xử lý sau khi được đưa tới
phòng thí nghiệm và được lấy từ 2 nguồn:
- Tại khu vực rừng phía nam chân đèo Hải Vân thuộc địa phận xã
Hòa Hiệp Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng.
- Khu vực bán đảo Sơn Trà (P.Thọ Quang, Q.Sơn Trà, Đà Nẵng)
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất
- Hóa chất pha dung dịch đệm, môi trường, dung môi và các loại hóa chất
khác. Một số hóa chất điển hình:
- Dung môi chiết tách:
+ Cồn
+ HCl của Trung Quốc
+ Etyl acetat của Trung Quốc
- Hóa chất pha dung dịch đệm:
+ NaCl
+ KCl
+ KH
2
PO
4
+ NaH
2
PO
4
+ Na
2
HPO
4

- Lò vi sóng: Model Sharp R-399VN(S)
- Máy nuôi lắc: Model Grant GLS400
- Tủ cấy - Bếp điện
- Cân kỹ thuật - Nồi hấp vô trùng
- Cân phân tích - Tủ ấm
- Máy đo pH - Cân phân tích
- Máy đo màu - Tủ lạnh
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp hoá lý
2.2.1.1. Phương pháp chiết các chất tan
 Quy trình ly trích mẫu cho quá trình nghiên cứu:
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 19
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tách chiết
2.2.2. Phương pháp vi sinh
2.2.2.1. Phương pháp pha loãng thập phân
Phương pháp này nhằm giảm số tế bào vi sinh vật sao cho phù hợp với quá
trình nghiên cứu.
Chuẩn bị một số môi trường lỏng vô khuẩn. Dùng pipet đưa vật phẩm
nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất, đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyền từ ống
nghiệm thứ nhất sang ống nghiệm thứ 2, rồi từ ống thứ 2 sang ống thứ 3, ống thứ
3 sang ống thứ 4,… Nhờ trình tự pha loãng mà số tế bào càng về cuối càng giảm
dần, tương ứng với độ pha loãng là 10
-1
÷10
-5
(hình 2.1). Sau khi pha loãng mẫu
được gieo cấy trên môi trường thạch đã đổ đĩa để tách từng khuẩn lạc một riêng
biệt [4].


4
ở các độ pha loãng khác nhau tương ứng với
độ pha loãng có bảng đối chiếu nồng độ vi khuẩn tương ứng. Đối chiếu độ đục
ống nghiệm với dãy ống Mc Faland sau đó đối chứng bảng ta sẽ biết nồng độ vi
khuẩn tương ứng. Dãy ống Mc Faland được pha như sau: Lấy 10 ống nghiệm
sạch, cho dung dịch BaCl
2
1% vào mỗi ống theo thứ tự từ 1 đến 10 (ống 1: 0,1ml;
ống 2: 0,2ml; cho đến ống thứ 10 là 1ml). Sau đó cho vào mỗi ống lượng vừa đủ
10ml dung dịch H
2
S0
4
1%, hàn kín miệng ống lại. Độ đục của mỗi ống tương ứng
với mật độ tế bào vi sinh vật theo dãy Mc Faland được cho ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Dãy ống chuẩn Mc faland xác định mật độ tế bào theo độ đục
STT Số vi khuẩn /ml (10
6
) STT Số vi khuẩn /ml (10
6
)
1 300 6 1800
2 600 7 2100
3 900 8 2400
4 1200 9 2700
5 1500 10 3000
2.2.2.3. Phương pháp khuếch tán đĩa
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 21
Cho chất cần nghiên cứu khuếch tán vào môi trường thạch có chứa vi sinh

cơ số 10, thường lấy vi khuẩn đã pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp thích hợp với
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 22
từng loại vi khuẩn. Đảm bảo có thể đếm được khuẩn lạc, ít nhất là hai ống có thể
nhìn thấy khuẩn lạc. Ở độ pha loãng cuối cùng lấy 0,1 ml dịch vi khuẩn cấy lên 2
đĩa môi trường, dùng que trang để dàn đều dịch trên bề mặt thạch. Sau đó nuôi ở
370C trong 24 giờ [10].
Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Chọn độ pha loãng có số khuẩn lạc từ
30 đến 300 khuẩn lạc trên 1 đĩa để đưa vào tính toán. Sau khi có số khuẩn lạc ta
tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng
Di theo công thức (2.1).
Mi (CFU/ml) = (2.1)
Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình /đĩa.
Di là độ pha loãng.
V là thể tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Mi là mật độ tế bào vi sinh vật trong đĩa i.
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở
các nồng độ pha loãng khác nhau.
Đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng cách so sánh lượng vi khuẩn nuôi
trong môi trường có chứa chất cần nghiên cứu (CFU chất nghiên cứu) với lượng
vi khuẩn nuôi trong môi trường có nước cất vô trùng đối chứng (CFU đối chứng)
theo công thức (2.2).
% vi khuẩn chết = ×100% (2.2)
2.2.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của dịch chiết từ thân cây Bìm Bìm
- Các dịch chiết thu được tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với vi khuẩn
B.subtilis [10].
- Môi trường được sử dụng ở đây là TSA, BHI.
- Dùng phương pháp vòng kháng khuẩn để kiểm tra phân đoạn nào có khả
năng kháng khuẩn.
Tiến hành:

Chuẩn bị 3 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1 ml môi trường
BHI.
Cho Bacillus subtilis lần lượt vào từng ống.
- Ủ tất cả các ống nghiệm trong tủ ấm 37ºC/24 giờ.
- Quan sát sự thay đổi độ đục của môi trường, sự tạo thành cặn ở đáy và sự
tạo váng ở bề mặt ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp điện hoá
Sử dụng pH meter đo pH dung dịch
Để đo pH dung dịch, người ta sử dụng các loại điện cực chỉ thị khác nhau
như: điện cực hidro, điện cực qiuhydon, điện cực thủy tinh. Khi nhúng điện cực
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 24
vào dung dịch, quá trình trao đổi ion H
+
giữa điện cực và dung dịch xuất hiện cân
bằng: H
+
(dung dịch)  H
+
(thủy tinh)
Do sự chênh lệch hoạt độ ion H
+
bề mặt thủy tinh xuất hiện điện thế E
m
.
Vậy thế điện cực của màng E
m
đặc trưng cho pH dung dịch nghiên cứu [5].
2.2.5. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH
2.2.5.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH

Khi cho vào hỗn hợp chứa các hợp chất peroxit thì Fe
2+
bị oxy hóa thành
Fe
3+
Fe
2+
- e + H
+
= Fe
3+
Fe
3+
+ SCN
-
= Fe(SCN)
3
(có màu đỏ máu)
Công thức tính phần trăm ức chế oxy hóa

%100.
Ao
AtAo
Hd
−
=
(2.3)
Trong đó: Hd: phần trăm ức chế oxy hóa.
A
0

2
(g) [5].
- Độ ẩm nguyên liệu được tính theo công thức sau:
%100.
01
21
mm
mm
W
−
−
=
(2-4)
Trong đó: m
0
: khối lượng cốc không có nguyên liệu, g.
m
1
: khối lượng của cốc và nguyên liệu trước khi sấy, g.
m
2
: khối lượng của cốc và nguyên liệu sau khi sấy, g.
PHẦN III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long