1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY
BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA
CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHÚ DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh
09/2005

Thành Phố Hồ Chí Minh
- 09 / 2005 -3

LỜI CẢM TẠ

ZY

Để hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận
tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nay tôi xin được
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

 Cha và Mẹ đã sinh thành, dạy dỗ con đạt được ngày hôm nay.

 Ts. Trần Thị Dung đã hết lòng hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi hoàn tất đề tài.

 Thầy Lưu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, góp ý và động viên trong suốt thời
gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

 Các Thầy – Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh.

 Các anh chị thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông
Lâm Tp.Hồ Chí Minh.

Cayenne thuộc 3 giống: Thái Lan, Trung Quốc và Lâm Đồng.

Các kết quả thu được:
¾

Ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa.
¾

Xây dựng được quy trình RT-PCR phát hiện PMWaV-1 qua việc xác định
được các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer và số chu kỳ tối ưu cho
phản ứng.
¾
Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự cho thấy nằm đúng vùng gene
HSP 70 cần nhân bản và hoàn toàn đặc hiệu cho PMWaV-1. Như vậy, quy
trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy trong việc phát hiện
PMWaV-1

¾
Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 trên cả 3 giống dứa Cayenne được giám định đều
rất cao, giống Thái Lan: 53,3%, giống Trung Quốc: 46,7% và giống Lâm
Đồng: 46,7%. Kết quả này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏ đầu
lá đang đe dọa người trồng dứa và đòi hỏi cấp thiết một phương pháp
phòng trừ bệnh hiệu quả. 5
MỤC LỤC

19
2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).............................19
2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) ......................................................................20
2.8.2.5 Taq – polymerase .......................................................................20
2.8.2.6 Số chu kỳ của phản ứng PCR.....................................................21
2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR)...................................21
2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA. (Sequencing)...................................................24 6
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu. ......................................................................................25
3.1.1 Mẫu .......................................................................................................25
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị................................................................................25
3.1.3 Hóa chất ................................................................................................26
3.1.3.1 Hoá chất dùng cho tách chiết RNA .............................................26
3.1.3.2 Hoá chất dùng cho phản ứng RT-PCR........................................26
3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA .................................................27
3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA .................................................28
3.2 Phương pháp nghiên cứu...............................................................................28
3.2.1 Tách chiết RNA ....................................................................................28
3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA.............................................................29
3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR ................................................................30
3.2.3.1 Khảo sát độ đặc hiệu của primer .................................................30
3.2.3.2 Xác định chu kỳ nhiệt tối ưu .......................................................30
3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp.............................................31
3.2.3.4 Xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR......................31

bp : base pair
cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphophate
ddNTP : Dideoxyribonucleotide triphophate
DNA : Deoxyribo nucleic acid
ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
HSP 70 : Heat shock protein 70
mRNA : messenger Ribonucleic acid
NCBI : National Center for Biotechnology Information
Nu : Nucleotide
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCV : Pineapple Closterovirus
PMWaV-1 : Pineapple mealybug wilt associated virus – 1
RNA : Ribonucleic acid
RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
TBIA : Tissue Blotting Immuno Assay
Taq-polymerase : Thermos aquaticus - polymerase
Tm : Melting temperature


9 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG



Đặt vấn đề
Cây dứa (
Ananas comosus
) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng
trên thế giới. Ngoài giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin cao, cây dứa còn được
xem là hoàng hậu của các loại quả vì có hương vị thơm ngon và rất hợp khẩu vị của
người phương Tây. Bên cạnh đó, dứa còn được dùng làm nguyên liệu cho rất nhiều
sản phẩm chế biến: dứa hộp, dứa khoanh, nước dứa cô đặc, điều chế bromelin... nên
hiện nay, dứa đang được xem là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Về mặt
trồng trọt, cây dứa vốn không kén đất, các vùng gò, đồi, đất xấu, nghèo dinh
dưỡng... đều có thể trồng dứa. Vì vậy ở nước ta, từ những vùng đồi khô hạn đến các
vùng chịu nhiều thiên tai, gió bão, nắng nóng, từ vùng trung du bán sơn địa ở miền
Bắc đến những vùng đất nhiễm phèn, chua, mặn ở miền Nam đâu đâu cũng trồng
được dứa.
Chính vì vừa là một loại cây công nghiệp có giá trị cao, vừa thích hợp phát
triển qui mô ở những vùng đất xấu, kén cây trồng nên có thể nói, đối với nước ta cây
dứa chứa đựng một tiềm năng kinh tế - xã hội rất lớn. Trong các giống dứa chính,
cây dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm phù hợp với công nghệ chế biến đồ hộp (quả
lớn, mắt cạn, cùi nhỏ) nên đang được trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, dứa
Cayenne chiếm 80% diện tích trồng dứa trên toàn thế cầu. Ở nước ta, do trước đây
dứa Cayenne ít được trồng phổ biến nên từ năm 1998 đến nay, Chính phủ và các địa
phương đã đầu tư nhiều tỷ đồng để nhập chồi dứa Cayenne từ Trung Quốc, Thái
Lan... nhằm tăng diện tích trồng dứa, mở rộng các vùng dứa nguyên liệu cho chế
biến trong nước. Ở miền Nam, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang
nằm trong chương trình cung cấp giống cây, con chất lượng cao của Sở Nông
Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, cây dứa
Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá hoại, đặc biệt là khả năng
nhiễm bệnh wilt - bệnh héo đỏ đầu lá rất cao.



-

Khảo sát các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer, số chu kỳ thích hợp để
thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1
.

-

Giải trình tự đoạn khuếch đại để kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm.

-

Giám định PMWaV-1 trên chồi dứa các giống Thái Lan, Trung Quốc, Lâm
Đồng

12
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm chung của cây dứa
Cây dứa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, được tìm thấy lần đầu tiên
bởi Christopher Columbus khi ông cùng các thủy thủ đặt chân lên đảo Guadeloupe
năm 1943. Ở cuối thế kỷ 16, cây dứa được du nhập vào châu Á và đến cuối thế kỷ
17, nó đã được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới trên thế giới. Ở Việt
Nam, cây dứa đã được du nhập và trồng từ hơn 130 năm trước. Dứa được trồng
nhiều ở các tỉnh phía Nam (75,43% tổng diện tích dứa cả nước), trong đó các tỉnh
Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm 69,36% diện tích dứa cả nước (Đường Hồng Dật,

C và lượng mưa bình quân 1300 - 1500 mm/năm. Về thổ nhưỡng,
dứa thích hợp với đất đồi, đất badan, thậm chí đất xấu. Đặc biệt với đất phèn, không
thể trồng lúa, trồng hoa màu nhưng trồng dứa lại rất tốt. Dứa có khả năng chống xói
mòn, giữ màu cho đất nếu trồng với mật độ hợp lý (45.000 - 65.000 cây/ha). Cây
dứa lại bảo đảm cho thu hoạch chắc chắn vì dứa không có hiện tượng ra hoa khó,
rụng đài như nhiều loại cây ăn quả khác nên năng suất ổn định, không có hiện tượng
mất mùa.
Như vậy, ngoài vùng đồng bằng chúng ta có thể trồng dứa trên toàn bộ vùng
đất đồi có độ dốc dưới 20 độ với khoảng 8.700 ha ở miền Bắc, hơn 10.000 ha ở miền
Trung, Tây Nguyên và hàng ngàn hecta đất phèn ở Nam Bộ.

2.2 Phân loại
Dứa có tên khoa học là
Ananas comosus
thuộc:
Chi:
Ananas
Merr
Họ:
Bromeliaceae

Bộ:
Farinosae

Theo Trần Thế Tục (2001), các giống dứa đang được trồng hiện nay được
chia thành 3 nhóm chính: dứa Cayenne, dứa Queen và dứa Spanish.
*

Nhóm dứa Cayenne
Lá dài và dày, không gai hoặc có ít ở đầu chóp lá. Quả dứa Cayenne chứa

vườn dứa Phú Thọ chóng bị còi, ngay vụ thứ hai năng suất đã thấp và phá đi để
trồng lại có thể kinh tế hơn. Dứa Phú Thọ chịu được đất xấu, giỏi chịu đất chua, rất
dễ ra hoa, có khi chỉ 4 - 5 tháng sau khi trồng đã ra hoa, 4 - 5 tháng sau khi ra hoa sẽ
chín. Xử lý bằng ethylen dễ đạt 100% cây ra hoa. Xử lý xong một vài giờ sau gặp
mưa vẫn ra hoa tốt. Nhược điểm lớn nhất là trái nhỏ, năng suất thấp, độ chua cao và
ít nước nên dùng để ép nước thì không có lợi. Giống dứa Hoa Phú Thọ trồng phổ
biến ở vùng trung du Bắc Bộ, và được coi là một giống quảng canh. 15
*

Dứa Na Hoa (Hoa Bali)
Giống này có đủ đặc tính của dứa hoa, tức là có mắt nhỏ lồi, khi chín da trái
màu vàng, thịt vàng. Lá ngắn và to, trái to hơn dứa Hoa Phú Thọ, nặng trung bình 1
kg/trái ở miền Bắc và 1 - 1,5 kg/trái ở miền Nam. Nước cũng nhiều hơn và khi chín
muồi thì thịt dứa hơi có mùi thối. Nhiều chồi cuống và ít chồi nách, chỉ cần tỉa chồi
một cách thích đáng vụ thứ hai vẫn cho trái to. Ở Phú Hộ người ta trồng quanh nhà
giống này, có thể dễ dàng giữ 4 - 5 năm, trong khi dứa Phú Thọ chỉ sau 2 - 3 năm thì
không cho trái nữa. Chất lượng vẫn tốt nếu thu hoạch kịp thời.
*

Dứa Ta Spanish (dứa nếp, dứa mật)
Về mặt thực vật học, lá tương đối mỏng, thân dài có khi bò ngang mặt đất, ít
chồi nách và chồi cuống. Trái ngắn, khối lượng nhỏ hơn dứa Cayenne. Chất lượng
và năng suất dứa Ta thấp. Dứa Ta sống lâu, chịu được bóng râm và có vỏ dày, dễ
dàng trong vận chuyển. Năng suất dứa Ta cao hơn dứa Hoa và thấp hơn dứa
Cayenne, về chất lượng thì thấp hơn cả hai.
*


thấp hơn dứa Hoa), mùi thanh, rất hợp khẩu vị người phương Tây. Mắt dứa Cayenne
lại rất cạn, gọt vỏ xong không cần lấy mắt có thể ăn ngay. Những ưu điểm trên rất
thuận lợi cho việc chế biến, đóng hộp qui mô công nghiệp nên dứa Cayenne là
nguyên liệu chính cho ngành công nghịêp chế biến - xuất khẩu dứa và hầu như toàn
bộ diện tích dứa Cayenne ở nước ta hiện nay đều là vùng nguyên liệu của các nhà
máy chế biến dứa.

2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam
Theo tài liệu hội thảo của Viện Nghiên Cứu cây Ăn Quả Miền Nam, trong
những năm gần đây sản lượng dứa xuất khẩu của thế giới dao động khoảng
12,15 - 13,7 triệu tấn/năm. Châu Á có sản lượng dứa xuất khẩu lớn nhất, chiếm 52%
sản lượng dứa thế giới, tiếp theo là Châu Mỹ (31%), Châu Phi (15,4%), Châu Âu và
Châu Đại Dương chỉ chiếm 1,4%.
Các sản phẩm chế biến của dứa được lưu thông trên thế giới dưới dạng dứa
hộp và nước dứa. Dứa hộp gồm có dứa khoanh, dứa rẻ quạt, dứa miếng, dứa nghiền.
Nước dứa gồm nước dứa cô đặc và nước dứa thường. Trong đó các nước sản xuất và

17
xuất khẩu dứa nhiều nhất là Philippines, Thái Lan, Dominica, Honduras, Mexico,
Costarica, Malaysia… Còn các nước là thị trường tiêu thụ dứa chính trên thế giới
gồm: Nhật, Italia, Anh, Pháp, Đức, Hà Lan, Canada, Mỹ, Tây Ban Nha, Bỉ…
Ở Việt Nam, theo Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông
Thôn (1996) thì diện tích trồng dứa toàn quốc đạt 36.541 ha. Trong đó, diện tích của
các tỉnh miền Bắc là 9.675 ha (chiếm 26,48%), diện tích dứa của các tỉnh miền Nam
là 26.866 ha (chiếm 73,52%), trong đó diện tích dứa của các tỉnh Đồng Bằng Sông
Cửu Long lên đến 22.787 ha, chiếm đến 62,36% diện tích dứa cả nước. Một số tỉnh
trồng nhiều dứa trong nước là: Kiên Giang: 12.006 ha, Minh Hải: 4704 ha, Tiền
Giang: 3889 ha, Thanh Hoá: 3097 ha ……
Về sản lượng dứa tươi, những năm gần đây cả nước đạt 234.000 tấn/năm
(Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 1996). Tốc độ

chưa có biện pháp phòng trừ triệt để ngoài việc hạn chế sự lây lan là diệt môi giới
truyền bệnh (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2001).
Virus gây bệnh được bảo tồn và lan truyền sang đời sau chủ yếu qua chồi
giống và tàn dư của cây bệnh. Những chồi giống mang mầm bệnh lại thường chỉ
biểu hiện triệu chứng vào giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa trở đi, tức là sau
một thời gian trồng rất dài (9 - 12 tháng). Chính đặc điểm này của bệnh héo đỏ đầu
lá đã gây nên những thiệt hại kinh tế to lớn cho người trồng dứa. Năm 1920, ở
Hawaii, sản lượng dứa bị giảm thấp đáng kể do sự lan tràn mạnh mẽ của bệnh đã
làm nhiều nhà sản xuất phải bỏ nghề trồng dứa. Còn ở Cuba hiện nay, bệnh héo đỏ
đầu lá đã làm giảm 40% sản lượng dứa hằng năm (Borroto E.G. và ctv, 1998).

*

Triệu chứng
Theo Nguyễn Văn Kế (2002), cây bị héo đỏ đầu lá thì lá bị đỏ, bắt đầu từ lá
phía dưới đỏ lên, lá như bị mất nước, vặn vẹo, bìa lá cuốn về phía dưới, đầu lá cong
xuống đất, chuyển qua nâu rồi hoại dần. Rễ ở những cây bị nhiễm bệnh cũng bị hư
hoại, khi nhổ lên thì thấy phần vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi như một cái ống.

19


brevipes
) thường bám vào rễ, vào các phần bên dưới của cây.

Hình 2.5: Rệp xám (
Dysmicoccus neobrevipes
), rệp hồng (
Dysmicoccus
neobrevipes
) và vị trí thường gặp của chúng trên cây dứa.
(
Nguồn
: http://www.bromeliadbiota.ifas.ufl.edu)

21
Sether D.M. và Hu J.S., (2002) còn nghiên cứu thấy nếu không có sự hiện
diện của rệp thì dù cây có mang PMWaV cũng không xuất hiện triệu chứng bệnh.
Từ đó, các ông đặt giả thuyết rằng bệnh héo đỏ đầu lá khi phát sinh có liên quan đến
chất độc trong nước bọt của rệp - rệp sáp không chỉ là trung gian lây truyền bệnh mà

(Nguồn: http://www2.ctahr.hawaii.edu/ t-star/mealybug.htm)
Mealybug22
* Biện pháp phòng trừ
Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2002), cần áp dụng
các biện pháp phòng trừ tổng hợp như:
-

Chọn giống từ vùng ít bệnh.
-

Khử chồi bằng cách nhúng vào dung dịch thuốc trừ sâu như: Bi58,
Supracid trong 5 phút, dựng đứng chồi lên cho thuốc tác dụng vào tận nách lá.
-

Trước khi trồng, khử đất bằng Diazon để trừ kiến và các ổ rệp. Làm sạch
cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và
kiến.
-

Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp và kiến.
Tuy nhiên, những biện pháp này chỉ có tác dụng kiểm soát trung gian gây
bệnh, tránh bệnh lây lan, phát tán chứ không thể phòng trừ bệnh triệt để.

2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam

Dysmicoccus neobrevipes
. Xác định được rệp sáp là trung
gian lây truyền PMWaV.
-

Năm 2001, Sether và cộng sự xác định được PMWaV gồm 2 dòng:
PMWaV-1 và PMWaV-2. Bộ gene của chúng đã được giải trình tự và phân loại.
Cũng trong nghiên cứu này, các mẫu dứa thu thập từ 17 nước trên thế giới đã được
test PMWaV với kỹ thuật TBIA và RT-PCR với kết quả 100% các quốc gia trong thí
nghiệm đều có dứa nhiễm PMWaV.
-

Năm 2002, Sether và Hu chứng minh cây mang PMWaV nhưng không có
rệp sáp thì không xuất hiện bệnh. Tác giả đã đề ra giả thuyết độc tố trong nước bọt
của rệp sáp cũng là một tác nhân cần thiết để gây bệnh. Tiến hành xử lý nhiệt để khử
PMWaV trên các chồi dứa mang virus.
Ở Việt Nam, nhìn chung chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá.
Các thí nghiệm chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan giữa mật độ rệp với mức
độ bệnh trên dứa và thống kê tình hình phân bố bệnh ở một số địa phương.
-

Theo nghiên cứu của Phan Gia Tân (1984), trên giống dứa Queen, nếu chỉ
có 6% số cây có rệp và mỗi cây có 1 – 10 con rệp thì cây chưa bị nhiễm bệnh hoặc
nhiễm rất nhẹ. Với 90 – 92% cây có rệp và lượng rệp lẫn ấu trùng trên mỗi cây là
51 – 200 con thì cây bị nhiễm bệnh ở mức độ trung bình. Với 92% cây có rệp và mật
độ ấu trùng trên 300 con/cây thì cây bị nhiễm bệnh nặng.
-

Một số thống kê về tình hình bệnh đỏ đầu lá của trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM cho thấy bệnh héo đỏ đầu lá xuất hiện ở các vùng được nghiên cứu

PMWaV thật chính xác thì ta sẽ phòng chống được bệnh héo đỏ đầu lá thật sự hữu
hiệu, nâng cao năng suất của cây dứa, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho xã hội

2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV
Từ các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá đã thực hiện trên thế giới cho thấy,
hiện nay có 3 phương pháp chính để chẩn đoán PMWaV-1 trên cây dứa.
-

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): năm
1978, Clark và Adam đã lần đầu tiên áp dụng thành công phương pháp này để chẩn
đoán bệnh virus hại khoai tây. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc
kháng nguyên – kháng thể. Hiện nay đây là phương pháp huyết thanh hiện đại và
nhanh chóng để chẩn đoán các bệnh virus. 25
-

Phương pháp TBIA (Tissue Bloting Immuno Assay): phương pháp này
được Lin và ctv sử dụng lần đầu tiên năm 1990 cũng hoạt động dựa trên nguyên tắc
kháng nguyên – kháng thể. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn ELISA vì nó
không đòi hỏi phải chuẩn bị mẫu tỷ mỉ và có thể cung cấp thông tin về sự phân bố
virus trong mẫu bệnh.
-

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction): là phương pháp nhân nhanh mRNA, gồm 2 bước: mRNA của virus được
phiên mã ngược thành cDNA, sau đó cDNA này sẽ được khuếch đại. Kỹ thuật cho
phép phát hiện và phân biệt được nhiều dòng virus gần giống nhau.
Các phương pháp trên đều có những ưu điểm riêng. Với ELISA, TBIA tuy giá