BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM
NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: MAI MINH MẪN
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
* Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ
Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các quý thầy cô đã tận tụy
truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại
trƣờng.
* ThS. Hồ Thị Nga, BSTY. Nguyễn Kiên Cƣờng, đã trực tiếp hƣớng dẫn và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
* PGS.TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã giúp đỡ cũng nhƣ động viên
lúc tôi gặp khó khăn.
* TS. Dƣơng Nguyên Khang cùng các thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo
mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt đề tài.
* Thầy Đinh Xuân Phát, Cô Quách Tuyết Anh đã dành thời gian quý báu để
cung cấp cho tôi những tài liệu, kinh nghiệm quý báu.
* Cùng toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt
thời gian học tập tại trƣờng.
Sinh viên thực hiện
MAI MINH MẪN iv
TÓM TẮT
MAI MINH MẪN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007.
“BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ
TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ”
Giáo viên hƣớng dẫn:
ThS. Hồ Thị Nga
v
SUMMARY
MAI MINH MAN, Nong Lam University, August 2007.
“THE INITIAL STEP OF SETTING UP STAINING RABBIT
PERIPHERAL BLOOD CHROMOSOME PROCESS”
Supervisors
HO THI NGA, MSc
NGUYEN KIEN CUONG, DMV
A study was carried out on rabbit chromosome at physiology laboratory of
Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University Ho Chi
Minh City.
Chromosome is an element which affects the species genetics. Setting up
karyotype of species is the initial step of researching extendedly into species’
genetic mechanism. The most effective researching karyotype method is that
culturing and staining lymphocyte.
Rabbit peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured with two
dosages, 0,4 ml and 1 ml. It was cultured in RPMI 1640 medium which
supplements some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), pokeweed (lectin),
antimycotic – antibiotic.
Blood cell was cultured primarily in Rough vase for 72 hours at 37
0
C. In
addition, 15 ml falcon tubes were also used to culture. After 72 hours, we added
colcemid to medium and incubate in 20 min, 40 min and 60 min before the cell was
fixed.
The best result was that culturing 1 ml rabbit peripheral blood and
incubating with colcemid in 60 min. Besides, the cells also grew and divided when
they were cultured in 15 ml falcon tubes. So that, we could replace Rough vase with
15 ml falcon tubes in culturing blood leukocytes. However, we haven’t established
rabbit karyotype yet because chromosome didn’t spread on slides.
2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể ................................................... 8
2.3 Chu Kỳ sống của tế bào ............................................................................... 9
2.3.1 Gian kỳ ................................................................................................... 9
vii
2.3.1.1 Pha G1 ............................................................................................ 10
2.3.1.2 Pha S ............................................................................................... 10
2.3.1.3 Pha G2 ............................................................................................ 10
2.3.1.4 Phân bào ......................................................................................... 10
2.3.2 Nguyên phân ........................................................................................ 11
2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân ............................................................ 11
2.3.2.2 Các kỳ của phân bào ...................................................................... 12
2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể ........................................ 14
2.4.1 Kỹ thuật splash ..................................................................................... 14
2.4.2 Kỹ thuật squash .................................................................................... 16
2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ .............................................. 16
Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................... 20
3.1 Thời gian và địa điểm................................................................................. 20
3.2 Đối tƣợng ................................................................................................... 20
3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20
3.4 Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 20
3.4.1 Thiết bị ................................................................................................. 20
3.4.2 Dụng cụ ................................................................................................ 21
3.4.3 Hóa chất ............................................................................................... 21
3.5 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 23
3.5.1 Thí nghiệm 1 ........................................................................................ 23
3.5.2 Thí nghiệm 2 ........................................................................................ 23
3.5.3 Thí nghiệm 3 ........................................................................................ 24
3.5.4 Chỉ tiêu quan sát ................................................................................... 24
3.6 Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24
ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid deoxyribonucleotide
ARN Acid ribonucleotide
Ctv Cộng tác viên
IU International unit
FBS Fetal bovine serum
NST Nhiễm sắc thể
PHA Phytohemaglutinin
PBS Phosphate buffer saline
xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Nhiễm sắc thể ......................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể ........................................................................... 6
Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể ................................................................... 7
Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể ........................................ 8
Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào .......................................................................... 9
Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm ...................................................... 13
Hình 2.7 Kiểu nhân tế bào thỏ đực ...................................................................... 19
Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai .................................................... 25
Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu ...................................................................... 26
Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa ......................................................... 33
Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ ................................................................. 33
Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu .................................................. 34
Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ ........................................................ 36
Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đều trên phiến kính ...................................... 37
1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Tế bào là đơn vị tổ chức cơ bản của cơ thể sống. Trong tế bào có chứa các
- Thử nghiệm quy trình nhuộm ở các mức thời gian ủ khác nhau.
- Thử nghiệm quy trình nhuộm với lƣợng máu nuôi cấy khác nhau.
- Thử nghiệm nuôi cấy tế bào máu thỏ trên ống nghiệm 15 ml.
3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về thỏ
Thỏ có nguồn gốc từ thỏ rừng, đã đƣợc con ngƣời thuần hoá hơn 1000 năm
trƣớc công nguyên và trở thành thỏ nhà với tên khoa học là Oryctolagus Cesnoaclus
Domesticies.
2.1.1 Phân loài
־ Bộ gặm nhấm: Rodentia
־ Lớp: Lagomorpha
sinh ra enzyme thrombokinase có tác dụng làm đông máu. Khi nuôi cấy tế bào máu,
ngƣời ta dùng heparin để kháng lại cơ chế đông máu. Heparin có trong đại thực bào
của gan, phổi và bạch cầu ƣa base, chúng không gây độc đối với tế bào.
4
Bạch cầu giữ nhiệm vụ bảo vệ cơ thể, số lƣợng bạch cầu ở thỏ khoảng
7.600 trong 1mm
3
máu (Trịnh Văn Thịnh, 1978). Bạch cầu gồm hai nhóm: bạch cầu
có hạt và bạch cầu không hạt. Bạch cầu có hạt gồm: trung tính, acid và base. Bạch
cầu không hạt gồm: đơn nhân lớn và lympho. Trong đó, bạch cầu lympho có khả
năng phân chia nhanh và nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro (Eldridge, 1985).
2.2 Nhiễm sắc thể
2.2.1 Khái niệm
Nhiễm sắc thể (NST) là những cấu trúc hiển vi trong nhân tế bào, cấu tạo
chủ yếu từ DNA và protein histon, có khả năng tự nhân đôi và biến đổi hình thái
cấu trúc theo qui luật trong các quá trình phân bào.
Nhiễm sắc thể tồn tại trong nhân tế bào soma thành từng cặp đồng dạng,
trong đó một NST có nguồn gốc từ bố và một có nguồn gốc từ mẹ. Trong các tế bào
bình thƣờng mỗi NST gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), còn trong các giao tử NST
đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử. Mỗi loài bình thƣờng có bộ NST lƣỡng bội (2n)
đặc trƣng về số lƣợng, hình thái, cấu trúc và ổn định tƣơng đối qua các thế hệ. Kiểu
nhân (karyotype) là thuật ngữ dùng chỉ số lƣợng và hình dạng của các NST chuyên
biệt cho mỗi loài.
Hình 2.1 Nhiễm sắc thể
(Nguồn http://mbbnet.umn.edu/icons/chromosome.jpeg)
2.2.2 Hình thái và kích thƣớc
Nhiễm sắc thể quan sát ở trung kỳ thƣờng có hình dạng chấm hoặc hình
que, thƣờng có kích thƣớc đƣờng kính khoảng 0,2 µm đến 3 µm và chiều dài chiều
Bộ đa bội (polyploid) đặc trƣng cho tế bào và cơ thể đa bội. Số NST
đƣợc tăng lên theo bội số của n khởi nguyên.
6
2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể
2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể
a) Nhiễm sắc thể thƣờng và nhiễm sắc thể giới tính
Trong bộ lƣỡng bội (2n) thƣờng tồn tại nhiều cặp tƣơng đồng giống nhau về
hình dạng, kích thƣớc đƣợc gọi là NST thƣờng (autosome). Ngoài ra còn có 1 cặp
NST trong đó 2 thành viên khác nhau về hình dạng, kích thƣớc hoặc trạng thái hoạt
động đƣợc gọi là NST giới tính (sex chromosome).
Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể
(Nguồn http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/chromosome.jpg)
b) Centromere
Centromere là cấu trúc định khu trên chiều dọc NST ở vùng đƣợc gọi là eo
thƣa cấp một. Centromere là vùng phân hóa của NST có vai trò đính kết hai nhiễm
sắc tử với nhau, đồng thời giúp cho nhiễm sắc tử phân ly khỏi nhau và di chuyển về
hai cực của tế bào nhờ các sợi của thoi vô sắc.
Centromere chia NST thành 2 vế, chiều của 2 vế phụ thuộc vào vị trí
centromere. Ngƣời ta thành lập chỉ số centromere (centromere index – Ic) để xác
định vị trí của centromere và các kiểu hình NST.
P: chiều dài vế ngắn.
Q: chiều dài vế dài.
7
Theo Eldridge (1985), nhiễm sắc thể có các kiểu hình sau:
־ Acrocentric có centromere ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc.
־ Telocentric có centromere ở ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể.
־ Subtelocentric có centromere nằm gần điểm tận cùng nhiễm sắc thể.
2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể
a) Sợi nucleosome
Trong nhiễm sắc thể, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn
nhiều cấp, đƣợc gọi là sợi nhiễm sắc. Sợi nhiễm sắc cơ bản có đƣờng kính 11 nm, là
chuỗi hạt cƣờm, đƣợc gọi là sợi nucleosome. Mỗi hạt cƣờm là một nucleosome có
kích thƣớc 11 nm dạng khúc giò gồm lõi đƣợc cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2 H
2
A,
2 H
2
B, 2 H
3
, và 2 H
4
), sợi xoắn kép ADN cuốn xung quanh lõi histon với 1,75 vòng
(chứa khoảng 146 cặp nucleotid). Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép ADN
dài khoảng 60 nucleotid.
Các sợi nucleosome gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H
1
, mỗi cuộn gồm
sáu nucleosome, để tạo thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đƣờng kính 30nm, đƣợc
gọi là sợi solenoid.
b) Các cấp độ cấu trúc nhiễm sắc thể
Sợi solenoid sẽ gấp khúc tạo nên các vòng bên (looped domains) chứa
khoảng 20.000 – 80.000 cặp nucleotid và có kích thƣớc khoảng 300nm. Các sợi 300
nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700nm đến 1400nm
tức là các nhiễm sắc tử. Ngoài protein histon, trong NST còn có nhiều protein axit
có vai trò điều hòa hoạt động của gen.
Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể
pha S là pha tổng hợp ADN.
Vào cuối pha G1 có một thời điểm đƣợc gọi là điểm hạn định (restriction
point), điểm R. Nếu tế bào vƣợt qua điểm R, chúng tiếp tục đi vào pha S. Trong
nuôi cấy tế bào, tế bào có vƣợt qua điểm hạn định hay không phụ thuộc rất nhiều
vào điều kiện một trƣờng. Nhân tố điều chỉnh thời điểm R là hệ protein phức tạp
trong đó có các cyclin và kinase. Đối với các tế bào biệt hóa thì tế bào không vƣợt
qua R mà đi vào quá trình biệt hóa tế bào.
2.3.1.2 Pha S
Pha S là pha tiếp theo pha G1, đƣợc gọi là pha tổng hợp ADN vì chính
trong pha này xảy ra sự tái bản ADN và nhân đôi số lƣợng NST của tế bào. Vào
cuối pha G1, tế bào tổng hợp một loại protein đặc trƣng là cylin A và nhanh chóng
tích lũy trong nhân tế bào. Protein cyclin A cùng với enzyme kinase sẽ xúc tiến sự
tái bản ADN. Protein cyclin A tác động cho tới cuối pha S thì biến mất. Thời gian
kéo dài của pha S ở đa số tế bào nhân thực tƣơng đối ổn định từ 6 – 8 giờ.
2.3.1.2 Pha G2
Tiếp theo S là pha G2, thời gian của G2 ngắn từ 1 – 4 giờ. Trong pha G2,
các ARN và protein đƣợc tổng hợp chuẩn bị cho sự phân bào. Cuối pha G2 một
protein đƣợc tổng hợp là cyclin b đƣợc tích lũy trong nhân cho đến tiền kỳ phân
bào. Cyclin b hoạt hóa enzyme kinase tạo thành các vi ống tubulin hình thành các
thoi phân bào.
2.3.1.2 Phân bào
Tiếp theo pha G2 là pha M (mitosis) thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành hai
tế bào con. Sự phân bào là phƣơng thức sinh sản của tế bào, và là phƣơng thức tế
bào mẹ truyền thông tin di truyền chứa DNA cho hai tế bào con. Ngƣời ta phân biệt
bốn dạng phân bào sau: nguyên phân, giảm phân, trực phân, nội phân.
11
2.3.2 Nguyên phân
2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân
Nguyên phân hay còn đƣợc gọi là phân bào nguyên nhiễm, xảy ra trong pha
bào chất quanh thoi phân bào. Khi vùng nhân biến mất thì thoi vô sắc di chuyển
chiếm ngay vị trí trung tâm. Lúc này centromere đƣợc phân hóa thành 2 cấu trúc
đƣợc gọi là tâm động có kích thƣớc khoảng 1 µm. Thông qua tâm động, NST đƣợc
đính với các sợi tâm động của thoi.
c) Trung kỳ (metaphase)
Đối với tế bào động vật, thời gian tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất ngắn, chỉ
kéo dài từ năm đến bảy phút (Eldridge, 1985). Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể
xoắn, cô đặc, co ngắn tối đa và sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo
nên tấm trung kỳ. Tấm trung kỳ nằm thẳng góc với trục dọc của thoi. Đây cũng là
thời điểm có thể quan sát hình dạng, số lƣợng NST rõ nhất. Vì thế ngƣời ta thƣờng
tập trung vào giai đoạn này để nghiên cứu kiểu nhân hay đặc điểm NST của mỗi
loài.
d) Hậu kỳ (anaphase)
Nhiễm sắc thể tách đôi và rời khỏi nhau tạo thành hai NST con độc lập.
Nhiễm sắc thể con di chuyển về 2 cực nhờ sự co ngắn của sợi tâm động, phối hợp
với sự kéo dài của các sợi cực và hẹp lại của thoi.
e) Mạt kỳ (telophase)
Trong kỳ này, các NST con đã di chuyển đến hai cực, giãn xoắn, dài ra và
biến dạng thành chất nhiễm sắc. Hạch nhân đƣợc tái tạo, hình thành 2 nhân con
trong khối tế bào chất chung.
Quá trình phân chia tế bào chất của tế bào bắt đầu từ cuối hậu kỳ hoặc đầu
mạt kỳ và diễn ra suốt mạt kỳ. Sự phân chia này bắt đầu bởi sự hình thành một eo
thắt, đƣợc cấu tạo bởi các vòng vi sợi actin nằm giữa hai nhân con. Khi vòng vi sợi
actin co rút kéo theo phần màng sinh chất lõm thắt vào trung tâm, và khi màng nối
với nhau sẽ phân tách tế bào chất thành 2 nửa, mỗi nửa chứa một nhân con. Mặt
phẳng phân cắt tế bào chất thẳng góc với trục của thoi phân bào.
13 Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm
bào” vẫn đƣợc dùng, mặc dù lĩnh vực này đã đƣợc mở rộng từ thập niên 1950 khi
các nhà khoa học đã sử dụng những tế bào nuôi cấy rời (Eldridge, 1985).
Copyright: Tài liệu đại học ©