bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn
viện di truyền nông nghiệp
báo cáo tổng kết đề tài kc 04.19

nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính,
hạt nhân tạo trong nhân nhanh một số cây
có giá trị kinh tế chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Đỗ Năng Vịnh
Mục lục Danh mục các chữ viết tắt
Bài tóm tắt
Mở đầu
I. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây lily
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở đối tợng lily
2. Tổng quan tài liệu về lily
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Qui trình công nghệ tạo củ nhỏ và siêu nhỏ ở lily
- Qui trình tạo hạt nhân tạo
- Qui trình tạo củ siêu nhỏ trong bioreactor
- Qui trình công nghệ vờn ơm
5. Kết luận
II. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây hồng môn
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở đối tợng hồng môn
2. Đặt vấn đề
3. Phơng pháp thí nghiệm
4. Kết quả và thảo luận
- Nghiên cứu khảo sát ảnh hởng của các giống cây hồng môn lên
cảm ứng tạo callus từ mô lá
- Nghiên cứu ảnh hởng của nồng độ và sự phối hợp các chất nhóm
auxin với cytokinin đến phản ứng tạo callus của các loại mô in vitro
- Nghiên cứu tái sinh chồi bất định qua nuôi cấy lỏng và nuôi cấy
lỏng lắc kết hợp nuôi cấy đặc
- Nghiên cứu ảnh hởng của hàm lợng đờng và chất điều tiết sinh

- Quy trình tạo hạt tếch nhân tạo
- Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây tếch
- Quy trình kỹ thuật chăm sóc tếch sau nuôi cấy in vitro
5.
Kết luận
V. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây Bạch đàn
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở đối tợng Bạch đàn
2. Đặt vấn đề
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các lát cắt thân và lá non Bạch
đàn
- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá ở Bạch đàn
- Nghiên cứu tạo phôi mầm từ lát cắt mỏng thân chồi Bạch đàn in
vitro
- Quy trình tạo hạt Bạch đàn nhân tạo
- Quy trình kỹ thuật chăm sóc Bạch đàn sau nuôi cấy in vitro
5. Kết luận
VI. Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong
nhân nhanh cây Trầm hơng
1. Tóm tắt sản phẩm KHCN thu đợc ở Trầm hơng
2. Tổng quan tài liệu về cây Trầm hơng
3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
4. Kết quả và thảo luận
- Tạo vật liệu nuôi cấy in vitro cây Trầm hơng
- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các loại mô nuôi cấy khác nhau
ở cây Trầm hơng
- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá và tạo phôi vô
tính


α-NAA α- Naphtalene acetic acid
2,4-D 2,4- Dichlorophenoxy acetic acid
BAP Benzyl amino purine
C§HST ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng
GA3 Giberrelin
IAA Indole-3-acetic acid
IBA Indole-3-butyric acid
MT M«i tr−êng
TB Trung b×nh Mở đầu
Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng hoàn thiện quy trình tạo phôi vô tính ở quy mô thí nghiệm và trong các

1.5. Công nghệ vờn ơm
Nghiên cứu các kỹ thuật vờn ơm thích hợp cho nảy mầm của hạt nhân tạo và củ
siêu nhỏ trong điều kiện nhiệt đới nớc ta
Nghiên cứu chế tạo và sản xuất giá thể từ vật liệu hữu cơ và khoáng vật sẵn có ở nớc
ta. Nghiên cứu các mẫu khay chậu trồng cây thích hợp cho số lợng cây sống khoẻ
mạnh tối đa / m2.
1.6. Xây dựng mô hình:
Nghiên cứu xây dựng mô hình trồng thử các cây của đề tài

1 nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính,
hạt nhân tạo trong nhân nhanh lily
Sản phẩm của đề tài:
A. Các giống tuyển chọn
- Viện Di truyền Nông nghiệp tuyển chọn 12 giống lily (thứ tự 1 đến 12)
- Trờng đại học Nông nghiệp I tuyển chọn 4 giống (thứ tự 13 đến 16)
- Phân viện sinh học Đà Lạt sử dụng 2 giống (thứ tự 17, 18)
18 giống trên đều là những giống cho hoa đẹp, hấp dẫn, màu sắc đa dạng, có
khả năng thơng mại hoá cao, đặc biệt nhiều giống sinh trởng tốt, thích hợp
với khí hậu nhiệt đới.
Bảng 1. Danh sách 18 giống tuyển chọn làm vật liệu nghiên cứu
TT Giống KH Vật liệu nghiên cứu


1
2
3
5
4 - 6
7
8
9
10
Lilium longiflorum Thunb.
Lilium Oriental Sorbone
Lilium Oriental Tiber
Lilium longiflorum 'nellie white'
Sta
Sib
Conectic
Royal Justice,
H×nh 1. C¸c gièng hoa lily sö dông trong nghiªn cøu

3 B. Quy trình
- Quy trình công nghệ tạo củ siêu nhỏ từ vảy củ, lát mỏng tế bào vảy củ và
mô sẹo phôi hoá
- Quy trình tạo hạt nhân tạo từ phôi vô tính, chồi mầm (protocorms) và củ
siêu nhỏ
- Quy trình công nghệ tạo củ siêu nhỏ bioreactor
- Quy trình công nghệ vờn ơm

gia tăng sự tái sinh chồi và nâng cao chất lợng cây hoa lily ( Lilium
longiflorum). Tạp chí CNSH 2 (4): 487-499
+ Dơng Tấn Nhựt, Trần Ngọc Thuỷ Tiên, Mai Thị Ngọc Hơng,
Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phan Xuân Huyền, Bùi Văn Lệ, Đỗ Năng
Vịnh (2004). Một số kết quả nghiên cứu về hạt nhân tạo của hoa lily
(Lilium spp.), Tạp chí CNSH, 2 (3): 359-370.
+ Dơng Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Huyền Trâm, Nguyễn Thành Hải, Phan
Nhã Uyên, Hà Thị Thuý, Đỗ Năng Vịnh (2006). ảnh hởng của kiểu
gen hoa lily lên khả năng tái sinh từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt
ngang thân non và vảy củ. Tạp chí CNSH. Đã chấp nhận đăng.

+ Duong Tan Nhut, Nguyen Thi Huyen Tram, Truong Kim Phuong,
Nguyen Thi Dieu Huong, Phan Xuan Huyen, Nguyen Tri Minh, Tran
Linh Thuoc, Bui Van Le, Do Nang Vinh. (2005) Effect of explant age
on direct somatic embryogenesis by culturing young stem transverse
thin cell layers of Lilium longiflorum. Proceedings of Vietnam-Korea
International symposium on Biotechnology and Bio-system
engineering. Nong Lam University, pp. 139-144.

+ Quy trình TBKT:
Đợc Bộ NN và PTNT công nhận tạm thời (QĐ 2215QĐ/BNN-KHCN
22/8/04: Biện pháp kỹ thuật nhân nhanh giống hoa lilium bằng nuôi cấy
mô. Tác giả: Đỗ Năng Vịnh và cộng sự: Nguyễn Thái Hà, Dơng Minh
Nga, Hà Thị Thuý, Lê Thu Về, Lê Huy Hàm1 Chơng i


2 Dựa vào kiểu nảy mầm, ngời ta chia lily
thành hai nhóm chính: nhóm nảy mầm trên mặt đất
và nhóm nảy mầm dới mặt đất (hình 1.1). Theo
kiểu thứ nhất, hạt nảy mầm ngay sau khi gieo,
không có ngủ nghỉ và cây con không bị ức chế sinh
trởng. Ngợc lại, kiểu nảy mầm thứ hai thờng bị
kiểm soát bởi ngủ nghỉ, ngủ nghỉ chỉ đợc giải
phóng sau khi xử lý hạt và củ ở nhiệt độ thấp.
Kiểu nảy mầm đóng vai trò quan trọng trong
tiến hoá do nó có tính di truyền và tính đặc hiệu loài. Hầu hết các loài lily
Eurasian và American đại diện cho kiểu nảy mầm gián đoạn dới mặt đất
trong khi phần lớn các loài Asiatic đại diện cho kiểu trên mặt đất không gián
đoạn (Pelkonen, 2005).
1.1.2. Phân bố
Lilium phân bố chủ yếu ở châu á, châu Âu và Bắc Mỹ (hình 1.2). Trung
Quốc là trung tâm phát sinh chủ yếu của lily, chiếm khoảng 50% các loài lily
trên thế giới, trong đó có 30 loài và 18 giống nguyên bản (Zhao et. al., 1996).
Khu vực Bắc Mỹ đóng góp 20 loài đợc phân thành loài phơng Đông và
phơng Tây. Cha tìm thấy loài lily nào có nguồn gốc từ bán cầu Nam
(Pelkonen, 2005).
Nh vậy, hầu hết các giống Lilium đều thích hợp với khí hậu khô, mát
mẻ, đặc biệt trên các vùng núi cao. Ngoài ra, có một số giống chịu nhiệt
thờng tập trung ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt, trong đó có 3 loài quan
trọng là L. neilgherense từ Nam ấn Độ, L. formosanum từ Đài Loan, Trung
Quốc và L. longiflorum từ Nam Nhật Bản và Đài Loan. Những loài này đều có
đặc điểm là cây khoẻ, chịu nhiệt, ra hoa sớm và thích hợp ra hoa quanh năm.

vảy củ là lá chuyên hoá chứa nớc và dinh dỡng
dự trữ. Mô phân sinh đỉnh tạo ra cành hoa trong
khi mô phân sinh nách sẽ tiếp tục sinh trởng và
tạo ra các củ bên sau khi chồi chính chết đi. Hoa
mọc cách hoặc đối xứng toả tròn trên đỉnh cành.
Hoa lily đẹp, hấp dẫn với nhiều kích thớc, màu
sắc khác nhau và là hình mẫu cho cấu trúc hoa của
cây một lá mầm (Võ Văn Chi, 1977; Pelkonen,
2005).
b) Cấu trúc hệ gen
Lily là một trong những thực vật có kích
thớc hệ gen lớn nhất và thay đổi giữa các loài. Ví
dụ, hệ gen ADN của L. henryl có tới 32 tỷ cặp
Hình 1.3. Cấu trúc cơ
q
uan ở lil
y
Chồi hoa
Hoa
Lá
Thân cành
Củ
Rễ4 basơ và ở một số loài có thể tới 100 tỷ. Kích thớc lớn một phần là do các
trình tự lặp lại liên tiếp trong NST, các trình tự này vẫn tồn tại qua hàng triệu


Bảng 1.2. Tình hình sản xuất hoa lily ở một số nớc
TT Nớc Năm 89/90/ha Năm 97/98/ha Năm 99/2001/ha
1 Hà Lan 1200 4000 5000
2 Pháp 30 150 420
3 Canada và Mỹ 200 215 235
4 Nhật 370 350 360
5
úc
50 250 400
6 Tân Tây Lan 4 40 70
7 Chi Lê 8 45 135
8 Hàn Quốc 131 209 250
Đối với nớc ta, lily chỉ đợc sản xuất giới hạn ở những khu vực có khí
hậu mát quanh năm nh Đà Lạt, Sapa. Lily đợc xem là loại hoa cao cấp,
trớc đây chỉ xuất hiện trong những dịp lễ trọng đại hoặc ngày Tết, nhng
hiện nay khi đời sống đã đợc cải thiện, nhu cầu về loài hoa này có xu hớng
tăng lên rõ rệt song giá hoa vẫn rất cao, từ 15.000 đến 25.000 đồng một cành,
đặc biệt là những giống có hơng thơm (Ly and Linh, 2004).
Với các điều kiện thuận lợi đó, ngành trồng hoa Việt Nam đang có
những bớc chuyển biến mạnh mẽ nh đầu t, mở rộng diện tích trồng hoa,
nâng cao sản lợng và chất lợng hoa xuất khẩu tại các trang trại lớn ở Lâm
Đồng và một số tỉnh miền Bắc. Hiện nay, công ty Dalat Hasfarm là nhà xuất
khẩu hoa lily chính ở nớc ta.
Quy trình vi nhân giống Lilium spp. bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
đã và đang đợc xây dựng hoàn thiện sẽ là nguồn cung cấp củ giống với số
lợng lớn, chất lợng cao, đồng nhất và ổn định. Qua đó, giúp các nhà trồng
hoa giảm chi phí nhập củ giống từ nớc ngoài cũng nh chủ động về nguyên
liệu sản xuất trong nớc cho hoa cắt và cây trồng chậu.
Nh vậy, tiềm năng sản xuất hoa lily ở nớc ta là rất lớn, cùng với sự

nhõn ging vụ tớnh cõy hoa Lily:
a. To c t thõn
Nhiu loi cú giỏ tr thng mi quan trng u to c t ph
n phớa
di ca thõn. Cỏc c ny cú ngun gc t nỏch ca cỏc lỏ ging nh lỏ bc
(Blaney v Roberts, 1966). S lng v tc tng trng ca c cú rt nhiu

7 khác biệt, phụ thuộc vào điều kiện trồng như chiều sâu bên dưới đất của củ
mẹ, cách cắt chồi hoa.
b. Tạo củ từ thân khí sinh
Củ từ thân k
ý sinh được tạo thành từ nách của những thân mọc bên trên
mặt đất. Sự cắt chồi hoa thúc đẩy sự tăng trưởng của các củ con này. Những
giống Lily không tự tạo củ bằng cách này, chẳng hạn như L. longiflorum, có
thể được cảm ứng bằng cách phun lên lá hợp chất cytokinin 6-benzylamino-9-
(tetrahydropyrany-2-yl)-9H-purine (PBA) (Nightingale, 1979).
c. Tạo củ bất định từ vảy củ
Khi tách vảy củ khỏi củ mẹ thì từ
vảy củ đó có thể tạo thành củ bất định
hướng vào vị trí gần với vết thương dưới những điều kiện thích hợp. Các củ
này có nguồn gốc từ sự phân chia của các tế bào biểu bì và bên trong biểu bì
(Godden và Watson, 1962). Nhiều loài Lily có thể được nhân giống vô tính
theo cách nêu trên và phương pháp này được sử dụng rộng rãi để sản xuất một
số lượng lớn các cây sạch bệnh và có chấ
t lượng. Tất cả các vảy củ, ngoại trừ
vảy củ nhỏ nhất nằm phía bên trong củ, đều có thể sử dụng được (Rees,
1972).

truyền, đáp ứng mục đích sản xuất củ trên quy mô thơng mại ở nhiều giống
Lilium (Gamborg, 2002; Nhut, 1998; Pelkonen, 2005). Các củ lily in vitro có
thể đợc sản xuất thông qua hai con đờng: phát sinh cơ quan (củ) và phát
sinh phôi.
1.2.1. Nuụi cy mụ phõn sinh
Hin ti thỡ cú n 9 loi virus nh hng n cõy hoa Lily, trong s ú thỡ
LSV l loi virus thng thy nht. Nhng c gng to cỏc cõy sch bnh
LSV c bt u vo nhng nm 1970 M v sau ú l ti H Lan. K
thut c s dng l nuụi cy mụ phõn sinh. Mụ phõn sinh
c dựng
nuụi cy cú kớch thc thay i t 0,2-0,4 mm (Nishizawa v Nishi, 1996)
n 0,5-2,0 mm (Asjes et al., 1974). Cỏc cõy con phỏt sinh t nuụi cy mụ
phõn sinh sng tt sau khi chuyn sang t trng. Tuy nhiờn, bng cỏc
phng phỏp kim tra min dch hc, huyt thanh hc hoc bng cỏch soi cỏc
t bo di kớnh hin vi in t, ngi ta cng phỏt hin rng cỏc cõy t con
ng nuụi cy mụ phõn sinh vn cú th mang virus (Walkey, 1978).
1.2.2. Tạo củ in vitro thông qua con đờng tái sinh trực tiếp

9 Củ lily có thể đợc tái sinh in vitro trực tiếp từ vảy củ hoặc đốt thân.
Đặc điểm chung của các phơng pháp này là tạo củ bên từ những cơ quan vốn
đợc xem là trung tâm phát sinh củ (đĩa gốc, đốt thân) và củ hình thành
thờng không có hiện tợng biến dị (Nhut, 1998).
Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật nuôi cấy lát cắt của các cơ quan, bộ phận
mà thông thờng không tạo củ cũng rất đợc chú trọng trong nhân giống
Lilium nh nuôi cấy lát cắt vảy củ không chứa đĩa gốc, lá và các thành phần
của hoa với hệ số nhân rất cao gấp 5-7 lần so với phơng pháp tách vảy
thông thờng (Teixeira da Silva, 2003). Kỹ thuật này đã đợc tác giả Trần

lát cắt tế bào sử dụng cho mục đích này thờng có kích thớc từ vài micromét
đến một vài milimét, ví dụ ở L. longiflorum Thunb., lát cắt ngang vảy củ in
vitro có độ dày từ 1- 3 milimét đều cho phản ứng tạo củ tốt (Nhut et. al.,
2003).
b) ảnh hởng của CĐHST
Chúng ta biết rằng ngủ nghỉ ảnh hởng mạnh mẽ đến phát sinh hình
thái của các cây dạng củ. Thông thờng cây ở giai đoạn ngủ nghỉ chỉ hình
thành những vảy củ và không ra lá (Vũ Văn Vụ, 1997). Với mục đích tạo củ
từ lát cắt tế bào, việc cảm ứng ngủ nghỉ đóng vai trò rất quan trọng. Nhiều
nghiên cứu cho thấy các CĐHST là nhân tố thiết yếu trong cảm ứng ngủ nghỉ.
Takayama và Misawa (1979) đã chỉ ra mối tơng tác giữa auxin (NAA) và
cytokinin (kinetin) đối với sự hình thành củ và rễ, tỷ lệ auxin/ cytokinin cao
làm tăng sự hình thành rễ, ngợc lại tỷ lệ này thấp làm tăng sự hình thành củ
(Pelkonen, 2005). Dơng Tấn Nhựt và cộng sự (2000) lại đề cập đến vai trò
độc lập của IBA trong tái sinh củ và cây con ở L. longiflorum do IBA có tác
dụng tích cực đối với phản ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ in vitro.
Nh vậy, CĐHST là yếu tố hết sức quan trọng, ảnh hởng mạnh tới cân
bằng giữa CĐHST ngoại sinh và nội sinh, qua đó gây cảm ứng ngủ nghỉ làm
phát sinh củ in vitro.
c) ảnh hởng của đờng
Ngoài việc cảm ứng ngủ nghỉ bằng các CĐHST, đờng cũng có vai trò
quan trọng trong quá trình này do nó ảnh hởng đến tính thẩm thấu của môi
trờng tức là tác động vào áp lực nớc đối với mô tế bào đang biệt hoá và kích

11 thích chúng phát triển (Kumar et. al., 2005). Nồng độ đờng dao động từ 2-
6%, tuỳ thuộc loài và loại mô nuôi cấy (Pelkonen, 2005).
Tuy nhiên theo nhiều báo cáo, nồng độ đờng thích hợp cho phản ứng

trong điều kiện chiếu sáng liên tục (Kumar et. al., 2005). Ngoài ra, vai trò của
chất lợng ánh sáng đối với sự biệt hoá in vitro cũng đã đợc nghiên cứu ở
một số cây có củ. Tuy nhiên cha có báo cáo nào đề cập đến vấn đề này trong
nuôi cấy mô lily (Pelkonen, 2005).
Tóm lại, con đờng tạo củ trực tiếp từ lát cắt tế bào chịu ảnh hởng của
nhiều yếu tố nh nguồn mẫu, CĐHST, đờng, ánh sáng Nhng điều quan
trọng là lựa chọn vật liệu ban đầu và môi trờng nuôi cấy thích hợp nhằm xây
dựng các quy trình nhân giống cho hệ số sản xuất củ cao nhất.
1.2.1.2. Những thành tựu nổi bật trong nghiên cứu tạo củ in vitro trực tiếp
từ lát mỏng tế bào ở Lilium spp.
Cũng giống nh hầu hết các cây dạng củ (bulbous) và căn hành
(cormous) khác, Lilium là cây một lá mầm tơng đối khó nuôi cấy in vitro hơn
so với cây hai lá mầm do những trở ngại chính trong việc điều khiển ngủ nghỉ
của củ (Nhut et. al., 2001a). Nuôi cấy in vitro ở lily đã đợc Robb báo cáo lần
đầu tiên vào năm 1957 sử dụng mẫu vảy củ Lilium speciosum Thunb. Năm
1966, Kohl và Nelson đã nuôi cấy thành công mô phân sinh đỉnh chồi ở
Lilium spp (Pelkonen, 2005; Van Tuyl, 1997). Cho đến nay, sau gần 50 năm
phát triển, các kỹ thuật nuôi cấy mô ở Lilium đã không ngừng đợc cải tiến
nhằm mục đích xây dựng và tối u hoá các quy trình nhân nhanh, cung cấp
nguồn vật liệu khởi đầu chất lợng cao cho sản xuất hoa trên quy mô thơng
mại (Pelkonen, 2005). Trong đó, công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào, hạt
nhân tạo và công nghệ bioreactor (hệ thống phản ứng sinh học) đã và đang trở
thành những công nghệ mũi nhọn trong ngành công nghiệp củ giống lily. Đây
cũng chính là những thành tựu nổi bật, có tính chất đột phá trong nhân giống
lily cũng nh nhiều loài cây khác (Teixeira da Silva, 2003).
* Tạo củ trực tiếp từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở quy mô nhỏ
Trong các nghiên cứu về lớp mỏng tế bào ở Lilium, nổi bật là các công
trình của nhóm tác giả Dơng Tấn Nhựt và cộng sự trên đối tợng mô hình
Lilium longiflorum Thunb. Năm 2001, nhóm này đã sử dụng những lát cắt