vv
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐOÀN VĂN THU
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TIỀN XỬ LÝ
LIGNOCELLULOSE TRONG SINH KHỐI
CỎ VA06 (Varisme 6) LÀM NGUYÊN
LIỆU SẢN XUẤT CỒN SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGHÀNH: HÓA SINH
MÃ SỐ: 60 42 30
Người hướng dẫn khoa học: TS. BÙI MINH TRÍ
Xin chân thành cảm ơn!

Đoàn Văn Thu

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH SÁCH CÁC BẢNG ix
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii
Chương 1: Mở đầu 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1
.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1
1.2.1. Mục tiêu 1
1.2.2. Yêu cầu 2
1.3. Thời gian và địa điểm thực hiện 2
Chương 2: Tổng quan tài liệu 3
2.1. Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học 3
2.1.1. Khái niệm nhiên liệu sinh học (NLSH) 3
2.1.2. Vai trò sinh khối trong sản xuất NLSH 4
2.2. Tổng quan về cây cỏ ở Việt Nam 6

2.2.1. Thành phần của các cây thân cỏ. 6
2.2.1.1. Thành phần cấu tạo cellulose . 8
2.2.1.2. Thành phần cấu tạo hemicellulose 11
2.2.1.3. Thành phần cấu tạo lignin 14
2.2.1.4. Các chất trích ly 17
2.2.1.5. Tro 18

4.2. Ảnh hưởng của vi sóng và một số hóa chất lên hàm lượng lignin và
cellulose trong cỏ VA06. 53
4.2.1. Ảnh hưởng của vi sóng lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc
lignocellulose 54
4.2.2 Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp của vi sóng và NaCl lên kh
ả năng
loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 55
4.2.3. Ảnh hưởng của dung dịch NH
4
OHvới nhiệt độ khác nhaulên khả
năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 58
4.2.4. Ảnh hưởng của dung dịch H
2
O
2
lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu
trúc lignocellulose 60
iii

4.2.5. Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NH
4
OH và H
2
O
2
lên khả
năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 61
4.2.6. Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NaCl, vi sóng và NH
3
lên

cho quần áo, nhà ở, và còn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự hình thành nền
văn hóa của con người
[15]
. Cellulose được hình thành bởi các liên kết 1-4 glucoside
giữa các đơn phân là glucose. Trong tự nhiên cellulose là thành phần vô cùng quan
trọng trong cấu trúc của thực vật. Cellulose không đứng một mình riêng lẻ mà được
bao bọc và liên kết chặt chẽ với các thành phần khác như lignin và hemicellulose
tạo thành cấu trúc vững chắc lignocellulose
[19]
.Việc loại bỏ lignin nhằm thu hồi
cellulose là công việc được quan tâm trên toàn thế giới. Đặc biệt khi các vấn đề về
“an ninh năng lượng”, môi trường sống thay đổi… trở thành vấn đề cấp thiết mang
tính chất toàn cầu, thì việc thu hồi được cellulose và hemicellulose từ các phế phẩm
nông nghiệp, các loài cỏ dại… như là một giải pháp “ nhất cử lưỡng tiện” được ưu
tiên hàng đầu.
Việt Nam là quốc gia nông nghi
ệp, được thiên nhiên ưu đãi, đất đai màu mỡ
nên ngoài các phụ phẩm nông nghiệp còn là nơi tập trung tới 12.000 loài cây cỏ
[2]
.
Đây là một thuận lợi vô cùng lớn về nguồn nguyên liệu chứa cellulose. Nhưng
nguồn cellulose này hiện nay ở nước ta vẫn chưa được sử dụng một cách hữu hiệu
nhất. Nếu có một phương pháp tốt để thu hồi, lượng cellulose này sẽ đem lại những
lợi ích vô cùng lớn cả về mặt kinh tế lẫn môi trường.
Chính vì những lý do trên,
dưới sự hướng dẫn của TS.Bùi Minh Trí
tôi thực
hiện đề tài:
“
Nghiên cứu phương pháp loại bỏ lignin trong sinh khối cây thân cỏ


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học.
2.1.1. Khái niệm nhiên liệu sinh học (NLSH).
Nhiên liệu sinh học là loại chất đốt tái tạo, được sản xuất từ nguyên liệu động
thực vật gọi là sinh khối. Gọi là “tái tạo” vì chất đốt cơ bản carbon (C) nằm trong
chu trình lục hoá ngắn hạn, xả thải khí CO
2
, rồi thực vật hấp thụ lại CO
2
đó để tạo
thành sinh khối. Chế biến nhiên liệu sinh học trên lý thuyết coi như không làm gia
tăng CO
2
trong khí quyển
[31]
. Nhiên liệu sinh học có thể ở thể rắn như củi, than củi
(than đá thuộc loại cổ sinh, không tái tạo), thể lỏng như xăng sinh học, diesel sinh
học, hay thể khí như khí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải).
Nhiên liệu ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều
năng lượng, dễ dàng chuyên chở, dễ tồn tr
ữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe.

Hình 2.1.Chu trình carbon trong nhiên liệu sinh học
4

2.1.2. Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học.
Hiện nay, nhân loại đang phải đối mặt với một cuộc khủng hoảng về năng

[33]
Nguyên liệu Sản lượng ethanol/ 1 tấn nguyên liệu khô
Hạt bắp ngô 124,4 gallon (470,854 lít)
Thân và lá bắp ngô 113,0 gallon (427,705 lít)
Rơm rạ 109,9 gallon (415,971 lít)
Phế phẩm của bông sợi 56,8 gallon (214, 988 lít)
Phế phẩm lâm nghiệp 81,5 gallon (308,477 lít)
Mạt cưa 100,8 gallon (381,528 lít)
Bã mía 111,5 gallon (422,027 lít)
Giấy vụn 116,2 gallon (439,817 lít)
5

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp, nên phế phụ phẩm từ nông nghiệp (
rơm, rạ, trấu…) là rất dồi dào. Bên cạnh đó, Việt Nam còn là nơi tập trung hơn
12.000 loài cỏ dại, trong số đó có những loài cỏ du nhập vào nước ta có sinh khối
lớn. Đó sẽ là thuận lợi lớn về nguồn nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học.
Bảng 2.2. Tiềm năng nhiên liệu sinh học t
ại Việt Nam
Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng
Nguồn sinh khối Tiềm năng (triệu
tấn)
Dầu tương đương
(triệu tấn)
Tỷ lệ (%)
Rơm rạ
32,52 7,30 60,4
Trấu
6,50 2,16 17,9
Bã mía
4,45 0,82 6,8

¾ Việc tập trung nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu theo giai đoan hai ( sử
dụng sinh khối biomass) là một giải pháp đáp ứng và phù hợp nước ta và xu hướng
thế giới.
2.2. Tổng quan về cây thân cỏ ở Việt Nam.
2.2.1. Thành phần của các cây thân cỏ.

Cây thân cỏ thuộc lọai thực vật phi gỗ, cấu tạo chúng bao gồm các thành phần
chính như: Cellulose chiếm 20-50%, hemicellulose khoảng 20 – 30%, lignin chiếm
khoảng 10-30%, còn lại là thành phần các chất trích ly và khoáng
[19]
. Các thành phần
này không nằm riêng rẽ mà chúng liên kết với nhau tạo thành phức hợp được gọi là
lignocellulose bền vững, giúp chúng chống lại các tác nhân phá hủy ngoài môi trường.
Điều này đã gây ra cản trở chính trong việc chuyển hóa sinh khối của chúng thành
nhiên liệu sinh học mà bước đầu tạo thành các đường.
Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt. Tuy nhiên
nó là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do đó việc sử dụng nguồn phế
liệu
lignocellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàn carbon toàn cầu
[10]
.
Lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin, chất trích ly, và một số
chất vô cơ.
Theo Hetti Palonen, về cơ bản trong cấu trúc phân tử của lignocellulose,
cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo
mạng lưới như hemicellulose và chất kết dính như lignin. Cellulose,
hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và hình thành liên kết cộng hóa trị
với nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-
7


lignocellulose
[Somerville C]
Ngày nay, khoa học kỹ thuật phát triển đã cho phép chúng ta có được nhiều
hơn những ứng dụng từ holocellulose, bên cạnh những sản phẩm từ cellulose thì
những ứng dụng từ hemicellulose cũng có ý nghĩa rất quan trọng, vd: từ
hemicellulose qua thủy phân thu đường xylose qua chế biến tạo thành xylitol một
chất giúp phục hồi và bảo vệ men răng
[10]
.
2.2.1.1. Thành phần cấu tạo cellulose.
Cellulose là một polysaccharide bao gồm một chuỗi của vài trăm đến hơn
10.000 đơn vị D-glucose mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose có cấu trúc
từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside. Cellulose
cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có
cấu trúc không đồng nhất. Có những phần đặc gọi là phần kết tinh và phầ
n xốp hơn
gọi là phần vô định hình
[12]
. Kiểu liên kết này khác mối liên kết α-1,4 glucose của
tinh bột, chẳng hạn như tinh bột ngô từ hạt ngô
[27]
.
Sự khác biệt về cấu trúc được chứng minh là khá đáng kể. Chuỗi Cellulose là
chuỗi thẳng và có phần cứng nhắc, nhưng tinh bột có cấu trúc chuỗi cuộn. Điều đó
làm cho các chuỗi cellulose hình thành các liên kết hydro rất nhiều, không giống
như tinh bột, các chuỗi cellulose ráp thành bó cablelike, sợi tinh thể có độ bền cao
9

và có khả năng kháng thủy phân thành glucose.
Các nhóm OH ở hai đầu mạch có

liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở
mạch carbon của sợi cellulose bên cạnh. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác
động bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợ
i của vùng này.

Hình 2.6. Các kiểu liên kết trong vùng kết tinh và vô định hình
[14]

- Vùng vô định hình (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều
sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b
như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch
glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là
vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định
hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại
cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180
0
cho toàn mạch.
Vùng vô định hình sẽ dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể
vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glucosid) sẽ làm giảm
độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết
hydro
[4]
.
Chiều dài vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài
của vùng kết tinh. Các cây gỗ lớn lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh
nhiều, ngược lại các cây thảo mộc chứa nhiều vùng cellulose vô định hình
[18]
.
Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại tự do, hydrogen của
Kết tinh Vô định hình

Hình 2.7. Cấu trúc của hemicellulose
12 Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ có các đặc điểm hemicellulose khác
nhau.

 Gỗ mềm
[12]
:
Hemicellulose trong gỗ cây lá kim là galactoglucomannan, glucomannan và
các arabinoglucuronoxylan. Còn trong các cây gỗ mềm khác là glucan
arabinogalactan, xyloglucan và các glucan khác.
- Galactoglucomannan là hemicellulose chủ yếu trong các loại gỗ mềm, mạch
chính của nó là một chuỗi tuyến tính hoặc phân nhánh bởi D-mannopyranose và D-
glucopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4. Phần dư D-Galactopyranose
được liên kết như chuỗi bên một bởi liên kết α 1-6. Galactoglucomannan có thể
được tạm chia thành hai loại: loại chứa nồng độ galactose thấp - đôi khi được gọi
đơn giản nh
ư glucomannan và loại chứa galactose cao. Tỷ lệ của galactose, glucose
và mannose là 0.1-0.2:1:3-4 và 1:01:03 trong hai loại tương ứng. Các nhóm
hydroxyl ở vị trí C2 và C3 trong mạch chính có một phần thay thế bởi nhóm O-
acetyl, một nhóm trung bình có 3-4 đơn vị hexose
[12]
.

Hình 2.8. Galactoglucomannan
- Arabinoglucuronoxylan (gọi tắt là xylan), cấu tạo từ các D-xylopyranose
liên kết với nhau bằng liên kết β –(1,4), các monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid
4-O-methyl-glucuronic trung bình từ 5-6 đơn vị xylose, ở vị trí 3 bằng α- L-

gồm β-D- xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D (1,4). Trong đó 70%
các nhóm
OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết
với acid 4-
O-methyl-D-glucuronic
[12]
.
14 Hình 2.11. Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan

Hình 2.12. Glucomannan
 Thực vật phi gỗ:
Đối với cỏ, 20 – 40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này
cấu tạo từ các D-xylopyranose, OH ở C
2
bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic.
OH ở vị trí C
3
sẽ
tạo mạch nhánh với
α
-L-arabinofuranose
[12]
.

Hình 2.13: Arabinoglucuronoxylan
Cấu tạo phức tạp của hemicellolose tạo nên nhiều tính chất hóa sinh và lý
sinh cho cây.

[24]
.

Hình 2.15. Phản ứng trùng hợp tạo lignin
Qúa trình trùng hợp lignin ban đầu thông qua oxy hóa của phenol, tiếp theo là
hình thành các liên kết căn bản. Trong bước đầu tiên, phenol monolignol bị oxy hóa
tạo thành các phenolic tương đối ổn định chứa các electron lẻ trong hệ thống liên
16

hợp. Sau đó, hai gốc monomer tự do bắt cặp với nhau để tạo thành 1 dimer
(dehydro), do đó thiết lập một liên kết cộng hóa trị giữa hai tiểu đơn vị. Gốc
monolignol ưu tiên hình thành liên kết tại các vị trí β của nó, kết quả tạo thành các
liên kết β - β, β - O -4, và β -5 dimer. Sau đó, dimer này được dehydrogen một lần
nữa để một tạo ra phenolic, trước khi nó có thể bắt cặp v
ới một monomer khác, cứ
như vậy tạo thành các polymer. Các liên kết có gốc tự do căn bản này xảy ra trong
tổ hợp hóa học, do đó, tỷ lệ của mỗi kiểu liên kết có thể phụ thuộc phần lớn vào tính
chất hóa học của các monome và các điều kiện trong thành tế bào. Chiều dài trung
bình của một chuỗi lignin tuyến tính trong cây dương được ước tính là từ 13 đến 20
đơn vị
[25]
.
Trong thực vật, lignin liên kết với holocellulose thông qua liên kết hóa học
lignin - carbonhydrate. Có các kiểu liên kết sau.
- Kiểu liên kết benzyl ether: liên kết hình thành giữa nhóm α-hydroxyl của một
đơn vị lignin và một nhóm hydroxyl carbohydrate.
- Kiểu liên kết ester benzyl: liên kết được hình thành giữa nhóm α-hydroxyl
của một đơn vị lignin và gốc axit của cacboxylic carbohydrate.
- Kiểu liên kết glycoside: liên kết được hình thành giữa axit béo hoặc nhóm
hydroxyl thơm với nhóm cuối cùng của carbohydrate.

flavonoid đều là những chất trích ly. Các phenolic có thuộc tính diệt nấm và ảnh
hưởng đến màu của gỗ. Chất béo và sáp, trong nhiều hệ thống sinh học được tận
dụng như là nguồn năng lượng trong khi terpenoid và steroid được biết đến là
nhựa dầu
[6]
. Nhóm cuối cùng cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật và côn trùng. Một
số chất trích ly là những dược phẩm quan trọng. Ví dụ, flavonoid được sử dụng
như là chất chống tác nhân oxy hóa và chống virus. Một số cấu trúc chất trích ly
được thể hiện ở những hình sau :

Hình 2.17 : Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin) ; (b)
cathechin(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo)
18

2.2.1.5. Thành phần tro.
Một phần đáng kể của các sinh khối thân thảo bao gồm các thành phần vô cơ,
thường được gọi là tro. Tro có nguồn gốc từ sinh khối và có tác động tiêu cực trên
các hệ thống chuyển đổi sinh khối. Đặc biệt trong hệ thống chuyển đổi sinh hóa
(chẳng hạn như sản xuất ethanol), nơi mà việc sử dụng các hoá chất vô cơ trong quá
trình tiền xử lý thì tro thêm vào tổng số dư lượ
ng vô cơ không chuyển đổi trong hệ
thống chuyển đổi. Tro bao gồm các thành phần chủ yếu
[27]
:
Kali cần thiết cho sự tăng trưởng thực vật, kali thường chiếm 1-5% trọng
lượng vật chất khô, tùy thuộc vào loài, trong khi nồng độ kali trong cây trưởng
thành thường không vượt quá 2% chất khô. Kali tham gia trong một số lượng lớn
các quy trình cần thiết cho sự phát triển của thực vật, bao gồm kích hoạt enzyme,
tổng hợp protein, quang hợp, quy định áp suất thẩm thấu, giao thông mạch dẫn, và
sự cân bằng cation-anion


2.2.2. Sự thủy phân cellulose.
Theo con đường sinh học Cellulose được thủy phân bằng enzyme cellulase.
2.2.2.1. Cấu trúc enzyme cellulase.
Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn tại ở
dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành
hệ enzym gọi là Citolase. Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1,
Cx và β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose
tạo thành glucose
[17]
.
+ Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên
thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình).
+ Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thuỷ phân cellulose phản ứng
thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại
[37]
:
Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác dụng thủy phân
liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên khoảng giữa mạch phân tử cellulose.
Được chia làm hai loại EGI, EGII. Cả hai loại enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ
khá cao.

Hình 2.18. Các phần của enzyme cellulase
[37]

20

Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành
disaccarit gọi là cellobiose ở các đầu chuỗi. Bao gồm hai loại CBHI và CBHII:
* CBHI