Đồ án tốt nghiệp 1
MỞ ĐẦU
Trong những năm cuối cùng của thế kỉ 20, các nhà sinh học đã phát hiện ra
các nhóm sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh. Vi tảo (Microalgae) là những
sinh vật bậc thấp có trong sự chú ý đó vì chúng không chỉ có những cơ chế đặc
thù mà còn sinh trưởng và phát triển cực kì nhanh. Hàng năm có 200 tỉ tấn chất
hữu cơ được tạo thành trên toàn thế giới, trong số đó 170- 180 tỉ tấn là do tảo tạo
thành. Vi tảo chiếm 1/3 sinh khối của thực vật trên trái đất.
Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh khối
vi tảo, các loại công nghệ này đang không ngừng được hoàn thiện, hạ giá thành
và nâng cao chất lượng sinh khối, mặt khác sử dụng vi tảo đang được mở rộng
trong các lĩnh vực như dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và thức ăn cho
động vật, đặc biệt là các ngành nuôi trồng thủy sản, nguồn phân bón sinh học,
năng lượng sạch, các hóa chất trong công nghiệp và dược phẩm, xử lý môi
trường.
Tuy ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về loại tảo này nhưng quy mô ứng dụng
còn chưa rộng. Hiện tại ở Đà Nẵng vẫn chưa có cơ sở nào sản xuất sinh khối để
phục vụ cho các ngành thực phẩm và y học, sở dĩ như thế là do thành phần môi
trường nuôi cấy còn sử dụng quá nhiều hóa chất nên môi trường nuôi cấy đắt, do
đó kém kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, các điều kiện để nuôi cấy cũng chưa
tốt nhất và phương pháp thu nhận sinh khối tảo chưa được triệt để, hiệu quả chưa
cao. Ngoài ra, cũng chưa có phương pháp bảo quản giống tốt trong một thời gian
dài để chủ động được nguồn giống để giảm chi phí sản xuất cho những đợt sau.
Trước những lý do như thế chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện
nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo
Spirulina platensis”. Nhằm mục đích tìm ra môi trường ít thành phần hóa chất,
rẻ tiền, phương pháp thu hoạch tốt và các phương pháp bảo quản giống trong một
thòi gian dài để chủ động trong quá trình nuôi cấy và mang lại tính kinh tế.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 2
PHẦN I
dinh dưỡng- vi lượng khoáng- vitamin do FAO/WHO công bố và là sản phẩm cải
thiện suy dinh dưỡng rất tốt cho trẻ em, người già, người bệnh sau phẫu thuật
Mặt khác, với các hoạt chất: Phycocyanin, Sulfolipid, Spirulan, Betacaroten, các
khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt…) và các vitamin cần thiết, tảo Spirulina còn
có giá trị dược liệu, giúp cơ thể tăng cường miễn dịch, chống lại bệnh tật. Có thể
dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị các bệnh: viêm gan, suy gan, đục thủy
tinh thể, suy giảm thị lực, rụng tóc… Song song đó, tảo Spirulina cũng có tác
dụng trong phòng chống một số bệnh ung thư do các hoạt chất tăng cường miễn
dịch, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào, chống đột biến gen. Năm 1996- 1997, một
nhóm nhà khoa học người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc một hoạt chất
mới trong Spirulina và đặt tên là Spirulan (Ca-Sp). Các thử nghiệm đã chứng tỏ
Ca- Sp có tác dụng kháng virus HIV type 1 và virus Herpes simplex type 1 [31].
- Tham gia vào việc xử lý môi trường: ngoài việc cung cấp dưỡng khí oxy,
Spirulina còn có khả năng gắn giữ mạnh các cation độc như chì, thuỷ ngân,
cadimi, nên chúng có thể dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nước thải [29].
- Spirulina có thể là đối tượng chuyển tải các tiến bộ khoa học kỹ thuật rất
hiện đại trong công nghệ sinh học:
+ Nuôi định hướng thu các chất có lợi cho dinh dưỡng và trị bệnh cho người
và động vật. Đã có các tiến bộ về nuôi cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh
thiếu vi chất iod), gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão hoá,
phòng chống ung thư )v.v Hoặc nuôi với những tiền chất định hướng cho
sinh khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu beta-caroten. Sự thành công
trong tương lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina và tìm tòi công nghệ
phù hợp, sẽ cho những lô/mẻ sinh khối Spirulina rất có giá trị trong y dược.
+ Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen là kỹ thuật phân
lập gen từ cơ thể cho (donor) cấy ghép vào bộ máy di truyền của cơ thể nhận
(receiver) nhằm tạo ra tính trạng mới cần thiết từ cơ thể đó. Kỹ thuật tân tiến này
đang được nghiên cứu với Spirulina ở 2 hướng sau:
• Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí của Spirulina giúp vi
sinh vật nổi trên mặt nước dễ dàng. Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét phải diệt
Spirulina, do đó tên Spirulina được sử dụng phổ biến cho đến nay thay cho tên
Arthrospira.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 5
1.1.3. Đặc điểm sinh học của Spirulina
Loài Spirulina (Arthrospira) platensis thuộc[2]:
Chi : Spirulina (Arthrospira)
Họ : Oscillatoriceae
Bộ : Oscillatoriales
Lớp : Cyanophyceae
Ngành : Cyanophyta
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái
Tên “Spirulina” xuất phát từ tiếng Latinh “helix” hoặc “spiral” biểu hiện hình
dạng xoắn của nó. Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi, sống cộng sinh, các tế bào
được phân biệt bởi vách ngăn, dạng sợi xoắn hình lò xo không phân nhánh, số
vòng xoắn lớn nhất là 6- 8 vòng đều nhau. Đường kính xoắn khoảng 35- 50µm,
bước xoắn là 60µm, chiều dài sợi tảo có thể đạt 250µm. Nhiều trường hợp
Spirulina có kích thước lớn hơn. Các vách ngang chia sợi Spirulina thành nhiều
tế bào riêng rẽ liên kết với nhau bằng cầu liên bào. Sợi tảo Spirulina có khả năng
chuyển động và tự vận động theo kiểu trượt quanh trục của sợi [13].
1.1.3.2. Đặc điểm cấu tạo
Tế bào Spirulina có cấu trúc giống với sinh vật Prokaryote thiếu các hạt liên
kết với màng. Thuộc gram âm, thành tế bào nhiều lớp và được bao bọc bởi màng
polysaccharide nhầy. Thành tế bào Spirulina không chứa celulose mà hệ tiêu hóa
con người không phân cắt được. Spirulina có tỷ lệ chuyển hóa quang hợp khoảng
10% so với chỉ 3% của các thực vật sống trên cạn như đậu nành.
Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân chỉ là vùng giàu axit
nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất. Thành tế
bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa celulose mà chứa mucopolyme,
pectin và các loại polysacharid khác. Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế
3
chứa vật liệu dạng sợi. L
2
là một peptidoglycan giống
như ở tế bào vi khuẩn. L
4
được sắp xếp chạy theo chiều dọc của trục sợi
Spirulina [4].
Hình 1.2. cũng cho thấy một vách ngăn đang hình thành, vách ngăn này gồm
ba lớp: L2 kẹp giữa hai L1, có thể hình dung như hình 1.3.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
L
1
L
4
L
3
L
2
Hình 1.2. Lát cắt tế bào Spirulina
platensis
L
1
L
2
L
1
L
4
L
và suối nước nóng. Đây là một trong khoảng 2500 loài cyanophyta cổ nhất, tự
dưỡng đơn giản, có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể, kể cả các đại
phân tử phức tạp để xây dựng tế bào và có khả năng cố định đạm rất cao, chúng
không thể sống hoàn toàn trong tối…
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển tảo Spirulina chịu ảnh hưởng của các
yếu tố môi trường. Những yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH và thành phần dinh
dưỡng không chỉ ảnh hưởng đến quang hợp và sản xuất sinh khối tế bào mà còn
ảnh hưởng tới các hoạt động chuyển hóa của tế bào.
a) Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quang hợp của các sinh
vật. Do bản chất tiền nhân của Spirulina nên ánh sáng không ảnh hưởng nhiều tới
quá trình phát triển. Tuy nhiên, Spirulina cũng giống như nhiều loài tảo khác có
khả năng quang tự dưỡng và phụ thuộc vào ánh sáng vì đây là nguồn năng lượng
chính [28].
Hầu hết, các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về đáp ứng của Spirulina đối
với ánh sáng là được thực hiện dưới điều kiện phát triển quang tự dưỡng bằng
việc sử dụng môi trường khoáng và bicarbonate như một nguồn carbon. Từ các
nghiên cứu đó cho thấy sự phát triển của Spirulina trở nên bão hòa ở cường độ
ánh sáng 1µmol m
-2
s
-1
khoảng bằng 10- 15% lượng ánh sáng mặt trời ở bước
sóng 400- 700nm, giá trị này tùy thuộc vào điều kiện phát triển và mối tương
quang giữa chlorophyll và sinh khối [28]. Ngoài ra, cường độ chiếu sáng còn ảnh
hưởng đến các hàm lượng các chất bên trong tế bào tảo. Một số nghiên cứu đã
nhận định rằng khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng của acid béo (PUFA)
giảm [26].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 8
0
C. Ở nhiệt độ dưới 25
0
C Spirulina phát triển rất chậm, ở nhiệt độ trên 38
0
C
tảo này sẽ chết rất nhanh [21]. Tuy vậy, trong tự nhiên người ta phát hiện
Spirulina ở những suối nước nóng đến 69
0
C.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 9
Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của tảo. Theo một
nghiên cứu đã cho thấy rằng: ở nhiệt độ 35
0
C không ảnh hưởng xấu lên sản xuất
sinh khối nhưng lại ảnh hưởng tích cực lên sản xuất protein, lipid và phenolic.
Nhiều chủng khác nhau sẽ phát triển ở các khoảng nhiệt độ khác nhau [28].
Có một mối liên hệ giữa nhiệt độ và ánh sáng trong quá trình nuôi cấy tảo.
Giống như hai mặt đối lập của một quá trình thống nhất, chúng đều đóng vai trò
quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina. Sinh trưởng của
tảo đạt cao nhất với một cường độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo nó
là một chế độ nhiệt tương đối ổn định.
c) Ảnh hưởng của pH
pH môi trường là một trong các nhân tố quan trọng trong nuôi cấy Spirulina.
pH tối ưu cho sự phát triển của chi này là kiềm và kiềm cao. Đây là ưu thế lớn
giúp Spirulina ít bị lây nhiễm bởi các tảo khác [14].
Tuy nhiên, pH là yếu tố nội tại luôn luôn thay đổi, không những do chế độ
chiếu sáng, nhiệt độ hàm lượng các chất dinh dưỡng tạo nên mà còn do tác động
ngược lại của chính trạng thái sinh trưởng của quần thể tảo. Khi tảo phát triển
môi trường nuôi cấy là hết sức cần thiết. Trong nuôi cấy tảo, vi lượng thường
được bổ sung với một lượng rất nhỏ vì khi hàm lượng vượt quá ngưỡng chịu
đựng của vi tảo, chúng có khả năng gây độc cho tế bào [20].
1.1.4. Đặc điểm sinh sản
Spirulina có hai hình thức sinh sản đó là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô
tính. Hình thức sinh sản sinh dưỡng được thực hiện bằng cách gãy từng khúc của
sợi tảo, khúc gãy gọi là khúc tản. Từ một sợi tảo mẹ, hình thành nên những đoạn
Necridia (gồm các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản). Trong các Necridia hình
thành các đĩa lõm ở hai mặt và sự tách rời tạo các hormogonia bởi sự chia cắt tại
vị trí các đĩa này. Trong sự phát triển, dần dần phần đầu gắn tiêu giảm, 2 đầu
hormogonia trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các
hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản được lập đi lập lại một
cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo. Kiểu sinh sản này thường gặp ở các
sợi tảo có dạng chuỗi tế bào xếp nối nhau. Trong thời kì sinh sản tảo Spirulina
nhạt màu ít sắc tố xanh hơn bình thường [5, 13].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 11
Trong một số điều kiện sống không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo
bào tử giống vi khuẩn, đó là hình thức sinh sản vô tính. Bào tử tảo có chứa nhiều
chất dinh dưỡng ở dạng dự trữ và được bao bọc bởi một lớp dày, khi gặp điều
kiện thuận lợi, chúng sẽ tạo thành sợi mới. Chu kỳ phát triển của tảo Spirulina rất
ngắn, nuôi trong phòng thí nghiệm thì thời gian thế hệ của nó chỉ kéo dài trong
24 giờ, ở điều kiện tự nhiên là khoảng 3- 5 ngày [7].
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng của tảo Spirulina
- Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực
phẩm hiện nay 60- 70% trọng lượng khô, cao hơn trong thịt bò 3 lần, trong đậu
tương 2 lần. Cứ 1kg tảo xoắn Spirulina chứa 55mg vitamin B1, 40mg vitamin
B2, 3mg vitamin B6, 2mg vitamin B12, 113mg vitamin PP, 190mg vitamin E,
4.000mg caroten trong đó β-Caroten khoảng 1700mg (tăng thêm 1000% so với
cà rốt), 0,5mg acid folic, inosit khoảng 500- 1.000mg. Phần lớn chất béo trong
để ngăn chặn sự tấn công của virus HIV. Ngoài ra, tảo Spirulina có những tác
dụng đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu [32, 33, 34].
1.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina trên thế giới
Người ta bắt đầu biết đến tảo Spirulina qua loại thức ăn Tecuitlatl của người
dân Aztec (Mêhicô) và bánh Dihé của bộ tộc Kanembu (Cộng hòa Chad và
Niger). Việc phát hiện và phát triển tảo Spirulina ra khắp thế giới gắn liền với
lịch sử tìm ra châu Mỹ của Christophe Colomb năm 1492. Mãi đến năm 1960,
khi Leonard và Comperé (người Bỉ) phân tích và công bố giá trị dinh dưỡng của
Tecuitlatl và Dihé chứa hàm lượng protein cao thì Spirulina được giới khoa học
quan tâm nhiều hơn. Năm 1963, Giáo sư Clement thuộc Viện nghiên cứu dầu hỏa
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 13
Pháp là người đầu tiên nghiên cứu nuôi tảo Spirulina ở quy mô công nghiệp
thành công. Năm 1967, nghiên cứu này đã được triển khai tại Công ty Sosa
Texcoco ở Mêhicô, Spirulina đã được nuôi trồng ở quy mô lớn trên suối nước
khoáng giàu bicacbonat. Tiếp sau đó, hàng loạt xí nghiệp sản xuất tảo Spirulina
đã xuất hiện ở Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc,…[11].
Nhu cầu về các chất có giá trị cao trong tảo Spirulina dùng để làm thuốc và
thực phẩm chức năng ngày càng tăng. Viện Nghiên cứu truyền nhiễm virus,
trường Y khoa Harvard, Earthrise Farms (California) gần đây công bố nghiên
cứu của họ về khả năng ức chế sự nhân lên của virus HIV- 1 trong dòng tế bào T
của nước chiết từ Spirulina. Nếu một người sử dụng 2- 3g tảo Spirulina sẽ giúp
tăng cường sức khỏe và khả năng tự bảo vệ của cơ thể [27]. Tảo lam Spirulina
platensis có thể là chỉ thị tốt nhất cho một vài loại nước thải. Spirulina có khả
năng loại bỏ kim loại nặng cadimi trong nước thải rất tốt, do độ hấp thụ cũng như
hiệu suất hấp thụ kim loại của nó rất cao [29].
Ngoài các hướng nghiên cứu đã được chỉ ra ở trên, hiện nay đã có nhiều công
bố thông báo về khả năng chuyển gen ở tảo Spirulina bằng việc áp dụng công
nghệ gen, kỹ thuật DNA tái tổ hợp đang được thực hiện ở Nhật Bản và một số
như bệnh viện Thống Nhất, bệnh viện phụ sản Từ Dũ, bệnh viện tỉnh Thuận Hải,
trung tâm dinh dưỡng trẻ em thành phố Hồ Chí Minh tiến hành thử nghiệm
chống suy dinh dưỡng ở trẻ em và người già [11, 18].
Trong khoảng thời gian 1981- 1985, Phòng Công nghệ Tảo- Viện Công nghệ
sinh học đã hợp tác chặt chẽ với Bộ môn Hóa Công nghệ trường Đại học Bách
khoa Hà Nội và Công ty Công nghiệp tỉnh Thuận Hải (nay là tỉnh Bình Thuận)
để triển khai nuôi trồng Spirulina ở quy mô lớn tại suối nước khoáng Vĩnh Hảo
giàu bicacbonat và các chất khoáng khác, tận dụng gió, ánh sáng, nhiệt độ cao
quanh năm. Ban đầu, Spirulina được nuôi trồng ở quy mô 60 bể (mỗi bể 45m
3
)
với năng suất 8- 10g khô/m
2
/ngày. Cũng trong thời gian này, hàng loạt nghiên
cứu ứng dụng sinh khối Spirulina cho gia cầm, cá, vịt, ong, tằm cũng đã được
thực hiện.
Năm 1994, Nguyễn Thị Đệ đã tiến hành nghiên cứu vai trò và một số tính chất
của phycobiliprotein chính trong tảo Spirulina [3,17].
Năm 1996, Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, Dương Trọng Hiền đã
khẳng định khả năng ứng dụng của phycobleu tách chiết từ Spirulina platensis
cho bệnh nhân ung thư. Phycobleu có tác dụng nâng cao thể trạng cho bệnh nhân
ung thư vùng đầu, cổ trong thời gian chiếu xạ hoặc sau phẫu thuật và loại sản
phẩm này không gây phản ứng phụ nào [15].
Năm 1997, một nhóm nhà nghiên cứu đã thử nghiệm một số đặc điểm sinh lý,
sinh hóa của Spirulina platensis trong điều kiện chịu mặn NaCl và đã kết luận
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 15
rằng hàm lượng chlorophyll và carotenoid có khuynh hướng tăng khi tăng nồng
độ trong môi trường. Như vậy muốn sản xuất nhiều chlorophyll và carotenoid thì
trong môi trường nuôi cấy có thể bổ sung thêm một ít muối NaCl [12]. Năm
Đôi khi một số động vật chân chèo rơi vào trong môi trường và chúng thường
sử dụng tảo làm thức ăn. Vào ban đêm, tảo tiêu thụ oxygen và sản sinh ra CO
2
,
khí này có tác dụng đầu độc động vật. Vì vậy, nên dừng khuấy vào ban đêm và
tảo sẽ sử dụng oxygen hòa tan và do đó động vật thiếu oxygen chúng sẽ bị chết.
Cách khác để hạn chế động vật là sử dụng chúng. Dùng một lưới dài, hình túi
(mắt lưới đường kính 10m) gắn bên trong bể, tại các góc bên phải theo hướng di
chuyển của môi trường nuôi cấy như vậy các động vật này sẽ bị giữ lại trên lưới.
Những động vật này là thức ăn rất tốt cho tôm hoặc cá con [12, 38] .
- Amoeba
Những loài này khác với động vật nguyên sinh ở chỗ chúng ăn tảo. R.R. Kudo
đã mô tả 74 loài amoeba khác nhau. Có một loài trong số chúng gây nguy hiểm
cho người đó là Entamoeba histolytica. Chúng lan truyền bằng các bào tử “hình
trứng”, các bào tử này bị chết trong nước nhiệt độ 45
0
C trong thời gian 1h và ở
nhiệt độ 55
0
C trong ít giây. Nhiệt độ bên trong của thiết bị sấy sử dụng năng
lượng mặt trời dao động từ 50-60
0
C và qúa trình làm khô diễn ra trong suốt 4h, vì
vậy nguy cơ tiềm ẩn từ những sinh vật loại này bị diệt trừ gần như tuyệt đối [12].
- Tảo
Môi trường nuôi cấy còn bị nhiễm các loại tảo khác. Nhưng do nồng độ muối,
pH cao của môi trường, do đó thường trở nên không thuận lợi với đa số các loài
tảo. Ở nồng độ muối đạt 20 g/l hầu như các loài tảo bị tiêu diệt. Tuy nhiên, loài
tảo silic Navicula, tảo xanh lục, và tảo lục Chlorella vẫn sống sót được trong các
bể nuôi Spirulina. Chúng thường sống ở đáy bể và nếu như mật độ của Spirulina
-
, Ca
2+
, Mg
2+
, SO
3
2-
… [37].
Tuy nhiên, rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp cho quá trình
nuôi cấy. Muốn sử dụng chúng cho quá trình nuôi cấy đòi hỏi phải có các quá
trình xử lý thích hợp. Các đặc điểm cần lưu ý mật rỉ bao gồm:
- Rỉ đường thường có màu sẫm. Màu này khó bị phá huỷ trong quá trình nuôi
cấy. Sau nuôi cấy chúng sẽ bám vào sinh khối sinh vật và bám vào sản phẩm.
Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường rất tốn kém và rất khó khăn.
Vì vây phải xử lý trước khi tiến hành quá trình nuôi cấy.
- Hàm lượng đường khá cao (thường nằm trong khoảng 40- 50%). Lượng
đường này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới
nồng độ thích hợp.
- Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình nuôi cấy là hệ keo trong mật
rỉ. Keo càng nhiều thì khả năng hoà tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 18
của oxy càng kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là phải
phá hệ keo này.
- Vì rỉ đường là chất dinh dưỡng khá lý tưởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vật
xâm nhập và phát triển. Như vậy chất lượng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời
gian bảo quản.
Để giải quyết những đặc điểm không thuận lợi có trong mật rỉ đối với quá
trình lên men, người ta thường sử dụng acid sunfuric đậm đặc với lượng 3,5kg
màu. Từ mật rỉ đã qua xử lý này đem pha chế thành các loại môi trường có nồng
độ khác nhau Tuy nhiên giá trị của mật rỉ trong quá trình nuôi cấy thu nhận sinh
khối không chỉ do lượng đường saccharose có trong mật rỉ mà còn do các loại
muối khoáng, các chất kích thích sinh trưởng và các thành phần khác quyết định
[15].
1.5. Giới thiệu về hệ thống ánh sáng đèn Led trong nuôi cấy tảo
Vấn đề môi trường đang là thách thức lớn của nhân loại. Việc thải khí CO
2
của
các nhà máy điện sử dụng nhiên liệu hóa thạch được coi là một trong những
nguyên nhân chủ yếu gây hiệu ứng nhà kính làm cho khí hậu nóng dần lên, dẫn
đến hàng loạt những biến đổi khí hậu trên thế giới trong những năm gần đây. Do
vậy, tiết kiệm điện năng là vấn đề của tất cả các quốc gia trên thế giới không
phân biệt là nước giàu hay nghèo. Tiết kiệm điện năng trước hết là sử dụng hợp
lý các thiết bị tiêu thụ điện trong đó có các thiết bị chiếu sáng, tạo ra môi trường
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 19
ánh sáng tiện nghi cho con người mà còn tiết kiệm chi phí cho điện năng tiêu thụ
và các chi phí khác. Nhưng trong hoàn cảnh thiếu hụt điện năng như bây giờ, đèn
Led là lựa chọn số 1, vừa bởi hiệu quả chiếu sáng cao, vừa bởi hiệu quả tiết kiệm
điện [16].
LED là viết tắt của Light-Emitting-Diode có nghĩa là “đi-ốt phát sáng” là một
nguồn sáng phát sáng khi có dòng điện tác động lên nó. Được biết tới từ những
năm đầu của thế kỷ 20, công nghệ LED ngày càng phát triển từ những diode phát
sáng đầu tiên với ánh sáng yếu và đơn sắc đến những nguồn phát sáng đa sắc,
công suất lớn và cho hiệu quả chiếu sáng cao.
Hoạt động của LED dựa trên công nghệ bán dẫn. Trong khối điốt bán dẫn,
electron chuyển từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mức
năng lượng thấp hơn và sự chênh lệch năng lượng này được phát xạ thành những
dạng ánh sáng khác nhau. Màu sắc của LED phát ra phụ thuộc vào hợp chất bán
Một vài loại cây trồng được báo cáo là đã trồng thành công dưới hệ thống Led
như: cây tiêu, dưa, lúa mỳ, bó xôi ( Bula và cộng sự, 1991; Hoenecke, 1992;
Brown và Schuerger, 1994; Yanagi và Okamoto, 1994), những cây khoai tây
nuôi cấy trong ống nghiệm ( Miyashita và cộng sự, 1995) [16].
Từ 1996 đến 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thành công hệ
thống phát sáng Led trên một số loại cây trồng như dâu tây, bạch đàn, hồ điệp,
lan, cúc…Những cây trồng nuôi cấy dưới hệ thống đèn Led không những sinh
trưởng phát triển tốt ở điều kiện invitro mà còn cả ở điều kiện exvitro. Những
nghiên cứu về giải phẫu học, quang hợp cũng chứng minh rằng những cây nuôi
cấy dưới hệ thống đèn Led thì tốt hơn khi so sánh với hệ thống chiếu sáng bằng
đèn neon.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 21
PHẦN II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
2.1.1. Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học khu A trường
Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
2.1.2. Thời gian tiến hành đề tài: Từ 11/03/2012- 01/06/2012
2.2. Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống tảo Spirulina platensis được bảo quản tại phòng thí nghiệm công nghệ
sinh học- khoa Hóa- trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng ngày 21/05/2011.
- Giống tảo Spirulina platensis được mua tảo mua ở Phòng công nghệ Tảo
viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào 15/03/2012. Giống ở dạng dung dịch
được đựng trong chai nhựa.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị phục vụ thí nghiệm
- Các dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, lọ penicilline, chai thủy tinh
500ml, bình tam giác, bể nuôi, que cấy trang, que cấy vòng, đèn cồn, đầu típ,
micropipet, ống eppendof… tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học- Khoa
O 0,20
6 CaCl
2
.2H
2
O 0,04
7 FeSO
4
.7H
2
O 0,01
8 EDTA 0,08
9 NaHCO
3
16,8
10 Vi lượng A
5
1ml
Đồ án tốt nghiệp 22
2.2.3.2. Môi trường rỉ đường [1]
Rỉ đường có nhiều ưu điểm để tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật vì sau khi
qua xử lý màu và hệ keo, bắt đầu tiến hành pha môi trường nuôi cấy Spirulina
plantensis.
Bảng 2.3. Thành phần môi trường rỉ đường
STT Thành phần Đơn vị tính Lượng
1 Rỉ đường ml/lít 0,75; 1; 1,5
2 NaHCO
3
g/lít 16,8
2.2.3.3. Các hóa chất chuyên dùng khác: Như các hóa chất để tách chiết
.7H
2
O 22,2
4 CuSO
4
.5H
2
O 7,9
5 Na
2
MoO
4
.2H
2
O 2,1
Đồ án tốt nghiệp 23
Các mẫu tảo sau thời gian hoạt hóa được đem đi quan sát hình thái dưới KHV
quang học hiệu Model Olympus CH2 ở các vật kính 10x và vật kính 40x. Sau đó
chụp ảnh lại và mô tả đặc điểm hình thái.
2.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy
Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm bốn
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được tiến hành nuôi trong 3 bình serum và tiến
hành lặp lại 3 lần.
Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự tăng
sinh tảo Spirulina. Cấy 30% tảo giống Spirulina vào 250ml môi trường trong
bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau bao gồm:
môi trường 1: môi trường cơ bản (Zarrouk), môi trường 2: môi trường 0,75ml rỉ
đường + 16,8g NaHCO
3
, môi trường 3: 1ml rỉ đường + 16,8g NaHCO
sáng khác nhau.
2.3.5. Khảo sát các phương pháp thu hoạch tảo Spirulina platensis
2.3.5.1. Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công
Dựa vào lực hút của trọng lực ta tiến hành thu hoạch tảo bằng cách lọc thủ
công
Cách tiến hành: Lấy dịch chứa sinh khối cho chảy qua lưới lọc, thu phần sinh
khối trên lưới lọc. Dịch sau lọc có thể tái sử dụng để nuôi lại tảo. Vật liệu lọc ở
đây có thể dùng là vải nhiều lớp hoặc giấy lọc.
2.3.5.2. Thu hoạch bằng phương pháp lọc có bơm chân không
Do khi lọc bằng vải nhiều lớp thì do khoảng cách của các sợi vải lớn nên tảo
vẫn lọt qua được nên hiệu quả thu hoạch không được cao, còn khi lọc bằng giấy
lọc thì hầu như tảo được giữ lại toàn bộ trên giấy lọc nhưng thời gian lọc quá lâu.
Để giảm thời gian lọc ta có thể dùng lọc bằng máy lọc hút chân không.
Cách tiến hành: Đặt giấy lọc phía trên phễu của bình tam giác có nối với hệ
thống bơm chân không, cho dịch sinh khối chảy qua giấy lọc. Dưới tác dụng của
trọng lực và lực hút của bơm chân không nên tốc độ lọc rất nhanh.
2.3.5.2. Thu hoạch bằng chất keo tụ và tuyển nổi
Tiến hành thử nghiệm thu hoạch với chất keo tụ Al
3+
. Ta bổ sung lần lượt
80g/l Al
2
(SO
4
)
3
, AlCl
3
vào mẫu AR
K
mẫu ra để kiểm tra xem có sự thay đổi số lượng do sự phục hồi không bào khí
hay không.
b) Mẫu nuôi hở có sục khí
Tiến hành thí nghiệm tương tự như trên.
c) Định lượng tảo trước và sau khi siêu âm
Đếm số lượng tảo trước và sau khi siêu âm, từ đó biết được tảo lắng do tác
động của siêu âm. Từ số lượng tảo lắng ta đánh giá được hiệu quả thu hoạch tảo
bằng sóng siêu âm. Tiến hành định lượng theo phụ lục 1.
2.3.6. Phương pháp đánh giá chất lượng tảo nuôi
2.3.6.1. Định lượng chlorophyll [2]
a) Nguyên tắc:
Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng của các loại sắc tố ở những bước sóng
nhất định để xác định hàm lượng của chúng có trong mẫu sau khi chiết bằng
dung môi thích hợp.
b) Cách tiến hành:
Lấy 10ml mẫu đem lọc, thu phần trên giấy lọc cho vào ống 20ml có vạch chia
thể tích và thêm 5- 15ml methanol. Đồng hóa mẫu với tốc độ 2500 vòng/phút,
trong 5-10 phút bằng máy Voltex hiệu MS1 Minishaker IKA. Sau khi đồng hóa
để ở nhiệt độ phòng trong 10- 20 phút. Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm ở tốc độ
8000- 10000 vòng/phút, trong 5- 7 phút bằng máy ly tâm hiệu Model Rotanta
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Copyright: Tài liệu đại học ©