Niên khoá: 2010 - 2012
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC
ĐỊNH LƯỢNG DIACETYL TRONG CÁC
LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
LOẠI BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
Chuyên ngành: HÓA HỌC PHÂN TÍCH
Người hướng dẫn khoa học
TS. ĐẶNG VĂN KHÁNH
Học viên thực hiện
HỒ THANH TUẤN
1


Bia là loại nước uống đặc biệt có độ cồn thấp, hương
thơm, bọt mịn và được rất nhiều người ưa chuộng. Trong quá
trình lên mem bia, ngoài các sản phẩm chủ yếu là cồn và
CO2 còn tạo rất nhiều sản phẩm phụ khác như rượu bậc cao,
este, andehit, glyxerin trong đó có diacetyl.

Diacetyl là chất độc gây kìm hãm sự trao đổi chất, có ảnh
hưởng đến sự sinh sản, độ lắng, độ đục… làm cho men tạo ra
mùi vị lạ, khó chịu, gây đau đầu và ảnh hưởng đến hệ thần
kinh của người tiêu dùng.

Phương pháp GC/MS kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn
(SPE) và tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen có giới hạn phát

Khảo sát chất lượng qui trình phân tích bằng cách so sánh
phương pháp đang nghiên cứu với phương pháp chuẩn theo
TCVN 6058:1995
(3). Áp dụng thực tế : áp dụng phương pháp đã lựa chọn để
định lượng các loại bia hiện đang lưu hành trên thị trường Thừa
Thiên Huế.
5

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Lấy mẫu ngẫu nhiên ở quầy, nhà hàng, các đại lý… mẫu
được đựng trong chai hoặc lon kín có ngày sản xuất và được
bảo quản nơi thoáng mát
2.2.2. Quy trình xử lý mẫu
Lấy khoảng 10-50 mL mẫu thử cho vào cốc có mỏ có dung
tích 125 mL, thêm khoảng 1-5 mL dung dịch 2,3-hexandion và
1-2 mL dung dịch 1,2-diaminobenzen, đun cách thủy 300C
trong khoảng 15 phút, cho qua cột SPE đã được hoạt hóa, sau
đó rửa giải bằng dung môi diclometan. Dung dịch sau khi qua
cột, được làm làm khô bằng khí N2 tới cạn. Hòa tan cắn với
dung môi etylaxetat, lọc qua màng lọc 0,45 µL và tiêm vào máy
GC/MS.
6

2.2.3. Nghiên cứu quy trình phân tích
2.2.4. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
* Xây dựng đường chuẩn
* Độ lặp lại
* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
2.2.5. Đánh giá phương pháp nghiên cứu

8

Hình 3.1. Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột InertCap 5MS/Sil
Hình 3.2. Sắc đồ phân tích hỗn hợp trên cột DB-5MS
9

3.1.2. Khảo sát tốc độ dòng khí mang
Sau khi lựa chọn cột DB-5MS để tiến hành phân tích và giữ
nguyên ĐKTN như hình 3.2. Chúng tôi tiến hành tiêm hỗn hợp
chuẩn đã được tạo dẫn xuất 2,3-dimetylquinoxalin và 2-metyl-3-n-
propylquinoxalin vào máy sắc ký khí ghép khối phổ với tốc độ khí
mang lần lượt là 1,2; 1,5; 1,7 mL/phút. Kết quả phân tích được
trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. So sánh khả năng tách của 2,3-dimetylquinoxalin và 2-
metyl-3-n-propylquinoxalin ở ba tốc độ dòng khác nhau
STT
Tốc độ dòng
(mL/phút)
Thời gian lưu của
pic 2,3-
dimetylquinoxalin
(phút)
Thời gian lưu của pic
2-metyl-3-n-
propylquinoxalin
(phút)
Hệ số
tách
1 1,7 8,608 9,052 1,052
2 1,5 9,047 11,097 1,226

0
C)
Chương trình nhiệt độ lò
Tốc độ
tăng nhiệt
độ
(
0
C/phút)
Nhiệt độ
đạt tới
Thời gian
giữ
(phút)
Tổng thời
gian
(phút)
1 250 250
60 1
29,330 250 0
20 300 5
2 250 250
60 1
25,020 200 1
30 300 5
3 250 250
40 1
28,510 200 0
20 250 5
12

0
C phút đến
250
0
C (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút)
13

Hình 3.8. (a) các mảnh phổ của hợp chất 2,3-dimetylquinoxalin
(b)các mảnh phổ của hợp chất 2-metyl-3-n-propylquinoxalin
Hình 3.7. Phổ Scan
1,2-dimetylquinoxalin
và 2-methyl-
3nPropylquinoxaline
14

3.2. KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH DIACETYL VÀ
TẠO DẪN XUẤT SỬ DỤNG CỘT CHIẾT PHA RẮN (SPE)
3.2.1. Quá trình tách chiết
- Hoạt hóa cột chiết : Cột chiết C18 có dung tích 3 mL, chứa
200mg pha rắn C18 đựơc hoạt hóa với 3 mL metanol/nước với tỉ
lệ 9/1 (V/v) tiếp sau là 3 mL nước cất.
- Nạp mẩu vào cột : Mẩu được nạp vào cột với tốc độ được
điều chỉnh bằng áp suất của bơm hút chân không đảm bảo tốc độ
dòng khoảng 1mL/phút.
- Rửa giải :
3.2.2. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải hàm lượng diacetyl qua
cột C18
Với lượng diacetyl ban đầu là 200 µg/L, sau khi tiến hành tạo
dẫn xuất và cho qua cột C18 có thể tích là 3 mL để tiến hành khảo
sát thể tích rửa giải khác nhau. Kết quả khảo sát được thể hiện ở

± SD) STT
Nồng
độ
nghiên
cứu
Tỷ lệ
diện tích
pic
± SD)
1
20 µg/L
0,37
0,37 ± 0,01
RSD% = 1,71
13
100
µg/L
0,69
0,69 ± 0,01
RSD% = 1,09
2 0,37 14 0,70
3 0,38 15 0,69
4 0,37 16 0,69
5 0,36 17 0,70
6 0,37 18 0,68
7
50 µg/L
0,53
0,53 ± 0,01
RSD% = 0,97

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của diacetyl trong bia
STT
Nồng độ diacetyl
(µg/L)
Tỷ lệ diện tích pic
(2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-n-
propylquinoxalin)
Phương trình hồi quy
1 20 0,37 y = 0,0039x +0,3073
R = 0,9995
y : tỷ lệ diên tích pic
x : nồng độ diacetyl
2 50 0,53
3 100 0,69
4 200 1,07
5 500 2,25
Hình 3.11. Đường biễu diễn mối
tương quan giữa tỷ số diện tích
2,3-dimetylquinoxalin/2-metyl-3-n-
propylquinoxalin và nồng độ diacetyl
trong bia
19

3.4. XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
Từ các kết quả khảo sát đã nghiên cứu, chúng tôi xây dựng quy trình phân
tích để định lượng diacetyl trong bia bằng phương pháp GC/MS như hình
3.12
20 mL mẫu bia 1 mL dung dịch 2,3-hexandion 1ppm
Tạo dẫn xuất với 1,2-diaminobenzen
SPE

- Rửa giải bằng 5 mL CH
2
Cl
2
- Thổi N
2
tới cạn
- Định mức 2 mL Etyl axetat
Hình 3.12. Sơ đồ quy
trình phân tích xác định
diacetyl trong bia bằng
phương pháp GC/MS
20

3.5. ÁP DỤNG THỰC TẾ
3.5.1. Kiểm soát chất lượng qui trình
3.5.1.1. Độ lặp lại và độ thu hồi
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn diacetyl cho vào mẩu trắng với 3 nồng độ
380 µg/L; 470 µg/L; 550 µg/L và dung dịch nội chuẩn 2,3-hexandion nồng
độ 1000 µg/L. Mỗi nồng độ làm song song 3 mẩu. Tiến hành phân tích theo
qui trình đã xây dựng. Kết quả đuợc trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình phân tích
Lượng thêm
vào (µg/L)
Lượng tìm thấy (µg/L)/Rev%
RSD%
(n = 3)
Rev%
380,0 325,2 / 85,58 321,5 / 84,61 327,6 / 86,21 0,95 85,47
470,0 431,2 / 91,74 421,5 / 89,68 439,2 / 93,45 2,06 91,62

= 0,32
(n = 5)
47,7
= 49,0
S
2
= 1,04
(n = 5)
2
48,2 49,9
3
48,7 50,2
4
48,3 48,6
5
49,0 48,5
1
X
2
X
22

2
2
2
2 2
1
1,04
0,32
S

 
 
+
 ÷
 
 
= − =
 
 
   
 ÷  ÷
 
   
 
+
 
+ +
 
* Nhận xét:
- Ta có F
tính
=
Nên Hai phương pháp có độ lặp lại khác nhau với p < 0,05. Hay
nói cách khác, phương pháp GC/MS có độ lặp lại tốt hơn phương
pháp UV-Vis với p < 0,05.
- Xét t
tính
=
= 1,03 và khi đó bậc tự do f được tính lại
Do t

Biere Larue export
4,5%
01/08/2012/SV
4 B28
Festival beer
4,5%
07/03/2012
5 B29
Corona extra (Mexico)
4,6%
05/03/2012
6 B30
Hue beer export
5%
10/12/2012
7 B31
Tiger crystal
4,6%
26/07/2012/AE
8 B32
Huda Beer
4,7%
19/02/2012
9 B33
Heineken
5%
04/08/2012/HE
24

Bảng 3.12. Kết quả phân tích một số mẩu bia thực tế bằng GC/MS

9
B33 49,0
Đạt
Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy: đã phát hiện được diacetyl
trong các loại bia đang lưu hành trên thị trường Thừa Thiên Huế.
Song hàm lượng của chúng đều đạt yêu cầu so với quy định hiện
hành của Bộ Y Tế (<0,2 mg/L)
25