i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
____________________ Đinh Đăng Huy
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP
TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. PHẠM HÙNG VIỆT
Hà Nội - Năm 2009
LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này được thực hiện và hoàn thành tại Trung tâm Chất
lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố HCM
với sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Hùng Việt.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Phạm Hùng
Việt đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Dương Hồng Anh đã hướng dẫn, giúp
đỡ tôi trong quá trình nghiên cứ
u.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông lâm
thủy sản vùng 4, Tập thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, bạn bè và
đồng nghiệp đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Khoa Hóa học, cùng các
thầy cô Trường đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn
trong suốt quá trình học và làm luận văn.
i
n
n
h
hĐ
Đ
ă
ă
n
n
g
gH
H
u
u
y
y

i
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1

[2], [5]
........................12

1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản.............................................13

1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) ..............15

1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng ................................23

1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột............23

1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký...................................................26

1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: ....................................................................................27

1.7.2. Chiết pha rắn SPE:..................................................................................27

Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................29

2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài.......................................................................29

2.2. Mô hình thực nghiệm ......................................................................................29

2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:.............................................................................29

2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: ....................................................................................29

2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: ...............................................................................30

2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:.........................................................................30

ii
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. ...............................................40

3.1.3. Dung môi chiết:.......................................................................................45

3.2. Khoảng tuyến tính:..........................................................................................47

3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .............................................................49

3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .....................................................49

3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể....................................................51

3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp:............................................................52

3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. ....................................................................54

3.7.1. Phạm vi áp dụng: ....................................................................................54

3.7.2. Nguyên tắc: .............................................................................................54

3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:...................................................54

3.7.4. Chuẩn bị mẫu:.........................................................................................57

3.7.5. Tiến hành thử nghiệm:............................................................................58


FA Formic acid Axít Formic
FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang

HPLC High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS/MS Liquid Chromatograph
Tandem Mass Spectrometer
Sắc ký lỏng ghép 2 lần
khối phổ
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng
NPLC Normal Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha thuận
ND Not detected Không phát hiện
RPLC Reversed Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha đảo
SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn
TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic
UV Ultra Violet Cự
c tím
VIS Visible Nhìn thấy

Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2....................................................................42

Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2....................................................................43

Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2....................................................................44

Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm...........................47

Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark
not defined.

Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ............................49

Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. ...................49

Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) ........................51

Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS.........................53 v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình Diễn giải Trang
Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng...................................................16

Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp......................................................................17


Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1....................................41

Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1....................................42

Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2....................................43

Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2....................................44

Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2....................................45

Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 ......................46

Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93..46

Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .....................47

Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .............................................................48

Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV...53

Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV ..........................54

1
MỞ ĐẦU
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất
nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên
trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới
2
quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là
định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và
phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây
tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ).
Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có
công thức cấu tạo:

Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù
hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm
soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn
liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine
đối với họ cá thu ngừ…). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích
để xác
định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên
cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương
pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC-
UV và LC/MS
n
, phương pháp sinh hóa trên chuột

thì hiện nay Việt nam chưa
có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề
nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể
áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với
điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … )
là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghi
ệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan

vùng nước rộng lớn diễ
n ra là kết quả của sự nở hoa (Algal blooms) của các
loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực. Ví dụ: màu đặc trưng của Biển Đỏ
gây nên bởi sự nở hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các
sắc tố đỏ phycoerythrin ...
“Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó
gây ra làm đổi màu nước. Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm,
cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ng
ộ độc và có thể bị tử vong.
Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các sự
kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hoặc một số loài tảo độc hại đạt tới
mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác.
Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau:
a. Các loài không chứa độc t
ố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu
nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở
hoa có thể tăng đến mật độ rất cao làm chết cá và các động vật không xương
sống có trong thủy vực đó do cạn kiệt oxy. Tiêu biểu trong nhóm này là các 5
loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium
erythraeum (tảo lam).
b. Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có thể phát hiện được
thông qua chuỗi thức ăn tới con người, gây nên một loạt các chứng bệnh về
thần kinh và tiêu hóa, chẳng hạn như:
Độc tố PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp:
Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula, ... sản sinh ra.
Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp
Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica, ... sản sinh ra.

tế bào/lít (Andersen, 1996).
Những tác hại do tảo độc hại nở hoa gây nên là rất lớn. Người ta đã
thống kê được từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal,
Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 người bị ngộ độc, trong đó có 6
người chết. ở vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 trường hợp bị ngộ
độc, trong đó có 101 người chết. Năm 1989 ở vịnh False (Nam Phi) loài
Gymnodinium sp. nở hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ng
ư. ở Monte
Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc nở hoa đã làm
chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides).
Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở hoa ở biển
Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế rất lớn; cụ thể là
từ năm 1987 đến năm 1991 ở khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở hoa
trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt vớ
i tổng số thiệt hại là 4.452 triệu
yên, v.v.
Ở Việt Nam, một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã
được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực
vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng
20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et
al., 1996).
1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản
a. Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù
du. Thông qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc
chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể, bao gồm:
Độc tố gây liệt cơ (paralytic shellfish poisonings - PSP): có khoảng 20
loại là các dẫn xuất của saxitoxin. Liều lượng gây chết cho người là từ 0,1 tới
1 mg. Các độc tố PSP bền với nhiệt và có thể tan trong n
ước.


với hệ thần kinh (lẫn, mất trí nhớ, tai biến mạch máu, hôn mê)
Gây ra bởi NSP: Giải phóng Na
+
trong quá trình vận chuyển ion vào
trong tế bào dẫn tới việc không điều chỉnh được Na
+
vào trong tế bào làm
thay đổi đặc tính của tế bào, gây ra sự giải phóng thần kinh phá huỷ
Acetylcholine gây co cơ. 8
1.3. Đại cương về axít domoic (DA)
1.3.1. Tính chất hóa lý.
DA là chất bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ 223-224
o
C, tan tốt trong
nước (8mg/ml), tan ít trong metanol (0.6mg/ml).
Tên đầy đủ: ([2S-[2α,3β,4β (1Z,3E,5R)]]-2-Carboxy-4-(5-carboxy-1-
methyl-1,3-hexadienyl)-3- pyrrolidineacetic acid)
Công thức phân tử: C
15
H
21
NO
6
:
Công thức cấu tạo:

Trọng lượng phân tử: 311.34 g/mol.

chuyển hóa DA trong nhuyễn thể là rất thấp.
Khi nhuyễn thể đã bị tích tụ độc tố sinh học biển, ta có thể nuôi lưu
(nuôi ở trong môi trường nước biển sạch) thì có thể làm giảm hàm lượng độc
tố. Ví dụ, theo nghiên cứu của (Novaczek, 1992): 50% hàm lượng DA trong
loài vẹm xanh được rửa giải trong vòng 24 h nuôi lưu, trong khi đó phải mất
86 ngày để rửa giải 50% DA trong razor clams (Siliqua patula) (Horner et al.,
1993)
1.3.3. Độc tính của DA
LD
50
của DA khoảng 2,3 mg/kg khối lượng cơ thể theo nghiên cứu của
Iverson và các cộng sự (1989).
Quy định của các thị trường nhập khẩu (Canada, Mỹ, Châu Âu, Úc...) và
Việt Nam quy định mức giới hạn tối đa cho phép trong nhuyễn thể là 20 µg
DA/g thịt nhuyễn thể (20ppm), khi kết quả phân tích vượt mức trên sẽ bị đình
chỉ vùng thu hoạch và lấy mẫu tăng cường để kiểm tra chỉ tiêu này.
1.4. Một số phương pháp phân tích DA
Dựa vào tính chất và cấu trúc của Axít domoic (DA), hiện nay trên thế
giới đã có một số phương pháp xác định trong các nền mẫu khác nhau (nước
biển, tảo, nhuyễn thể hai mảnh vỏ...) như: sinh hóa trên chuột (mouse
bioassay), sắc ký lỏng với đầu dò UV-VIS, huỳnh quang (HPLC-UV/FLD)
hoặc LC-MS/MS. 10
Tuy nhiên tại Việt Nam, hiện chưa có một tiêu chuẩn hoặc phương pháp
nào đề cập đến việc phân tích DA ngoại trừ một số qui trình tự xây dựng của
một số phòng kiểm nghiệm.
Sau đây là một số phương pháp điển hình, phù hợp đáp ứng được phân
tích dư lượng DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản:

11
Tính giá trị trung bình của các hệ số CF thu được ở trên. Sử dụng hệ số
CF này trong tính kết quả.
Hệ số chuyển đổi CF cần được kiểm tra thường xuyên, việc kiểm xoát
lại hệ số chuyển đổi CF được thực hiện bằng cách chích vào 5 con chuột dung
dịch chuẩn đã pha loãng sao cho thời gian gây chuột chết nằm trong khoảng
5-7 phút. Xác định hệ số CF và so sánh với CF tham chiếu đã xác định đượ
c
trước đó. Sự sai lệch phải nằm trong khoảng ± 20 %. Nếu sự sai lệch vượt
khoảng này, tiêm thêm 5 con chuột và bổ sung vào 5 con chuột đã chích trước
đó để có nhóm chuột gồm 10 con, chọn và chích thêm nhóm chuột thứ hai
gồm 10 con với cùng nồng độ dung dịch chuẩn như nhóm 1. Tính hệ số CF
của 2 nhóm chuột và tính CF trung bình. Hệ số CF thu được này được xem
như giá trị CF mới sử dụng trong tính kết quả, vì độ
lệch nằm ngoài khoảng ±
20 % có khả năng do kỹ thuật hoặc do sự thay đổi đáp ứng của giòng chuột
đối với độc tố. Sư thay đổi này đòi hỏi phải thay đổi hệ số CF [Sổ tay phương
pháp của Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 2009].
1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-
MS/MS)Thường mẫu được ly trích bằng một dung môi hữu cơ và được làm
sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết được
làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với
các đầu dò UV, PDA, FLD hoặc MS/MS. Đối với đầu dò huỳnh quang FLD,
sau khi qua cột phân tích DA được cho phản ứng với một chất phù hợp để tạo
thành hợp chất có tính chất huỳnh quang trước khi vào
đầu dò.
Dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha đảo hoặc pha thuận)

có tính chọn lọc rất cao, có thể định lượng và khẳng định ngay mà chi phí
phân tích ở mức trung bình. Tuy nhiên phương pháp lại khó có thể phát triển
để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP với
mức giới hạn cho phép thấp (ppb).

Với những tồn tại của các phương pháp trên đới với DA thì việc cần có
một phương pháp khác như phương pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có thể
phát triển để định lượng DSP, PSP cùng với việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết
các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra
của các tiêu chuẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nước là vô cùng cần thiết.
1.6. Đại cương về
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ
[2], [5] 13
Sắc ký lỏng là một trong những kỹ thuật phân tích dụng cụ liên quan
đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau. Kỹ
thuật này cho phép người phân tích nhận danh và định lượng từng cấu tử
trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và phổ đồ tương ứng của chúng.
1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản
1.6.1.1. Chiều rộng pic

Chiều rộng pic được đo bằng cách mở rộng hai bên pic xuống
đường
nền và đo chiều rộng ở đường nền. Tuy nhiên, người ta thường đo tại bán
chiều cao picvì thực hiện dễ dàng và có độ tin cậy cao hơn.
1.6.1.2. Thời gian lưu (tr) và thời gian lưu hiệu chỉnh (tr’)

Thời gian lưu là tổng thời gian hợp chất trong pha động và pha tĩnh, có

t
m
: thời gian của pic không bị giữ lại hay thời gian chết của cột
1.6.1.3. Tỷ số phân bố

Tỷ số phân bố k hay hệ số chứa (k’) cho biết thời gian một hợp chất
nằm trong pha tĩnh bao lâu so với hợp chất khác. Nếu k = 0 thì ta nói là
hợp chất không bị lưu giữ. 14
m
mr
t
tt
k
−
=
(0.2)
Tỷ số phân bố phản ánh độ lớn thật sự lưu giữ hợp chất hơn thời
gian lưu.
1.6.1.4. Hằng số phân bố (KD)

Hằng số phân bố được định nghĩa là tỷ số nồng độ của hợp chất
trong pha tĩnh và pha động.
m
s
D
C
C

r
h
r
W
t
W
t
n 16545,5
2
(0.4)
W
b
= 1,699W
h
: chiều rộng pic tại đáy
t
r
: thời gian lưu của pic
W
h
: Chiều rộng pic tại nửa chiều cao (cùng đơn vị với t
r
)
Ngoài ra còn dùng số đĩa lý thuyết hiệu dụng N
2
'
2
'
16545,5
⎥

L : chiều dài của cột (mm) 15
1.6.1.6. Hệ số

tách

(α)
Còn được gọi là độ chọn lọc, cho biết khoảng cách giữa 2 pic.
1
2
k
k
=
α
(0.7)

k
1
: tỷ số phân bố của pic giải hấp trước
k
2
: tỷ số phân bố của pic giải hấp sau
1.6.1.7. Độ phân giải (R)
Độ phân giải dùng để đánh giá khả năng tách giữa 2 chất
⎟
⎟
⎠
⎞

r
)
Khi độ phân giải R ≥ 1,5 thì 2 chất tách hoàn toàn khỏi nhau.
1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters)
Hệ thống gồm 7 phần chính:
 Hệ thống bơm (Pump system)
 Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
 Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột)
 Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)
 Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)
 Đầu dò khối phổ (Detector)

Hệ thống xử lý dữ liệu 16
Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng
1.6.2.1. Hệ thống bơm
Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:
- Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi)
- Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 ml/min
- Thể tích chết nhỏ
- Trơ với dung môi của pha động
- Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi v
ới nhau
1.6.2.2. Hệ thống tiêm mẫu:
a. Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống tiêm mẫu:
- Có tác dụng tiêm mẫu
- Tự động tắt khi áp suất cao
- Có thể bơm tuần hoàn mẫu