1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDS
nguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chưa có vắc xin phòng bệnh và chưa có
thuốc điều trị đặc hiệu. HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cướp đi hàng
triệu sinh mạng người trên thế giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng
đến mọi khía cạnh của đời sống xã hội, làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hóa, xã
hội và nòi giống của mỗi quốc gia.
Đại dịch HIV/AIDS đang tiếp tục lan rộng trên toàn cầu với tốc độ
13.000 ca nhiễm mới mỗi ngày. Theo báo cáo của Tổ chức phòng chống
AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO),
trên toàn thế giới có khoảng 40,3 (36,7- 45,3) triệu người đang sống với
HIV/AIDS và khoảng 25 triệu bệnh nhân đã tử vong (UNAIDS/WHO, 2010).
Như vậy, kể từ khi bắt đầu đại dịch đến nay, trên thế giới đã có tới gần 65
triệu người nhiễm HIV. Trong năm 2008, đã có 2,7 (2,4- 3,0) triệu trường hợp
nhiễm mới và 2,0 (1,7-2,4) triệu bệnh nhân AIDS đã chết (UNAIDS/WHO,
2009), điều đó cũng có nghĩa là cứ mỗi phút có 5,1 trường hợp nhiễm mới và
3,8 trường hợp chết vì AIDS hoặc cứ 6-7 giây có một trường hợp nhiễm mới
và cứ 14-16 giây có một người chết vì AIDS trên thế giới.
Đông Nam Á và Đông Âu là những khu vực có tốc độ lây nhiễm HIV
cao thông qua con đường tiêm chích ma túy. Việt Nam hiện đang được xếp vào
danh sách các nước có tỷ lệ nhiễm HIV cao trên thế giới cũng như trong khu
vực. Theo Bộ Y tế, Việt Nam đang là nước có số lượng người nhiễm HIV cao
thứ 6 ở Châu Á. Ở Việt Nam hiện nay cứ 15 phút lại có một người bị nhiễm
HIV. Số lượng người nhiễm HIV/AIDS gia tăng kéo theo nhu cầu chăm sóc và
hỗ trợ ngày càng tăng. Theo đánh giá mới đây của Tổ chức Y tế thế giới,
2
HIV/AIDS đang được xếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử vong
(chiếm 7,5%) ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam (Bao, 2009).
Sự đa dạng của các chủng HIV là một con số khó thống kê vì HIV có
khả năng biến đổi rất lớn và tùy thuộc vào các vùng địa lý khác nhau. Quá

Chuyển đổi huyết thanh
4
1.2.1. Giai đoạn nhiễm trùng khởi phát (Primary infection)
Đây là giai đoạn đầu tiên, khi virus bắt đầu thâm nhập vào cơ thể
( Sau đó từ hai đến bốn tuần trên 87%
người nhiễm HIV trải qua những dấu hiệu giống cúm trong vài ngày, đó cũng
là biểu hiện của hệ miễn dịch cơ thể bắt đầu chiến đấu với sự lây nhiễm mới
của HIV. Những dấu hiệu bệnh bao gồm: sốt, ớn lạnh, đau đầu, đổ mồ hôi
(Bradley Hare, 2004). Thông thường từ 6-12 tuần hệ miễn dịch bắt đầu sản
xuất kháng thể để chống lại virus. Nghĩa là trong máu của một người mới
nhiễm HIV sẽ không thể có kháng thể kháng HIV trong vài tuần đầu tiên.
Người nhiễm mới thì khả năng lây nhiễm trong giai đoạn này rất cao bởi vì số
lượng lớn của HIV trong dịch của cơ quan sinh dục (NIAID, 2003). Ở giai
đoạn này kháng nguyên p24 xuất hiện.
1.2.2. Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh
Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh được miêu tả là thời gian khi cơ thể
bắt đầu sản xuất kháng thể kháng lại virus. Đây cũng là giai đoạn khó chẩn
đoán nhất vì lượng kháng nguyên p24 giảm dần thay thế là sự xuất hiện của
kháng thể kháng p24 nhưng còn quá ít. Hầu hết mọi người phát triển kháng
thể trong vòng 3 tháng. Một vài người có thể trên 6 tháng mới phát triển
kháng thể kháng HIV( />1.2.3. Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng (clinical latency)
Đây là thời kỳ không có dấu hiệu của bệnh hay còn gọi là không triệu
chứng. Phải mất bao lâu để một người bị nhiễm HIV mới phát triển những
dấu hiệu của bệnh? Đây là câu hỏi không có câu trả lời bởi vì nó có thể kéo
dài từ 3 tháng đến 10 năm thậm chí có thể kéo dài lâu hơn nữa tuỳ thuộc sức
khỏe và chức năng của hệ miễn dịch cơ thể. Mặc dù không có dấu hiệu của
5
bệnh nhưng virus vẫn tiếp tục nhân lên và tấn công những tế bào của hệ miễn
dịch (NIAID, 2003). Ở giai đoạn này nồng độ IgM anti-HIV giảm dần để
thay thế bằng sự hình thành IgG anti-HIV. Ngoài ra, trong giai đoạn này ta có

1.3. Suy giảm miễn dịch do HIV
Khi HIV xâm nhập vào cơ thể, nó không chỉ làm giảm về số lượng mà
còn làm suy giảm chức năng của các tế bào miễn dịch đặc biệt là tế bào
lympho T, lympho B và đại thực bào. Tuy nhiên, do HIV có ái tính đặc biệt
với phân tử CD4 nằm trên bề mặt của tế bào lympho T (tế bào đóng vai trò
nhạc trưởng quan trọng chỉ huy và điều hòa quá trình đáp ứng miễn dịch) làm
7
ly giải hoặc bất hoạt chức năng của tế bào này dẫn đến suy giảm tất cả các
loại đáp ứng miễn dịch.
Cơ chế giảm tế bào TCD4 do tác động trực tiếp của HIV (Bộ Y tế, 2004):
- Tế bào TCD4 bị phá hủy do HIV xâm nhập và nhân lên
làm tăng tính thấm màng tế bào, gây ứ đọng calci và nước.
- Khi virus nhân lên sẽ giải phóng một lượng lớn cDNA,
RNA tự do trong bào tương tế bào, gây độc cho tế bào.
- Dưới tác động của HIV làm tế bào TCD4 chết theo
chương trình nhanh hơn bình thường.
- Các phân tử CD4 mới hình thành trong bào tương chưa
hiện diện trên bề mặt tế bào đã bị liên kết với gp120 và sản phẩm
gp120-CD4 trong bào tương sẽ làm chết tế bào.
Cơ chế suy yếu của tế bào TCD4 dưới tác động gián tiếp bởi HIV.
- HIV phong bế quá trình chín của TCD4 chưa bị nhiễm
thông qua
cytokine của tế bào bị nhiễm.
- Do KN gp120 trên bề mặt tế bào TCD4 đã bị nhiễm lại
tiếp tục gắn với CD4 của TCD4 chưa bị nhiễm tạo thành hợp bào là tế
bào khổng lồ nhiều nhân có đời sống ngắn không quá 48 giờ.
- Do cơ chế tự miễn, gp120 của virus bong ra từ tế bào
TCD4 đã bị nhiễm HIV lại gắn với phân tử CD4 của tế bào chưa bị
nhiễm nên trong máu xuất hiện KT kháng gp120 của virus làm huỷ
hoại tế bào T có cấu trúc bề mặt tương tự gp120 theo cơ chế gây độc tế

- Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch (Bùi Đại et al, 2000, Nguyễn
Triệu Vân et al, 1999).
2. Chẩn đoán phát hiện HIV
Chẩn đoán sự nhiễm HIV thông thường phát hiện một cách gián tiếp
thông qua kháng thể đặc hiệu kháng virus (Gurtler 1996). Đây là dấu hiệu của
đáp ứng miễn dịch dịch thể, chống lại những tác nhân được tìm thấy gần như
100% những người nhiễm HIV.
Chẩn đoán trực tiếp sự lây nhiễm HIV cũng có thể tiến hành nhờ việc
xác định virus truyền nhiễm (sử dụng nuôi cấy tế bào chỉ có thể thực hiện
trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3), kháng nguyên virus (ELISA
9
phát hiên kháng nguyên p24) hoặc axit nucleic của virus (tức là bộ gen của
virus; NAT = phát hiện axit nucleic). Để xác định tình trạng nhiễm trùng của
bệnh nhân, phát hiện virus trực tiếp chỉ cần thiết trong những trường hợp nhất
định, chẳng hạn như nhiễm trùng nguyên phát hoặc nhiễm trùng theo đường
từ mẹ sang con (mô tả chi tiết ở dưới). Bên cạnh xét nghiệm định tính ( trả lời
câu hỏi "có hoặc không có"), xét nghiệm đính lượng để phát hiện số lượng
virus đã trở nên rất quan trọng: Nồng độ của virus trong huyết thanh, được gọi
là "lượng virus", đã trở thành một công cụ không thể thiếu cho việc định
hướng liệu pháp kháng retrovirus (Berger 2001). Thuật ngữ "xét nghiệm
HIV" (vẫn thường được hiểu không chính xác là "xét nghiệm AIDS”), tuy
nhiên hầu như thuật ngữ này luôn luôn đề cập đến việc phát hiện kháng thể
đặc hiệu kháng HIV, dấu ấn của nhiễm trùng HIV.
* Tiêu chuẩn đánh giá
Để đánh giá chất lượng của bộ kit, người ta căn cứ vào hai tiêu chuẩn
quan trọng nhất là độ nhạy và độ đặc hiệu của chúng.
+ Độ nhạy
- Độ nhạy = số trường hợp dương tính thật/ số trường hợp dương tính
thật + số trường hợp âm tính giả.
PA

Trong giai đoạn sớm của quá trình chuyển đổi huyết thanh, những kỹ
thuật kiểm tra sàng lọc bằng kháng thể sẽ cho phản ứng rất yếu. Sử dụng kỹ
thuật Western blot để khẳng định trong giai đoạn này sẽ không xuất hiện một
băng nào hoặc xuất hiện không đầy đủ, thường thì băng p24 xuất hiện đầu
tiên và có thể nhìn thấy. Trong những trường hợp như vậy thường rất khó
11
phân biệt với những nguời không bị lây nhiễm nhưng vẫn xảy ra phản ứng
không đặc hiệu. Đây cũng là một thông tin hết sức quan trọng cho các phòng
xét nghiệm thấy hết tầm quan trọng thế nào trong quá trình tiến hành kiểm tra.
Trong những trường hợp như vậy sẽ kiểm tra lại trong vòng một thời
gian ngắn. Nếu thực sự lây nhiễm HIV và đang ở trong giai đoạn chuyển đổi
huyết thanh thì lượng kháng thể sẽ được tăng đáng kể trong vài ngày sau, và
trong vòng vài tuần thì sẽ thấy sự xuất hiện đầy đủ của các băng thông qua
phản ứng western-blot. Nó phụ thuộc It depends on the individual
circumstances whether direct virus detection e.g. by means of PCR is
advisable at the outset. Note: antiretroviral post-exposure prophylaxis may
make direct virus detection more difficult and potentially delay
seroconversion.
2.2. Các kỹ thuật phát hiện HIV trong cơ thể
2.2.1. Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV
Các phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV có thể là phát
hiện bản thân virus ở dạng hoàn chỉnh, RNA/cDNA virus hoặc phát hiện
những KN đặc trưng của virus (Bộ Y tế, 2005c).
2.2.1.1. Phân lập virus hoàn chỉnh
Bệnh phẩm có thể là: máu, dịch não tuỷ, dịch sinh dục, sữa mẹ, mảnh
cắt tổ chức nhưng phổ biến nhất là sử dụng bạch cầu đơn nhân trong máu
ngoại vi.
Sau khi phân lập, bạch cầu đơn nhân của người bệnh được nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo có thêm những bạch cầu của người lành (có CD4)
để virus thâm nhiễm, nhân lên đạt đủ mật độ để phát hiện ra bằng các kỹ thuật

làm biến đổi màu cơ chất. Khi đo màu cơ chất hoặc đo hoạt tính phóng xạ có
thể định tính và định lượng kháng nguyên.
Về lý thuyết người ta có thể phát hiện tất cả các kháng nguyên của
virus nhưng trên thực tế, do tính đặc hiệu và ái lực của các kháng thể chủ yếu
hướng tới các protein chính trong vỏ nhân (nucleocapsid) như p24. Vì vậy,
kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện kháng nguyên p24. Dấu hiệu mất
kháng nguyên p24 ở những người đã có phản ứng huyết thanh học HIV
dương tính là dấu hiệu nói lên sự khởi đầu của AIDS lâm sàng (NXB Y học,
1995). Đây là xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (98-99%) nhưng độ nhạy chỉ đạt
10-25% ở trẻ sơ sinh và 50% ở trẻ lớn hơn (http://www. Dostquangtri.gov.vn).
2.2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong
công tác xét nghiệm, theo dõi điều trị và nghiên cứu sinh học di truyền của
virus và là công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi tiến
triển bệnh, chỉ định và theo dõi hiệu quả điều trị thuốc, nghiên cứu tính kháng
thuốc.
2.2.3.1. Các kỹ thuật định tính
* Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp DNA
nhờ enzym Polymerase do nhà bác học người Mỹ có tên là Kary Mulis phát
minh năm 1983. Kỹ thuật PCR đã đem lại một cuộc cách mạng trong di
truyền học phân tử. Nhờ kỹ thuật PCR mà một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ
trong bộ gen được khuếch đại lên rất nhiều bản sao khi trình tự nucleotid ở
hai đầu đoạn đó đã biết. Khi phân lập được từng gen riêng biệt chúng ta có
thể tạo dòng gen hay gây các đột biến và làm thay đổi các gen này; đồng thời
14
chúng ta có thể ứng dụng các kỹ thuật để chẩn đoán các dạng đột biến gen
hay để xác định các dạng đột biến.
Dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính và nguyên lý tổng hợp DNA
nhờ hoạt tính của các DNA polymerase. Với nguyên liệu là bốn loại

enzym polymerase và do đó nó quyết định vùng gen nào của DNA khuôn sẽ
được sao chép. Các mồi này liên kết bổ sung với vùng gen đích của DNA
khuôn và đầu 3
,
(OH) hướng về phía đoạn mồi khác. DNA polymerase cần có
các đoạn mồi olygonucleotid cho hoạt động xúc tác. Quá trình kéo dài mồi
với sự có mặt của 4 loại deoxynucleotid đã được hoạt hóa (dATP,dGTP,dCTP
và dTTP) và dung dịch đệm đặc hiệu cho phép vùng DNA nằm giữa hai vị trí
bám của mồi được nhân lên trong mỗi chu kỳ phản ứng.
Sau mỗi chu kỳ như vậy, các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục
được dùng làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp
theo. Sản phầm cuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi có chiều dài
bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm
được xác định bởi đầu tận cùng 5
’
của hai đoạn gen mồi.
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn
DNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ tùy theo mục đích sử dụng.
Cuối cùng, sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phòng
hoặc 4
0
C.
PCR thường ít được sử dụng hơn so với chẩn đoán huyết thanh học và
chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nghi là mới nhiễm HIV còn đang
trong giai đoạn cửa sổ và chưa thể phát hiện được kháng thể bằng phương
pháp huyết thanh học (CDC, 2001).
* Các kỹ thuật định lượng
Định lượng virus, RNA huyết tương hoặc DNA provirus là thông số
quan trọng để theo dõi mức độ xâm nhập và nhân lên của HIV, chỉ định điều
trị và theo dõi, đánh giá kết quả điều trị.

kỹ thuật phát hiện " không đồng nhất", vì trong kỹ thuật này, một hỗn hợp của
sản phẩm PCR được phát hiện, chứ không phải từng thành phần của sản phẩm
được phát hiện như trong kỹ thuật điện di. Quá trình phản ứng đơn giản nhất
là bổ sung ethidium bromid vào hỗn hợp phản ứng. Khi ethidium bromid xen
vào cấu trúc chuỗi đôi DNA, tín hiệu huỳnh quang sẽ được tạo ra, mức độ tín
hiệu phụ thuộc vào lượng DNA chuỗi đôi được tạo ra trong quá trình phản ứng.
Với hướng tiếp cận như vậy, cho đến nay đã có nhiều cải tiến trong các
kỹ thuật phát hiện DNA chuỗi đôi. Các kỹ thuật đó là:
- Real time PCR sử dụng SYBR Green I
- Real time PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu (probe).
Với phản ứng real time PCR, kết quả khuyếch đại DNA đích sẽ được
hiển thị ngay sau sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng thông qua biểu đồ
khuyếch đại của phản ứng. Quan sát biểu đồ này ta thấy trục tung (Y) biểu thị
cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích
thích. Trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt.
Hình 3. Biểu đồ real time PCR định lượng HIV trong huyết thanh
18
Khi đánh giá hai phương pháp PCR cổ điển và real-time PCR người ta
nhận thấy Real time PCR có nhiều ưu điểm hơn so với PCR cổ điển:
- Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản
ứng, do vậy ta có thể biết được lượng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu
kỳ) của phản ứng của quá trình khuếch đại. Trái ngược với PCR cổ điển, chỉ
cho ta biết được lượng sản phẩm khuếch đại tại thời điểm cuối cùng của phản
ứng bằng cách điện di trên gel sau khi phản ứng kết thúc. Mặt khác, gel
agarose có hạn chế là độ phân giải thấp, kỹ thuật điện di của người làm thí
nghiệm do vậy kết quả thường không chính xác.
- Real-time PCR có độ đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với PCR cổ điển do
dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại .Trong khi đó
PCR cổ điển chỉ phân biệt sản phẩm khuếch đại dựa vào kích thước của các
băng sản phẩm trên gel. Trong khi đó khi tiến hành phản ứng PCR, có nhiều

* Kỹ thuật ngưng kết (agglutination)
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ngưng kết thụ động, những hạt như
gelatin (SERODIA test), latex hoặc hồng cầu người làm giá đỡ cho các
protein virus. Khi cho tiếp xúc với KT kháng HIV, các hạt này tạo thành một
mạng lưới ngưng kết có thể nhận định bằng mắt thường.
Đây là kỹ thuật đơn giản, nhanh, không đòi hỏi trang bị cao có thể tiến
hành hàng loạt nên có ý nghĩa điều tra dịch tễ, sàng lọc máu tuy nhiên có phản
ứng dương tính giả.
* Kỹ thuật miễn dịch enzyme pha rắn ELISA
ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm
có KT kháng HIV. Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do đó có
20
thể cho những kết quả dương tính giả. Để hạn chế nguy cơ này, cần phải có
phương pháp kết hợp để khẳng định chẩn đoán của ELISA. Western Blot
(WB) là phương pháp hỗ trợ phổ biến nhất để khẳng định kết quả dương tính
của ELISA, IFA cũng được dùng như một phương pháp thay thế cho WB.
ELISA được ứng dụng để phát hiện các KT IgG anti-HIV, IgA anti-
HIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹ thuật sau:
+ Kỹ thuật ELISA gián tiếp
KT kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN HIV đã
được cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng trên hạt nhựa). Phức hợp
KN-KT được nhận biết bởi một cộng hợp là KT kháng Ig người có gắn
enzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp. Giá trị mật
độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng KT kháng HIV hiện diện
trong mẫu thử.
Đây là xét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao do
thường bị dương tính giả.
+ Kỹ thuật ELISA Sandwich
KT kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các KN virus trong
mẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme. Giá trị mật độ quang

một loài sinh vật là một kỹ thuật hết sức quan trọng. Sự xuất hiện của các
phương pháp giải trình tự gen đã đã đánh dấu bước ngoặt lớn, mang lại một
cuộc cách mạng trong nghiên cứu y sinh học cơ bản và trong nhiều lĩnh vực
ứng dụng như công nghệ sinh học, chẩn đoán, sinh học pháp y.
22
3.1. Giải trình tự DNA bằng phương pháp hóa học
Năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương phương pháp
hóa học giải trình tự DNA .Phương pháp này gồm các bước như sau [Maxam
A., Gilbert W., 1997]:
(1): Đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một
gốc phospho đồng vị phóng xạ, thường đánh dấu tại đầu 5' bằng 32P.
(2): Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu bằng chất hóa học có thể gây
biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotid trên đoạn DNA để. Ví
dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng cách thêm một gốc methyl ở
vị trí nitrogen thứ 7, hydrazine làm biến đổi Thyamine và Cytosine, hydrazine
và NaCl gây biến đổi Adenine và Cytosine, acid làm biến đổi Guanine và
Adenine, NaOH làm biến đổi Adenine và Cytosine nhưng ưu tiên biến đổi
Adenine hơn Cytosine. Như vậy, trong giai đoạn này phải cần ít nhất 4 ống
nghiệm và mỗi ống nghiệm có một lượng DNA nhất định được xử lý bằng
một trong các chất hóa học nêu trên do đó mỗi ống nghiệm chỉ chứa các đoạn
DNA có một vị trí nucleotid đặc hiệu đã bị biến đổi với chất hóa học.
Hình 4: Đánh dấu phóng xạ và biến đổi các nucleotid bằng hóa chất.
23
(3): Các nucleotide bị biến đổi sẽ được lấy ra khỏi khung mạch Ribose-
Phosphate của đoạn DNA và do đó, đoạn DNA ban đầu sẽ được tách ra thành
các đoạn mạch đơn đã được đánh dấu
32
P và một đầu base nitơ bị lấy ra khỏi
mạch khung. Các mạch đơn này có độ dài khác nhau tùy thuộc vào vị trí base
nitơ bị lấy ra khỏi mạch khung.

khi xử lý mẫu DNA trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng
với mỗi vị trí của base biến đổi sẽ có một mạch đơn đã được đánh dấu một
đầu 32P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này nên phương pháp Maxam-
Gilbert hiện nay ít được sử dụng mà thay vào đó là những phương pháp
enzyme xác định trình tự DNA với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.
3.2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA: Phương pháp Sanger
(Dideoxynucleotid chain termination)
Phương pháp Dideoxynucleotid chain termination hay còn gọi là
phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-determination method) là một phương
pháp xác định trình tự DNA được Frederick Sanger phát triển vào năm 1977.
Kĩ thuật này dùng phân tách trình tự cụ thể (sequence-specific termination)
của một phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) dùng chất nền
nucleotide đã được chỉnh sửa.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của
enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA
polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị
25
trí 3'có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không có nhóm 3'-OH thì
phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp là sử dụng
dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp DNA một cách ngẫu
nhiên. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi là đoạn DNA mạch đơn có kích
thước 20 nucleotide.
Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA
khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq
polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có
bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản
ứng khác nhau. Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3
và carbon thứ 4. Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì
không có nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không
được kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.