Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
1BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
o0o VŨ LAN ANH XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH TẾ BÀO TRẦN TỪ
MÔ S
ẸO PHÔI HOÁ CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN
QU
Ả CÓ MÚI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: Trồng trọt
Mã số: 60.62.01
LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan luận văn là kết quả nghiên cứu hoàn toàn chính xác
và trung thực. Nội dung luận văn có ñược tham khảo và sử dụng các tài liệu,
thông tin ñược ñăng tải và công bố trên các tác phẩm, tạp chí và các webside
theo danh mục tài liệu của luận văn.
Kết quả trình bày trong luận văn ñược xử lý thống kê bằng phần mềm
thống kê với ñộ tin cậy cao. Vũ Lan Anh
1.5.1. Quá trình phát sinh phôi soma gián tiếp qua callus 15
1.5.2. Những yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình tạo mô sẹo phôi hoá ở
giống cây có múi
18
1.6. Tách và nuôi tế bào trần ở citrus 23
1.6.1. Lịch sử phát triển của phương pháp tách nuôi và tái sinh tế
bào trần
23
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
51.6.2. Các phương pháp tách tế bào trần từ các nguồn mẫu khác
nhau
24
1.6.3. Thành công trong nghiên cứu hệ thông tái sinh tế bào trần từ
mô sẹo phôi hoá ở citrus
25
1.6.4. Những ứng dụng trong nghiên cứu hệ thông tái sinh tế bào
trần từ mô sẹo phôi hoá ở citrus
26
1.7. Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi
hoá
30
1.7.1. Tạo phôi vô tính ở cây ăn quả có múi 30
1.7.2. Tái sinh cây từ phôi vô tính 31
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
32
2.1. Vật liêu nghiên cứu 32
của hai giống cây ăn quả có múi
53
3.2.4. So sánh hệ số nhân sinh khối callus giữa nuôi cấy lỏng lắc
thông thường với nhân sinh khối thông qua hệ thống Bioreacter
58
3.3. Tách và nuôi cấy tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá 60
3.4. Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi
hoá ở hai giống citrus
63
3.4.1. Tạo phôi vô tính từ tế bào trần nguồn gốc mô sẹo phôi hoá của
hai giống citrus
63
3.4.2. Tái sinh cây từ phôi vô tính 70
3.5. Kết quả ñưa cây ra vườn ươm 76
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
7DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên bảng Trang
1.1 Các giống thương mại chính ñược trồng ở nước ta 7
1.2 Quá trình phát sinh phôi ở cây một lá mầm và hai lá mầm 17
3.1 Ảnh hưởng của H
2
O
2
với thời gian và nồng ñộ khác nhau
ñến hiệu quả khử trùng
43
3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP và 2,4-D + kinetin ñến
sự hình thành callus của cam Sành
45
3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP và 2,4-D + kinetin ñến
sự hình thành callus cam Valencia
46
3.4 Ảnh hưởng của dạng mẫu ñối với tạo mô sẹo phôi hoá 47
3.5 Ảnh hưởng BAP và kinetin ñến nhân sinh khối callus 50
3.6 Ảnh hưởng của ME ñến nhân sinh khối ở hai giống cam
Sành và cam Valencia
52
3.7 Ảnh hưởng của thể tích môi trường khác nhau ñến nhân
sinh khối callus của cam Sành và cam Valencia
54
3.8 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc khác nhau ñến nhân sinh khối
callus của cam Sành và cam Valencia
56
3.9 So sánh hệ số nhân sinh khối callus giữa nuôi cấy lỏng lắc
thông thường với nhân sinh khối thông qua hệ thống
2
O
2
với thời gian và nồng ñộ khác nhau
ñến hiệu quả khử trùng mẫu
43
3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4 D + BAP và 2,4-D + kinetin
ñến sự hình thành callus cam Sành và cam Valencia
46
3.3 Callus cam Valencia trên môi trường có bổ sung CðHST
khác nhau
47
3.4 Ảnh hưởng của dạng mẫu nuôi cấy ñối với tạo mô sẹo
phôi hoá
48
3.5 Mô sẹo thu ñược từ noãn cam Sành 48
3.6 Callus trên môi trường bổ sung 2mg/l BAP 51
3.7 Ảnh hưởng của ME ñến nhân sinh khối ở hai giống cam
Sành và cam Valencia
53
3.8 Sinh khối của callus trên môi trường bổ sung 0,5mg/l ME 53
3.9 Ảnh hưởng của thể tích môi trường ñến nhân sinh khối
callus của hai giống cam Sành và cam Valencia
55
3.10 Sinh khối callus cam Sành trong môi trường lỏng lắc với
thể tích khác nhau
55
3.11 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc và thể tích môi trường khác
nhau ñến nhân sinh khối callus của cam Sành và cam
Valencia
Ảnh hưởng của nước dừa và ME ñến tỷ lệ nảy mầm của
phôi vô tính ở cam Sành và cam Valencia
75
3.22 Ảnh hưởng của nước dừa ñến nảy mầm và phát triển của
phôi vô tính ở cam Valencia
75
3.23 Ảnh hưởng của loại giá thể ñến tỉ lệ sống của cây con 77
3.24 Cây con ngoài vườn ươm 77
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
11MỞ ðẦU
Cây ăn quả có múi (citrus) ñược xem là một trong những cây ăn quả
quan trọng nhất trên thế giới, nhờ giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của nó.
Chính vì những giá trị ñó mà diện tích và sản lượng citrus trên thế giới trong
những năm qua liên tục tăng [31]. Sản xuất quả Citrus tăng từ 22 triệu tấn
năm 1960 ñến 78 triệu tấn năm 1991 và trong năm 2000 – 2004 sản lượng
citrus ñã lên ñến 105 triệu tấn [41, 24]. ðến năm 2007-2008 thì sản lượng của
cả thế giới tăng lên 117 triệu tấn với diện tích xấp xỉ 8 triệu ha [25].
Ở Việt Nam diện tích trồng cây ăn quả có múi trong những năm qua
cũng tăng rất nhanh, năm 1990 cả nước có 19 062 ha cam quýt với sản lượng
119 238 tấn [2]. ðến năm 2007-2008 sản lượng citrus của cả nước ñã tăng lên
624 000 tấn với diện tích khoảng 61 100 ha, riêng cam quýt chiếm 51 100 ha
[25].
Các giống cam quýt của nước ta vô cùng phong phú bao gồm các giống
thích nghi rộng, chịu hạn cao. Ngoài ra cam Valencia có ñặc ñiểm là chín
muộn, và có thể thu hoạch trong thời gian dài [3]. Do vậy, việc xây dựng
thành công hệ thống tái sinh tế bào trần có nguồn gốc từ mô sẹo làm vật liệu
nghiên cứu chọn tạo giống mới có năng suất, chất lượng cao, không hạt thích
nghi với môi trường sinh thái và thị trường trong nước là một yêu cầu quan
trọng của công tác chọn tạo giống.
Với lý do ñó, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài:
“
Xây dựng hệ thống
tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá của một số giống cây ăn quả có múi
”.
Mục ñích nghiên cứu
- Xây dựng quy trình tạo mô sẹo phôi hoá in vitro ở giống cam Sành và cam
Valencia làm vật liệu tốt cho tách và nuôi cấy tế bào trần.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
13- Xây dựng ñược phương pháp tái sinh cây từ tế bào trần ở hai giống cam
Sành và cam Valencia làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về dung hợp tế
bào trần và chuyển gen.
Yêu cầu
ðể ñạt ñược mục ñích trên chúng tôi tiến hành một số nghiên cứu sau:
- Xây dựng quy trình tạo mô sẹo phôi hoá của hai giống cam Sành và cam
Valencia
- Xác ñịnh môi trường tối ưu cho giai ñoạn nhân sinh khối nguồn mô sẹo
phôi hoá
- Tách và nuôi cấy thành công tế bào trần từ nguồn mô sẹo phôi hoá
- Tạo ñược cây con ngoài vườn ươm
Dicotylendones. Hệ thống phân loại ñầu tiên của Liné (1753) ñến nay ñã ñược
nhiều tác giả bổ sung, ñiều chỉnh [3]. Theo hệ thống phân loại của Swingle
(1967), Sykes (1987) và Jones (1990) thì họ Rutaceae, dưới họ Aurantioideae
có hai tông (tông Clauseneae và Citreae), 6 tông phụ và 33 chi, trong chi
citrus có 16 loài.
Tông Citreae có khoảng 13 chi, trong ñó có 6 chi quan trọng
là Citrus, Poncitrus, Fortunella, Eremocitrus, Microcitrus và Clymenia. ðặc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
15ñiểm chung của 6 chi này là cho trái có tép mọng nước. Chi citrus ñược chia
làm 2 nhóm nhỏ Eucitrus và Papeda, các loài ñược trồng phổ biến hiện nay
thuộc nhóm Eucitru. Các loài trong nhóm Papeda thường ñược dùng làm gốc
ghép hay lai với các loài khác.
Ở Việt Nam ñã ghi nhận là có 14 chi, 37 loài thuộc dưới họ
Aurantioideae. Theo Võ Văn Chi (1997), ở nước ta chi citrus có 11 loài (Phụ
lục 1, bảng 2). Khác với Võ Văn Chi, Phạm Hoàng Hộ (1992) chia chanh kiên
và chanh tây làm hai loài riêng biệt: citrus limonia (chanh kiên) và C. limon
(chanh tây) và bổ sung thêm một số loài, ví dụ, C. nobilis (cam Sành, King
Mandarin).
1.1.2. Nguồn gốc
Citrus xuất hiện ñầu tiên ở ðông Nam Châu Á khoảng 4000 năm trước
công nguyên, sau ñó ñược di chuyển dần sang miền bắc Châu Phi chủ yếu qua
con ñường thương mại [8]. Tanaka (1979) ñã vạch ñường ranh giới vùng xuất
xứ của các giống thuộc chi citrus từ phía ñông Ấn ðộ (chân dãy Hymalaya)
qua Úc, miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản. ðiều này cũng khẳng ñịnh thêm
về nguồn gốc các giống cam chanh (Citrus sinensis Osbeck) và các giống
quýt ở Trung Quốc theo ñường ranh giới gấp khúc Tanaka [3]
C). Các yếu tố ảnh
hưởng ñến vùng trồng cây ăn quả có múi bao gồm khí hậu, ñất ñai, nhiệt ñộ
tối thiểu. Những nơi có nhiệt ñộ thích hợp nhưng lượng mưa nhiều, nhiều gió,
nhiều mây che phủ kèm theo bức xạ mặt trời yếu hoặc ñất ñai không phù hợp
như tầng canh tác nông, khả năng giữ nước kém, lũ lụt, sẽ không thuận lợi
cho cây có múi phát triển.
Theo thống kê trên thế giới có khoảng hơn 90 nước trồng cây ăn quả có
múi, với diện tích trồng trọt gần 3 triệu ha. Phần lớn chúng ñược trồng ở các
vùng cận nhiệt ñới khoảng giữa 15
0
và 35
0
vĩ Bắc, 15
0
và 35
0
vĩ Nam, có nhiệt
ñộ mùa ñông lạnh vừa phải, có giai ñoạn ngủ nghỉ ñông và sau ñó cây ra hoa
ñồng loạt vào mùa xuân. Tại các vùng nhiệt ñới khoảng giữa 15
0
vĩ bắc và 15
0
vĩ nam nơi có nhiệt ñộ cao, không thích hợp lắm cho việc trồng cam quýt
nhưng bưởi và chanh lại khá phát triển do chịu ñược nhiệt. Khi nhiệt ñộ cao
quanh năm, cây có múi có thể ra hoa vài lần trong năm. Sự ra hoa ở vùng này
ñược kích thích bởi khô hạn hoặc các yếu tố khắc nghiệt khác. Quả thường có
vỏ màu xanh khi chín và chất lượng thấp hơn. Bù lại, ở các vùng cao như cao
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
17
Bưởi Phúc Trạch Trong nước Hà Tĩnh
Bưởi Năm Roi Trong nước Vĩnh Long
Trong số các giống ñược trồng nhiều hiện nay giống phổ biến và thích
nghi rộng nhất với cả hai miền Bắc và Nam là giống cam Sành (Citrus
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
18nobilis), có giá trị kinh tế cao, nặng trung bình 3-4 quả/kg, nhiều nước, mầu
vàng da cam sẫm khi chín, vị ngọt hơi chua. Mặc dù có hương vị rất ñược ưa
chuộng và năng suất cao nhưng cam Sành lại là giống nhiều hạt và tính trạng
này làm giảm giá trị của giống rất nhiều và không ñáp ứng ñược yêu cầu của
thị trường quốc tế cũng như yêu cầu trong công nghiệp chế biến.
Ngoài các giống của ñịa phương, nhiều tập ñoàn giống cây có múi ñã
ñược nhập vào Việt Nam, trong ñó có một số giống như Valencia, Navel,
Clementine, giống chanh không hạt,… ñã cho năng suất và chất lượng quả
khá. Vì nhiều lý do tập ñoàn giống quý này vẫn chưa ñược trồng rộng rãi và
công nhận như là giống sản xuất trong nước.
Các giống trồng sản xuất phổ biến ở nước ta ña số ñều là các giống
nhiều hạt, lạc hậu so với tiêu chuẩn quốc tế. Vì vậy việc tạo giống không hạt
chất lượng cao là vấn ñề lớn trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi nói
chung và giống cam Sành nói riêng ở nước ta.
1.2. Tình hình sản xuất, tiêu thụ quả có múi trong nước và trên thế giới
1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới
Sản xuất quả citrus của thế giới liên tục tăng: 22 triệu tấn vào năm
1960, 78 triệu tấn vào năm 1991 và từ năm 2000 - 2004 sản lượng citrus hàng
năm ñạt 105 triệu tấn [41, 24]. ðến năm 2007 – 2008 sản lượng citrus trên
toàn thế giới ước tính vào khoảng 116 triệu tấn, trong ñó sản lượng cam
chiếm khoảng 64 triệu tấn. Trên thế giới có 140 nước sản xuất quả citrus tập
chung chính là Florida và Sao Paulo (Braxin), với sản lượng hàng năm chiếm
342 041 ha, Sao Paulo (Braxin) là 338 000 ha. Nước nhiệt ñới trồng nhiều
cam quýt là Mexico, riêng bang Veracruz ñã trồng 70700 ha. Mexico nằm ở
10-24
o
vĩ Bắc tương tự với Việt Nam và là nước có sản lượng quả có múi xếp
thứ 5 trên thế giới [4].
Quả có múi chủ yếu ñược tiêu thụ ở các nước phát triển, mặc dù tiêu
thụ quả citrus bình quân trên ñầu người ở các nước ñang phát triển ñang tăng
lên do thu nhập tăng. Tiêu thụ quả có múi bình quân ñầu người ở các nước
phát triển năm 2002 là 22kg/ người (cam, quýt), 2kg/ người (bưởi); ở các
nước ñang phát triển là 8,5kg/ người (cam, quýt) và 0,5kg/ người (bưởi)[22].
Nhưng theo FAO, tiêu thụ cam tươi ở các nước ñang phát triển hiện nay có xu
hướng giảm do hai lý do: tiêu thụ cam tươi ñang ñược thay thế bằng nước
cam; khâu bảo quản và vận chuyển ñược cải thiện nên có nhiều loại quả thay
thế khác. Tuy vậy, tiêu thụ cam tươi vẫn phổ biến ở nhiều nước ñang phát
triển, ñặc biệt là ở những nền kinh tế khổng lồ như Mexico, Ấn ðộ,
Argentina, Braxin và Trung Quốc.
Bên cạnh ñó, sản lượng nước cam trên thế giới cũng tăng lên ñáng kể,
năm 2005/06 dự ñoán là 2,4 triệu tấn (65 ñộ brix), tăng 4 % so với năm
2004/05. Sản lượng nước cam tại Brazil trong năm 2005/06 (từ thỏng 7 năm
2005 ñến tháng 7 năm 2006) ước tính khoảng 1,4 triệu tấn (65 ñộ brix) tăng
9% so với năm 2004/05. Tại Mỹ, sản lượng nước cam trong năm 2005/06 ước
tính xấp xỉ 709.000 tấn, tăng 2 % so với năm 2004/05 nhưng sản lượng nước
cam giảm 32% so với mức cao nhất của năm 2003/04. Thông thường hàng
năm ước tính cứ khoảng 95% tổng sản lượng ñược chế biến thành nước cam
tại Florida. Sản lượng cam năm 2005/06 tại Florida ñược dự ñoán là tăng
khoảng 27 % so với năm trước, trước khi cơn bão Wilma ñổ vào Florida. Mặc
dù vậy năm 2005/06 do bị ảnh hưởng của cơn bão Wilma, sản lượng cam
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
22vậy, việc tạo nguồn giống sạch bệnh và tạo giống không hạt chất lượng cao là
yêu cầu cấp bách trong sản xuất quả có múi hiện nay.
1.3. Tình hình nghiên cứu cây ăn quả có múi trong nước
Ở nước ta, các nghiên cứu mới chỉ dừng ở mức ñộ phân loại thực vật,
cách trồng và nhân giống vô tính,… citrus cũng là một trong những ñối tượng
ñược các tác giả như Phạm Hoàng Hộ (1992), ðỗ ðình Ca (1996), Võ Văn
Chi (1997), ðỗ Năng Vịnh (2000) nghiên cứu phân loại thực vật công phu.
Việc tuyển chọn cây ñầu dòng ñã ñược các viện nghiên cứu và các ñịa
phương thực hiện khá thành công. Một số giống cây có múi ñặc sản, nhất là
bưởi Năm Roi ñã ñược nghiên cứu phát triển tại Viện cây ăn quả miền Nam.
Tại miền Bắc, Viện nghiên cứu Rau Quả, Trung tâm cây ăn quả Xuân Mai,
Phủ Quỳ, Phú Hộ là các trung tâm nghiên cứu, ñồng thời là nơi sản xuất giống
cây có múi phục vụ sản xuất [4].
Từ năm 1991, bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Di truyền Nông nghiệp
ñã tiến hành nghiên cứu về chọn tạo giống cam, bưởi không hạt, tạo giống ña
bội và ñã thu ñược một số kết quả có ý nghĩa lý luận cơ bản, ñồng thời ñã tạo
ra nhiều dòng tam bội và nguồn gen mới có các ñặc tính không hạt ở cây ăn
quả có múi, cụ thể như sau:
a. ðã nghiên cứu quy trình tạo cây tứ bội thể từ chồi ngủ của cây già, hạt
non, mô sẹo phôi hoá và cụm chồi in vitro ở các loài và giống cây ăn quả có
múi khác nhau.
b. Xây dựng ñược quy trình tạo và nhân nhanh mô sẹo phôi hoá, phôi vô
tính và cây con từ cấy mô ở các giống cây ăn quả có múi bản ñịa khác nhau
dùng trong nghiên cứu ña bội hoá, biến dị và làm vật liệu cho dung hợp tế bào
trần. c. ðã tạo ñược các dòng tứ bội có giá trị, gồm tứ bội thể cam Sành, cam
Vân Du, cam Xã ðoài, bưởi Phúc Trạch, quýt Chum, bưởi ðỏ.
cho quả không hạt. Sản xuất citrus không hạt có thể cải thiện chất lượng quả
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……………
24tươi. Các giống citrus không hạt có một lợi thế thương mại rõ rệt. Một số
giống có nhiều ñặc ñiểm nổi trội nhưng không có giá trị thương mại vì có quá
nhiều hạt. Ở những nước phát triển các giống nhiều hạt ñược trồng ở những
nơi có sự khác nhau lớn về mùa, hoặc do có một số tính trạng tốt hơn, hay
ñơn giản là do thiếu các giống không hạt. Các nhà chọn giống ñang nghiên
cứu những phương pháp cho phép tái tổ hợp giới tính nhằm tạo ra dòng quả
gần như không hạt [32].
1.5. Cơ sở khoa học- Nguyên lý của quá trình phát sinh phôi soma
Chúng ta biết rằng, tất cả tế bào thực vật ñều chứa toàn bộ thông tin di
truyền cần thiết ñể tạo ra một thực vật mới hoàn chỉnh. Về mặt cơ chế phân tử
thì sự phát sinh hình thái này là một quá trình biểu hiện phức tạp của các gen
và ñược ñiều hòa nghiêm ngặt, ñảm bảo cho các hệ thống, cơ quan trong cơ
thể sống biệt hóa ñúng thời ñiểm cần thiết khi cơ thể ñó phát triển [44, 64].
Vì vậy, việc cảm ứng phát sinh phôi cần trải qua những sự kiện: kết
thúc biểu hiện của các gen ñang hoạt ñộng và thay thế bằng chương trình biểu
hiện gen phôi hóa ñể hình thành phôi soma. Nguyên lý này ñược Sharp và
Evans ñề xuất ñầu tiên vào năm 1983 trên tạp chí Plant Cell Report. Hai ông
ñã sử dụng thuật ngữ “IEDC” (Induced Embryogenic Determined Cell- tế bào
ñược xác ñịnh có khả năng phôi hóa do cảm ứng) ñể mô tả tế bào phôi hóa có
nguồn gốc từ tế bào không phôi hóa; còn các tế bào hình thành từ phôi ñã có
sẵn chương trình biểu hiện gen phôi hóa ñược gọi là PEDC (Pre-Embryogenic
Determined Cell- tế bào ñược xác ñịnh có khả năng tiền phôi hóa). Vì vậy,
tùy theo từng kiểu tế bào mà có hai con ñường phát sinh phôi soma [44, 64,
52]. Tuy nhiên, dù là kiểu phát sinh nào, cả hai loại tế bào IEDC và PEDC
ñều có chức năng như nhau và ñược gọi chung là EDC (Embryogenic
thái trẻ hóa và hệ quả tất yếu là tế bào ñược cảm ứng phân chia mạnh hơn, có
tốc ñộ sinh trưởng nhanh hơn và tạo ra callus, một loại mô biệt hóa kém và
chưa cơ quan hóa. Tuy nhiên, callus thường không ñồng dạng do chúng ñược
Copyright: Tài liệu đại học ©