Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ ĐÌNH QUYỀN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN
Pseudomonas SP. ĐA3.1 TRONG KIỂM SOÁT NẤM
HẠI CÂY TRỒNG Rhizoctonia VÀ Fusarium

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của PGS TS
Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã định hướng
nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về kinh phí, hóa
chất và trang thiết bị nghiên cứu giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của TS Đỗ Thị Tuyên cùng tập
thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, các cô trong viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi trong quá
trình học tập.
Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và cơ quan công tác, luôn động viên và là
động lực tinh thần để tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2012
Học viên

Lê Đình Quyền
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 10
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12
1.1 Bệnh cây trồng do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra 12
1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium và Rhizocronia hại cây trồng 12
1.1.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra tại
Việt Nam 15

2.10 Sắc ký khối phổ 30
2.11 Phân tích cấu trúc bằng cộng hƣởng từ hạt nhân 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn có độc lực cao với nấm F. oxysporum và R. solani 32
3.2 Định tên chủng 32
3.3 Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1
34
3.4 Đánh giá tính chất lí hóa của dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp.
ĐA3.1 35
3.4.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ 35
3.4.2 Ảnh hƣởng của pH 37
3.4.3 Ảnh hƣởng của proteinase K 38
3.5 Tinh sạch hoạt chất thứ cấp ngoại bào ức chế nấm 39
3.5.1 Tách chiết và tinh sạch hoạt chất từ dịch nuôi cấy ngoại bào từ chủng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 39
3.5.2 Xác định cấu trúc hoạt chất tinh sạch từ Pseudomonas sp. ĐA3.1 40
3.5.3 Đánh giá tính chất lí hóa của hoạt chất tinh sạch 44
3.5.4 Hoạt tính ức chế tối thiểu (MIC) của hoạt chất PCA với nấm R. solani và
F. oxysporum 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48
KẾT LUẬN 48
ĐỀ NGHỊ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
Tài liệu tiếng việt: 49
Tài liệu tiếng Anh: 50
PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 54
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái nấm F. oxysporum trên đĩa PDA (A) và bào tử nấm F.
oxysporum soi trên kính hiển vi (B) 12
Hình 1.2. Hình thái nấm R. solani trên đĩa PDA (A) và sợi nấm R. solani soi trên
kính hiển vi (B) 13
Hình 1.3. Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 trên đĩa thạch (A) và
hình thái tế bào (B) 18
Hình 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn ức chế nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B)
32
Hnh 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách
chiết từ chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1; Dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc lựa chọn
(C); Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (D). M: Marker. 33
Hình 3.3. Cây phân loại chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 (HQ914782.1: P.
aeruginosa strain TAUC7; HM597240.1: Pseudomonas sp. MB65; HM439411.1:
P. aeruginosa strain PCP26; FN645730: P. aeruginosa) 33
Hình 3.4. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của chủng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 ở các nồng độ khác nhau sau 5 ngày nuôi cấy 34
Hnh 3.5. Hình ảnh ức chế phát triển của dịch nuôi cấy ngoạ i bà o tƣ̀ chủ ng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 với nấm F. oxysporum (AD) và R. solani (EH) sau 5
ngày nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. (A, E: nồ ng độ 1%; B, F: nồ ng độ 10%; C,
G: nồ ng độ 20%; D, H: nồ ng độ 50%; 1: đĩa đối chứng, 2: đĩa thí nghiệm). 34
Hình 3.6. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F. oxysporum và R. solani của chủng
Pseudomonas sp. ĐA3.1 sau khi xử lí ở các nhiệt độ sau 5 ngày nuôi cấy 36
Hình 3.7. Hoạt tính ức chế sinh trƣởng của dịch ngoại bào Pseudomonas sp. ĐA3.1

Hình 3.15. Cấu trúc phân tử của PCA tinh sạch từ chủng P. aeruginosa ĐA3.1 42
Hình 3.16. Qui trình tinh sạch hoạt chất PCA từ dịch nuôi cấy của Pseudomonas sp.
ĐA3.1 phân lập ở Việt Nam 43
Hình 3.17. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani của hoạt chất PCA tinh
sạch sau khi xử lí với nhiệt độ (A), với pH khác nhau (B), với proteinase K (C) 44
Hnh 3.18. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (AD) và R. solani (EH) của
hoạt chất PCA tinh sạch xử lý với nhiệt độ (A, E), với pH khác nhau (B, C, F, G),
với proteinase K (D, H) sau 5 ngày nuôi cấy. 44
Hnh 3.19. Khả năng ức chế nấm F. oxysporum và R. solani của hoạt chất PCA tinh
sạch từ chủ ng Pseudomonas sp. ĐA3.1 45
Hình 3.20. Hoạt tính ức chế tối thiểu của PCA với F. oxysporum (A) và R. solani
(B) tách chiết và tinh sạch từ dịch nuôi cấy chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 ở nồng
độ: 30, 40, 50, 60, 70, 80 g/ml 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
bp
Base pair
DNA
Deoxyribonucleic acid
RNase
Ribonuclease
dNTP
2-Deoxynucleoside 5-triphosphate
ĐC
Đối chứng
EtBr
Ethidium bromide
HCN
Hydrogen Cyanide

nhiều loại cây rau quả và cây lƣơng thực nhƣ lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu.
Chúng có khả năng tồn tại trong đất trong một thời gian dài, phát sinh và gây hại
ngay từ giai đoạn cây con và kéo dài cho tới khi thu hoạch nếu không áp dụng các
biện pháp phòng trừ triệt để.
Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là
sử dụng các loại thuốc hóa học. Mặc dù có ƣu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả
và tác dụng nhanh, nhƣng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhƣợc điểm
nhƣ hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, nhanh bị ức chế
bởi nấm bệnh sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu
đến sức khỏe con ngƣời. Bên cạnh việc làm giảm chất lƣợng lƣơng thực, thực
phẩm, các loại hóa chất còn tích tụ trong đất, gây ô nhiễm môi trƣờng và làm cho
sản xuất kém bền vững. Hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, việc sử dụng
các chế phẩm vi sinh thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh
cây trồng do vi sinh vật gây ra đang là xu hƣớng chủ yếu. Các chế phẩm này đang
đƣợc sử dụng rộng rãi nhằm tạo ra một nền nông nghiệp hữu cơ an toàn và bền
vững.
Pseudomonas là chi vi khuẩn phổ biến trong môi trƣờng, đã đƣợc sử dụng
trong kiểm soát nhiều bệnh hại cây trồng khác nhau. Từ những năm 1970, trên thế
giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Pseudomonas để phòng trừ nấm
bệnh bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã đƣợc sản xuất và thƣơng mại hóa
(Kommedahl, Chang-Mew, 1975; Cook, Rovira, 1976; Howell, Stipanovic, 1980;
Aziz et al., 2012). Tuy nhiên, kết quả đạt đƣợc trong nghiên cứu và sử dụng các chế
phẩm sinh học bảo vệ thực vật còn hạn chế. Chi phí thuốc bảo vệ thực vật trên thế
giới đạt hơn 39,4 tỷ USD trong năm 2007, giá trị thƣơng mại của thuốc bảo vệ thực
vật sinh học đƣợc sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,9% tổng giá trị của các loại
thuốc bảo vệ thực vật (Kiely et al., 2004; Grube et al., 2011). Vì vậy, việc tăng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm Fusarium và Rhizoctonia
từ chủng Pseudomonas là cần thiết.

giống nhƣ các bào tử khác có thể tồn tại trong đất trong một thời gian dài (Gordon,
Martyn, 1997; Đoàn Thị Thanh, 2005). A
B
Hình 1.1. Hình thái nấm F. oxysporum trên đĩa PDA (A) và bào tử nấm F. oxysporum soi
trên kính hiển vi (B)
Nấm F. oxysoprum là một tác nhân gây bệnh đất phổ biến với cây lá
mầm, làm chết và phân hủy chất hữu cơ trong cây. Nó tồn tại trong đất nhƣ sợi
nấm và các loại bào tử, nhƣng thƣờng tồn tại trong đất nhƣ bào tử hậu. Lây lan
mầm bệnh theo hai cách cơ bản: lây lan khoảng cách ngắn qua bắn nƣớc, bằng thiết
bị trồng trọt và khoảng cách dài qua cấy ghép và hạt giống bị nhiễm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bệnh. F. oxysporum gây hại cho một cây khỏe mạnh bằng lây nhiễm của sợi nấm
hoặc nảy mầm bào tử xâm nhập các mô gốc của cây trồng qua những vết thƣơng ở
gốc, rễ. Các sợi nấm phát triển trong tế bào thông qua vỏ gốc và vào xylem . Một
khi trong xylem, sợi nấm phát triển trong mạch xylem và sản xuất bào tử nhỏ (bào
tử vô tính). Bào tử nhỏ có thể nhập vào dòng nhựa và đƣợc vận chuyển lên. Trƣờng
hợp dòng chảy của nhựa cây dừng bào tử nhỏ nảy mầm. Cuối cùng, các bào tử và
sợi nấm làm tắc nghẽn các mạch dẫn của cây, ngăn chặn cây trồng lấy và chuyển
hóa các chất dinh dƣỡng. Cuối cùng cây trồng thoát hơi nƣớc nhiều hơn nó có thể
vận chuyển, đóng lỗ khí, lá héo và cây chết. Sau khi cây chết nấm xâm nhập vào tất
cả các mô, hình thành bào tử và tiếp tục lây nhiễm sang các cây lân cận (Farr et al.,
1989; Larkin et al., 1993).
Rhizoctonia solani (R. solani) là loại nấm gây bệnh thực vật với một loạt các
thực vật và phân bố trên toàn thế giới. Là tác nhân gây bệnh thực vật đã đƣợc phát
hiện cách đây hơn 100 năm. R. solani thƣờng xuyên tồn tại nhƣ dạng sợi sinh
trƣởng trên cây (Hình 1.2) hoặc trong môi trƣờng và đƣợc xem là một tác nhân gây

hạch nấm. Hạch nấm của Rhizoctonia có lớp bên ngoài dày làm tăng khả năng sống
sót và chúng hoạt động nhƣ cấu trúc ngủ đông cho tác nhân gây bệnh. Trong một số
trƣờng hợp hiếm hoi mầm bệnh cũng có thể tìm thấy dƣới dạng sợi nấm nằm trong
đất. Nấm đƣợc lây nhiễm vào cây trồng bởi các kích thích hóa học đƣợc phát ra bởi
sự phát triển cây trồng hoặc dƣ lƣợng thực vật phân hủy. Quá trình thâm nhập của
mầm bệnh có thể đƣợc thực hiện trong một số cách. Thâm nhập có thể xảy ra thông
qua sự thâm nhập trực tiếp của các lớp biểu bì cây hoặc bằng các con đƣờng qua các
lỗ hở tự nhiên của cây. Sợi nấm sẽ tiếp xúc với cây và gắn với cây thông qua tăng
trƣởng, chúng bắt đầu sản xuất một cấu trúc thâm nhập vào tế bào của cây và sử
dụng chất dinh dƣỡng từ các tế bào của cây. Mầm bệnh cũng có thể sản xuất các
enzyme phân hủy thành tế bào thực vật và tiếp tục sinh trƣởng và phát triển bên
trong các mô chết. Sự phá hủy của thành tế bào và thâm nhập của mầm bệnh trong
cây này tạo thành các hạch nấm. Sau khi chúng thành công sợi nấm thâm nhập vào
cây chủ gây hoại tử và hình thành hạch nấm trong và xung quanh các mô bị nhiễm
bệnh mà sau đó dẫn đến các triệu chứng khác nhau liên quan với các bệnh nhƣ thối
rễ, thối thân, lở cổ rễ, khô vằn Mầm bệnh mới đƣợc sản xuất trên hoặc trong các
mô thực vật và đƣợc lặp đi lặp lại một chu kỳ mới khi các nguồn lây bệnh mới (thực
vật) trở nên có sẵn (Farr et al., 1989; Ceresini, 2011).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra tại
Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh nấm F. oxysporum và R. solani là một trong những bệnh
quan trọng gây hại đồng thời nhiều loại cây trồng nhƣ cà chua, khoai tây, ngô, đậu
tƣơng, cây ăn quả, sầu riêng. Hàng năm sản lƣợng nông nghiệp thất thu do bệnh này
tới hàng chục tỷ đồng (Báo cáo của FAO, 2010). Ngƣời ta ƣớc tính rằng năm 2010
thiệt hại bệnh thực vật, bao gồm cả chi phí kiểm soát, lên tới khoảng 701,2 triệu đô
la. Hai trong các cây quan trọng bị hai bệnh nấm trên gây hại mà có ý nghĩa kinh tế
và sản lƣợng nông nghiệp cao là cây ngô, cây đậu tƣơng. Vì hai cây trên là cây
lƣơng thực và cây công nghiệp ngắn ngày quan trọng, mạng lại hiệu quả kinh tế cao

dụng các loại thuốc hóa học với ƣu điểm là dễ sản xuất ở quy mô lớn với giá thành
rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh. Tuy nhiên,
chúng ngày càng bộc lộ rõ những nhƣợc điểm nhƣ nhanh bị ức chế bởi côn trùng,
gây ô nhiễm đất, nguồn nƣớc và không khí, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời.
Thuốc bảo vệ thực vật nói chung và thuốc diệt nấm bệnh nói riêng đƣợc sử dụng
tràn lan làm cho các loài gây hại biến đổi nhanh chóng và ức chế thuốc. Hiệu quả
của viêc sử dụng thuốc ngày càng thấp ngƣợc lại với chi phí ngày càng cao
(Carrasco, 1989). Ƣớc tính có khoảng 520 loài côn trùng, 150 loài vi sinh vật gây
bệnh cây và 273 loài cỏ dại đã ức chế lại thuốc (Stuart, 2003).
Một số thuốc bảo vệ thực vật có thời gian phân hủy lâu, sau khi đƣợc phun
cho cây trồng sẽ thẩm thấu một phần vào đất và các mạch nƣớc ngầm. Các chất này
khi đã ngấm vào đất do đó nguy cơ bị ngộ độc thuốc diệt côn trùng rất cao. Thuốc
bảo vệ thực vật tổng hợp có độc lực mạnh, phổ tác dụng rộng cũng có nghĩa là có
tính chọn lọc kém. Chúng không chỉ tiêu diệt các đối tƣợng gây hại mà còn tiêu diệt
cả những loài có ích nhƣ động vật ăn côn trùng, các loài kí sinh côn trùng hại cây
trồng (Pimentel et al., 1993), tiêu diệt ong mật và côn trùng thụ phấn cho cây làm
cho nhiều cây trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm năng suất và chất lƣợng (Mussen,
1990).
Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học làm cho thực phẩm bị nhiễm
độc gây ngộ độc cấp tính hoặc mạn tính cho ngƣời sử dụng (Zhou et al., 2011).
Trên thế giới, hàng năm có khoảng 26 triệu trƣờng hợp bị ngộ độc (không tử vong)
thuốc bảo vệ thực vật (Richter, 2002), 750 nghìn trƣờng hợp ngộ độc mạn tính, 3
triệu trƣờng hợp phải nhập viện và 200 nghìn trƣờng hợp tử vong (Hart, Pimentel,
2002). Ở Việt Nam, khoảng 15-20 triệu ngƣời thƣờng xuyên phơi nhiễm với thuốc
bảo vệ thực vật (Đại học Quốc gia Hà Nội, 2009). Theo báo cáo của Cục Y tế dự
phòng và Môi trƣờng - Bộ Y tế, năm 2009 có 4515 trƣờng hợp bị nhiễm độc thuốc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bảo vệ thực vật trong đó có 138 trƣờng hợp tử vong (Cục Y Tế Dự Phòng Và Môi
Trƣờng – Bộ Y Tế, 2009). Con số trên mới chỉ là kết quả thống kê đƣợc đối với các

hƣởng nhiều bởi các điều kiện ngoại cảnh, nhƣng với các ƣu điểm vƣợt trội so với
hóa chất tổng hợp về độ thân thiện với môi trƣờng, hệ sinh thái và sức khỏe con
ngƣời, các chế phẩm sinh học ngày càng đƣợc nhận đƣợc nhiều sự quan tâm trong
nghiên cứu và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp.
Biện pháp khác
Đồng thời với việc áp dụng 2 biện pháp trên có thể áp dụng kết hợp với một
số biện pháp trong quá trình sản xuất nhƣ các biện pháp canh tác: áp dụng biện pháp
luân canh cây trồng, các kỹ thuật trồng trọt. Kết hợp với biện pháp cơ học và lí học:
xử lí đất, phơi đất, xử lí hạt giống và đất bằng nhiệt, nhổ bỏ bỏ cây bệnh… Áp dụng
quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) nhằm đem lại hiệu quả phòng trừ bệnh hại hiệu quả
nhất.
1.2 Vi khuẩn Pseudomonas
1.2.1 Khái quát về vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas là chi của Grammaproteobacteria, thuộc họ
Pseudomonadaceae có 191 loài đã đƣợc mô tả (Baltch, Smith, 1995). A
B
Hình 1.3. Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp. ĐA3.1 trên đĩa thạch (A) và hình
thái tế bào (B)
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình
que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Có kích thƣớc 0,5-1 x 1,5-5 μm, có
khả năng chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao.
Tính chất nuôi cấy: Pseudomonas mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy
thông thƣờng, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 37°C nhƣng phát triển đƣợc ở nhiệt độ 5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- 42°C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhƣng phát triển đƣợc ở pH 4,5 - 9,0. Trên môi
trƣờng đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi. Có xu

Mỗi năm, bệnh nấm gây thiệt hại mùa màng trên thế giới đã lên đến hàng
trăm triệu dollar mặc dù đã sử dụng thuốc sát trùng (Farr et al., 1989). Những vấn
đề về môi trƣờng và sự phát triển ức chế thuốc ở các nấm bệnh đã làm giảm hiệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

quả của các loại thuốc diệt nấm. Do vậy các chất ức chế nấm do các vi sinh vật đất
sản sinh ra là một nguồn thuốc sinh học mới, an toàn đầy tiềm năng. Do những
nguyên nhân này và các nguyên nhân khác mà ngƣời ta quan tâm đặc biệt tới kiểm
soát sinh học (nghĩa là sử dụng các vi sinh vật tự nhiên hoặc các sản phẩm của
chúng để hạn chế sự tấn công và gây hƣ hại bởi các mầm bệnh thực vật) (Andrews,
1992).
Vào thế kỷ 20, một số thuốc trừ sâu, dựa trên các phân tử biocidal, là công cụ
chủ yếu để tăng sản lƣợng và chất lƣợng thực phẩm và sản phẩm sợi. Do các vấn đề
về sức khỏe và môi trƣờng nên việc sử dụng nhiều hợp chất hóa học đã gây ra tranh
cãi và cần khẩn cấp các chất thay thế chúng. Ngoài việc tự ức chế của cây ngũ cốc,
chủ yếu là các biện pháp kiểm soát sinh học khác dựa vào toàn bộ cơ thể ức chế sâu
bọ tự nhiên. Một số cách tiếp cận khác về hoạt chất sinh học đƣợc thử nghiệm và số
chế phẩm chủng thƣơng mại tăng lên. Tuy nhiên, vẫn còn đòi hỏi nhiều về công
nghệ sinh học để có thể thay thế thuốc hóa học. Hiện nay chúng chƣa thể so sánh
đƣợc với các thuốc sát trùng hóa học do hiệu quả, thị trƣờng và các yếu tố khác,
nhƣng chúng vẫn có một tƣơng lai hứa hẹn cho việc sử dụng các chế phẩm sinh học
(Gerhardson, 2002).
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho rằng các chủng vi khuẩn Pseudomonas
sp. đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh cây trồng (Kommedahl,
Chang-Mew, 1975; Cook, Rovira, 1976; Howell, Stipanovic, 1980; Henkes et al.,
2011). Hiệu quả của một vi sinh vật kiểm soát sinh học trong nhà kính và trên đồng
ruộng phụ thuộc vào sự sinh tổng hợp một hay nhiều chất đối ức chế sinh trƣởng
nấm (Handelsman, Stabb, 1996). Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp nhiều loại
ức chế sinh khác nhau nhƣ phenazine (Thomashow, Weller, 1988; Yang et al.,
2007; Pal'chykovs'ka et al., 2008), 2,4-diacetylphloroglucinol (Fenton et al., 1992;

(Gupta et al., 2001).
Chủng P. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và
syringotoxin, có các đặc tính chống nấm tiềm năng. Syringomycin là các
lipodepsipeptide nhỏ và trong số các peptide ức chế nấm vi khuẩn tiềm năng đã
đƣợc phát hiện ra. Syringomycin-E (SE) là peptide phổ biến nhất. SE diệt nấm A.
flavus, A. fumigatus, A. niger, F. moniliforme và F. oxysporum, có giá trị LD95 là
7,8 μg/ml đối với A. flavus và các giá trị LD95 với 1,9 μg/ml đối với các chủng nấm
khác (Segre et al., 1989; De Lucca et al., 1999).
Theo công bố của Makarand và cộng sự (2007) cho thấy chủng P.
aeruginosa sinh tổng hợp phenazine-1-cacboxylic acid có khả năng ức chế nấm A.
niger NCIM 1025, F. oxysporum NCIM 1008, S. rolfsii NCIM 1084, C. falcatum
NCIM. Có giá trị MIC với nấm S. rolfsii NCIM 1084 ở nồng độ 29 μg/ml. Ở nồng
độ 50μg/ml ức chế nấm F. oxysporum NCIM 1008 đạt 95% (Makarand et al.,
2007).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Henkes và cộng sự (2011) công bố chủng P. fluorescens CHAO có khả năng
ức chế hiệu quả với F. graminearum gây bệnh trên cây lúa mạch (Henkes et al.,
2011). Năm 2012, Seema và cộng sự công bố chủng P. aeriginosa SD12 có khả
năng sinh tổng hợp 1-hydrophenazine ức chế mạnh với nấm R. solani (Seema et al.,
2012).
1.2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm sinh học kiểm soát nấm
bệnh tại Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây
đã đƣợc quan tâm và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nƣớc trong những
năm vừa qua nhƣ ở Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện
KH&CNVN), Viện Bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT), Viện Thổ nhƣỡng và Nông
hóa (Bộ NN&PTNT), Đại học Nông Lâm Tp HCM, Đại học Cần Thơ.
Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật nhƣ Trichoderma (Trần Thị
Thuần, 1997; Đào Kiều Dung, 1999; Nguyễn Kim Vân, 2003; Trần Thị Thuần et

gốc từ trong đất đã đƣợc phát triển trên cơ sở sử dụng hỗn hợp các chủng P.
fluorescens, P. chlororaphis và chủng B. pumilus tại Phòng vi sinh vật học đất,
Viện CNSH. Chế phẩm đã đƣợc khảo nghiệm trên diện hẹp trong điều kiện in vivo
tại Viện bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT); kết qủa cho thấy chế phẩm Antiforhis
cho hiệu quả giảm bệnh gần bằng hoặc tƣơng đƣơng các hóa chất diệt nấm, tuỳ theo
từng chất. Kết qủa khảo nghiệm trên đồng ruộng cũng cho thấy, việc tƣới chế phẩm
Antiforhis đều có tác dụng làm giảm tỷ lệ cây con và cây trồng bị chết do bệnh thối
rễ trên cây dƣa ăn qủa các loại, cây cải bắp, cây cà chua và cây ớt ngọt (Nguyễn
Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh, 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 Chủng giống
Bộ chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas do Phòng Vi sinh vật đất, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam cung cấp. Chủng E. coli DH5α
(Invitrongen, Mỹ) đƣợc sử dụng để nhân plasmid.
Chủng nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani do phòng Bệnh cây,
Viện bảo vệ thực vật cung cấp.
2.2 Hóa chất
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: agarose
từ Rockland (Mỹ), chloroform, ethanol, methanol, ethylacetat, n-hexan của Merck
(Đức); Ethidium bromide, pJET1.2/blunt (Fermentas, Litva), T4 ligase, Taq
polymerase, proteinase K, RNase, enzyme giới hạn của Fermentas (Litva), mồi 16S
của Invitrogen (Mỹ), ampicillin của Mekopha (Việt Nam).
Các hóa chất khác để pha môi trƣờng: Peptone của Merck; cao nấm men,
glucose, glycerol của Difco (Mỹ), MgSO
4
, KH

(FF); 60% (v/v) glycerol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar): 20 (g/l) khoai tây, đun sôi cách
thủy 2 giờ thu dịch chiết; 20 (g/l) glucose, 20 (g/l) agar.
Môi trường LB (Luria-Bertani): 10 (g/l) peptone; 5 (g/l) cao nấm men, 10
(g/l) NaCl; pH 7,5. Môi trƣờng thạch LB đƣợc bổ sung 20 (g/l) agar.
Môi trường KB (King’s B): 10 (g/l) peptone; 10 (g/l) glycerol; 0,5 (g/l)
MgSO
4
; 0,5 (g/l) KH
2
PO
4
; pH 7,0-7,5.
2.3 Thiết bị
Các thiết bị đƣợc sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện
Công nghệ sinh học, Viện KH&CN Việt Nam (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng
Tên thiết bị
Hãng sản xuất
Bể ổn nhiệt
Trung Quốc
Box cấy LB-1234
Việt Nam
Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ)
Việt Nam
Cân phân tích AB 240
Sartorius (Thụy Sỹ)