1

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA HÓA

Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học
KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ
XÁC ĐỊNH NITRAT, NITRIT TRONG THỰC PHẨM
CHẾ BIẾN
Nguyễn Thị Hoa
Khóa 2008 – 2012
Huế, 5/2012
1 ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA HÓA
Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Văn Ly đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Qua đây, tôi xin cảm ơn các thầy cô trong tổ Hóa Vô Cơ – Phân
Tích, các thầy cô trong khoa Hóa – trường Đại Học Khoa Học Huế,
các bạn Hóa K32 đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Do thời gian làm khóa luận có hạn và lần đầu tiên tiếp xúc với
công tác nghiên cứu nên không tránh khỏi những sai sót. Vậy kính
mong quý thầy cô và các bạn bè tham khảo, đóng góp ý kiến để tôi
thành công hơn nữa trong các lĩnh vực nghiên cứu sau này.
Xin chân thành cảm ơn.

ii

TÓM TẮT

Xã hội ngày một văn minh, đời sống con người ngày càng phát triển. Do vậy,
đánh giá chất lượng thực phẩm là một trong những vấn đề mà con người luôn quan
tâm.
Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng cao, đã ra đời nhiều phương pháp để
xác định hàm lượng nitrat, nitrit trong mẫu thực phẩm. Tuy nhiên phương pháp trắc
quang là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc kiểm soát chất lượng thực
phẩm nói chung, thực phẩm chế biến nói riêng vì phương pháp này có thể định lượng
nhanh chóng với độ chính xác cao.
Vì vậy, trong bản khóa luận này chúng tôi đã nghiên cứu qui trình xác định

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviatin)
UV-Vis : Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (Ultraviolet Visible
Spectrometry)
iv

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn i
Tóm tắt ii
Danh mục các từ viết tắt iii
Mục lục iv
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Phụ gia thực phẩm 2
1.1.1. Vai trò của phụ gia thực phẩm 3
1.1.2. Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khoẻ con người 3
1.2. Ảnh hưởng nitrat, nitrit lên sức khỏe con người 4
1.3. Tính chất của nitrat, nitrit 5
1.3.1. Tính chất của nitrat 5
1.3.2. Tính chất của nitrit 6
1.4. Các phương pháp phân tích nitrat, nitrit 7
1.4.1. Các phương pháp phân tích nitrat 7
1.4.2. Phương pháp phân tích nitrit 9
1.4.3. Các phương pháp xác định đồng thời nitrat, nitrit 10
1.5. Các phương pháp xử lý mẫu thực phẩm 11
1.5.1. Kỹ thuật vô cơ hóa ướt 11
1.5.2. Kỹ thuật vô cơ hóa khô 12
1.5.3. Kỹ thuật vô cơ hóa khô ướt kết hợp 12

biến 37
3.7. Xác định nitrit, nitrat trong mẫu thật……………………………………… 39
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
4.1. Kết luận 40
4.2. Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41
vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng 22
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu diazo vào
nồng độ axit sunfanilic 24
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch các hợp chất màu diazo vào
nồng độ α-naphthylamin 26
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch hợp chất màu diazo theo pH 27
Bảng 3.4. Sự thay đổi độ hấp thụ quang ở pH khác nhau với cột khử Cd-Cu 29
Bảng 3.5. Sự thay đổi độ hấp thụ quang ở pH khác nhau với hỗn hợp huyền phù kẽm
+ dung dịch CdSO
4
30
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrit
và phương trình đường chuẩn xác định nitrit 30
Bảng 3.7. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch màu diazo vào nồng độ nitrat
và phương trình đường chuẩn xác định nitrat 32
Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của nitrit, nitrat 33
Bảng 3.9. Sự thay đổi độ hấp thụ quang khi cố định nồng độ nitrit 33
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý mẫu đến độ hấp thụ quang 35
Bảng 3.11. Giá trị độ hấp thụ quang tính sự mất mát nitrit qua quá trình xử lý mẫu 36
Bảng 3.12. Kết quả hàm lượng nitrat, nitrit trong Xúc xích bò ViSan 39

đời sống hàng ngày của mỗi gia đình vì nó tiết kiệm thời gian và tiền bạc cho thực đơn
bữa ăn gia đình. Nhưng điều đáng lo ngại nhất là chất lượng của thực phẩm chế biến
(hàm lượng chất bảo quản, phụ gia thực phẩm) mà người sản xuất đưa vào với mục
đích giữ gìn và kéo dài thời gian sử dụng của các loại thực phẩm. Một trong số đó là
nitrit, nitrat (muối diêm) là một dạng muối được xếp vào nhóm chất bảo quản có chức
năng ổn định màu, ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây độc.Tuy nhiên nếu dùng
các muối này để chế biến, bảo quản không đúng qui định thì sẽ là mối đe dọa cho sức
khỏe con người. Vì thế, việc xác định hàm lượng nitrat, nitrit trong thực phẩm chế biến
là rất cần thiết nhằm đảm bảo sự an toàn cho người tiêu dùng.
Trong bản khóa luận này chúng tôi nghiên cứu qui trình xác định nitrat, nitrit
trong các mẫu thực phẩm chế biến dựa trên cơ sở phản ứng tạo hợp chất diazo của
nitrit với axit sunfanilic và α-napthylamin. Phương pháp này có một số ưu điểm như
độ nhạy của phương pháp cao, ít bị ảnh hưởng của các chất cản trở, có thể thực hiện ở
các phòng thí nghiệm trang bị đơn giản.
Hiện nay có nhiều nghiên cứu xác định nitrat, nitrit tuy nhiên chưa có nhiều
nghiên cứu xác định nitrat, nitrit trên thực phẩm chế biến một cách đầy đủ. Vì vậy,
mục tiêu của chúng tôi là nghiên cứu xác định nitrat, nitrit trong các mẫu thực phẩm
chế biến bằng phương pháp trắc quang.Và với bất kỳ phương pháp nào thì việc nghiên
cứu khảo sát các điều kiện thích hợp để phương pháp cho kết quả chính xác nhất vẫn
là nhiệm vụ quan trọng nhất.
2

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Phụ gia thực phẩm [4]
Theo FAO: Phụ gia là chất không dinh dưỡng được thêm vào các sản phẩm với
các ý định khác nhau. Thông thường các chất này có hàm lượng thấp dùng để cải thiện
tính chất cảm quan, cấu trúc, mùi vị cũng như bảo quản sản phẩm.
Theo WHO: Phụ gia là một chất khác hơn là thực phẩm hiện diện trong thực
phẩm là kết quả của một số mặt: sản xuất, chế biến, bao gói, tồn trữ Các chất này

- Làm thay đổi bề ngoài của thực phẩm: Nhằm giúp cho thực phẩm hấp dẫn hơn
Ví dụ: Chất nhũ hóa lecithin ở sữa, lòng đỏ trứng, đậu nành làm món ăn có độ ẩm,
không khô cứng. Chất làm bột nở như muối bicarbonat, natri phosphat được dùng khi
làm bánh nướng, bánh mì để làm cho bánh mềm, xốp hơn
- Làm tăng mùi vị và sức hấp dẫn của thực phẩm: Một số chất màu có công
dụng làm cho thực phẩm có vẻ ngoài hấp dẫn hơn hoặc phục hồi màu sắc nguyên thủy
của thực phẩm; duy trì hương vị vitamin dễ bị phân hủy vì ánh sáng; tạo cho thực
phẩm có dáng vẻ đặc trưng, dễ phân biệt.
1.1.2. Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khoẻ con người [2]
Hiện nay, việc tìm hiểu sự ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khởe
con người vẫn là một vấn đề phức tạp. Vì lợi ích, những nhà kinh doanh cổ vũ mạnh
mẽ việc sử dụng hóa chất và họ thường tài trợ cho các cơ sở nghiên cứu để thực hiện
những công trình nghiên cứu có lợi cho sản xuất. Nói chung các triệu chứng thường
thấy thuộc vào loại phản ứng dị ứng với một số chất phụ gia như: ngứa ngáy, da nổi
đỏ, nhức đầu, đau bụng, chóng mặt, khó thở vv. Một vài thí dụ như:
 Nhóm sulfite: Có thể gây khó thở, những người bị hen suyễn không nên ăn
thực phẩm có chứa sulfite. Sulfite được trộn trong rau quả, quả khô (như nho khô)
hoặc đông lạnh, các loại nước giải khát, trong tôm tép đóng hộp để cho tươi hơn và
cũng tìm thấy trong các loại xốt cà chua
4

 Nhóm nitrit và nitrat (muối diêm): Có khả năng gây ung thư khi chuyển
thành nitrosamin lúc chiên nướng. Các chất này rất hữu hiệu trong việc ngăn cản sự
phát triển và diệt vi khuẩn, đặc biệt là khuẩn clostridium botulinum trong đồ hộp.
Ngoài tác dụng giúp bảo quản tốt, nitrit và nitrat còn tạo cho thịt có màu hồng tươi rất
hấp dẫn. Thịt nguội, jăm - bông, thịt hun khói, xúc xích đều có chứa nitrit và nitrat.
 Bột ngọt (MSG – monosodium glutamate): Có người không hợp với bột ngọt
nên cảm thấy khó chịu trong người, chóng mặt, nhức đầu, khô miệng, nóng ran ở
mặt, Tuy nhiên, các triệu chứng trên chỉ tồn tại trong một khoảng thời gian ngắn.
 Đường hóa học E951 – Aspartame: Người không hợp với chất aspartame

2
, nếu duy trì lâu sẽ dẫn tới tử vong, phản ứng: [11]
2HbFe
2+
(O
2
) + NO
2
-
+ H
2
O → 2HbFe
3+
+ 2OH
-
+ NO
3
-
+ O
2

Nồng độ nitrit cao hơn 100 mg NO
3
-
/L khi vào dạ dày, tại đây pH thấp nitrit được
chuyển thành axit nitrơ có khả năng phản ứng được với amin hoặc amit sinh ra
5

nitrosamine – đây là hợp chất gây ung thư, mối quan hệ này chỉ mới được thử nghiệm
trên động vật và chưa được kiểm chứng trên người [11].

3
= 2 NaNO
2
+ O
2

Nitrat của những kim loại từ Magie đến đồng, khi đun nóng bị phân hủy thành
oxyt, nitơ dioxyt và oxy.
Ví dụ: 2 Pb(NO
3
)
2
= 2 PbO + 4 NO
2
+ O
2

Nitrat của những kim loại kém hoạt động hơn đồng, khi đun nóng bị phân hủy
đến kim loại.
Ví dụ: Hg(NO
3
)
2
= Hg + 2 NO
2
+ O
2

6


] + NH
3

1.3.2. Tính chất của nitrit [6]
1.3.2.1. Tính chất vật lý
Nitrit là muối của axit nitrơ. Hầu hết muối nitrit dễ tan trong nước, muối ít tan
là AgNO
2
. Cũng như muối nitrat, đa số muối nitrit không có màu.
1.3.2.2. Tính chất hóa học
Nitrit của kim loại kiềm bền với nhiệt, chúng không phân huỷ khi nóng chảy
mà chỉ phân huỷ trên 500
o
C. Nitrit của các kim loại khác kém bền hơn, bị phân huỷ
khi đun nóng, chẳng hạn như AgNO
2
phân huỷ ở 140
o
C, Hg(NO
2
)
2
ở 75
o
C.
Trong môi trường axit, muối nitrit có tính oxy hóa và tính khử như axit nitrơ.
Muối nitrit oxy hóa được axit HI đến I
2
, dung dịch SO
2

.
Ví dụ: 2 KMnO
4
+ 3 H
2
SO
4
+ 5 HNO
2
= 2 MnSO
4
+ 5 HNO
3
+ K
2
SO
4
+ 3 H
2
O
Muối NaNO
2
được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp hóa học, nhất là trong
công nghiệp sản xuất phẩm nhuộm azo.
7

1.4. Các phương pháp phân tích nitrat, nitrit
1.4.1. Các phương pháp phân tích nitrat
1.4.1.1. Phương pháp khử bằng Zn [13]
Cơ sở của phương pháp: Ion NO

bị khử về NO
2
-
khi cho mẫu chảy qua cột
chứa Cd kim loại, sau đó NO
2
-
được xác định khi cho tác dụng với hỗn hợp thuốc thử
axit sunfanilic và α-naphthylamin tạo hợp chất azo màu đỏ. Đo độ hấp thụ quang ở
bước sóng λ = 540 nm.
Khoảng nồng độ giới hạn: 0,01 ÷ 1,0 mg NO
3
-
-

N/L.
1.4.1.3. Phương pháp đo thế dùng điện cực chọn lọc ion [3]
Cơ sở của phương pháp: Tách ion NO
3
-
ra khỏi mẫu thực vật bằng dung dịch
phèn nhôm kali 1% (với tỷ lệ mẫu/dung dịch = 1/5). Sau đó xác định NO
3
-
trong dung
dịch nhờ điện cực chọn lọc ion.
Nguyên lý của phương pháp là đo thế điện cực chọn lọc ion, mà giá trị thế phụ
thuộc vào nồng độ ion xác định trong dung dịch. Điện cực bạc clorua bão hòa được sử
dụng như điện cực so sánh.
Phương pháp này không áp dụng được nếu lượng Cl

2
-
thành N
2

để loại ảnh hưởng của nitrit.
Giới hạn phát hiện: 50 µg NO
3
-
- N/L.
1.4.1.5. Phương pháp Natri salixilat [9]
Cơ sở của phương pháp: Đo mật độ quang dung dịch có màu vàng dạng p –
nitrosalixylat ở bước sóng 420 nm. Đây là hợp chất được tạo thành giữa nitrat và natri
salixilat trong môi trường axit.
O
3
N
COONa
OH
H
+
+ NO
3
-
COONa
OH
(p-nitrosalixylat)

Phương pháp không bị ảnh hưởng bởi nitrit (≤ 2 mg/L), clorua (≤ 200 mg/L),
sắt (≤ 5 mg/L).

2
O
C
6
H
2
(OH)(NO
2
)
3
+ NH
3
= C
6
H
2
(NO
2
)
2
ONH
4

Độ hấp thụ đo ở bước sóng λ = 410 nm.
Độ nhạy của phương pháp: 10
-3
mg NO
3
-
- N/L.

Phản ứng tạo thành hợp chất màu diazo như sau:

+ 2H
2
O
HO
3
S
N
N
+ NO
2
-
+ 2H
+
HO
3
S
NH
2

+ H
+
NH
2
N=N
HO

diazonium;
+ Một số ion Sb, Fe, Pb, Ag, có trong mẫu sẽ kết tủa, gây cản trở phép đo
quang.
1.4.3. Các phương pháp xác định đồng thời nitrat, nitrit
1.4.3.1. Phương pháp dùng axit sunfanilic và α-naphthylamin [7]
Nitrit ở trong mẫu được xác định bằng cách cho tác dụng với hỗn hợp axit
sunfanilic và α-naphthylamin, phản ứng tạo ra hợp chất diazo màu đỏ. Sau đó đo độ
hấp thụ quang ở bước sóng λ = 540 nm.
Tổng nitrat, nitrit trong mẫu được xác định bằng cách cho thêm dung dịch
EDTA và đệm amoni. Sau đó cho chảy qua cột khử Cd-Cu. Ở đây nitrat bị khử về
nitrit, sau đó nitrit được xác định bằng phương pháp quang phổ như trên.
Độ thu hồi của phương pháp: 95 ÷ 105 %.
Giới hạn áp dụng phương pháp: 0,01 ÷ 1,0 mg NO
3
-
- N/L.
1.4.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12]
Phương pháp này dựa trên việc tách nitrat, nitrit trên cột tách và được xác định
bằng detectơ UV. Hỗn hợp pha động là octyl amonium orthophotphat 0,01M +
metanol theo tỷ lệ 30% (thể tích/thể tích) ở pH = 7, tốc độ bơm pha động là 0,8
mL/phút, thời gian phân tích cho một mẫu là 10 phút.
Đường chuẩn xác định nitrat, nitrit xây dựng trong khoảng 0,1 ÷ 100 µg/mL có
hệ số tương quan r = 0,999.
Độ thu hồi của phương pháp: 96,6 ÷ 105,7%.
11

1.4.3.3. Xác định nitrat, nitrit trong mẫu sinh học bằng phương pháp quang phổ bơm
mẫu dòng chảy [14]
Phương pháp này được thực hiện trên hệ thống bơm mẫu dòng chảy hai kênh:
+ Kênh thứ nhất chứa dung dịch chất mang gồm EDTA trong dung dịch đệm

SO
4
), hay ba axit (HNO
3
+ H
2
SO
4
+
HClO
4
) để phân hủy mẫu trong bình Kendan hay ống nghiệm được đun nóng. Lượng
axit thường gấp 15 - 20 lần lượng mẫu và còn tùy thuộc vào loại mẫu. Thời gian hòa
tan mẫu trong các hệ hở, bình Kendan thường vài giờ đến vài chục giờ, cũng tùy thuộc
vào loại mẫu, cỡ mẫu, bản chất của các chất cần xác định,
Trong quá trình xử lý này các nguyên tố kim loại ở dạng các hợp chất cơ kim của
mẫu rau quả sẽ bị oxy hóa, đốt cháy các chất hữu cơ, đưa các kim loại về các muối vô
cơ tan trong dung dịch nước, quá trình hóa học chính là:
Mẫu + HNO
3
+ H
2
SO
4
= CO
2
+ H
2
O + Me
n

Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn), dùng chất phụ gia là 8 mL H
2
SO
4
45% và 2 g KNO
3
. Lấy 5 g
mẫu vào chén nung thạch anh, thêm chất phụ gia, trộn đều, sấy khô cẩn thận cho mẫu
khô và thành than đen, sau đó đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 440-450
0
C, rồi sau đó ở
550-530
0
C, đến khi hết than đen, được tro mẫu trắng. Sau đó hòa tan tro thu được
trong 15 mL dung dịch HCl 18%, đun nhẹ cho mẫu tan hết rồi định mức thanh 25 mL
bằng dung dịch HCl 2%.
1.5.3. Kỹ thuật vô cơ hóa khô ướt kết hợp
Vì là xử lý khô ướt kết hợp là kế tiếp nhau, trước tiên xử lý ướt sơ bộ, sau đó
mới nung, nên tính chất và diễn biến của nó cũng tương tự như trong hai kiểu đã đề
cập ở trên, chỉ có khác là sau khi xử lý mẫu không phải đuổi lượng axit dư quá nhiều
13

như trong xử lý ướt. Sau khi xử lý ướt ta đem nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ
triệt để hơn xử lý ướt. Phương pháp này hạn chế được mất chất phân tích của một số
kim loại khi nung.
Ví dụ: Xử lý mẫu sữa để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd, Co,Cr, Cu,
Fe,Mn, Ni, Pb, Zn). Lấy 5 g mẫu vào chén nung, thêm 15 mL HNO
3
65%, 2 mL H
2

: độ hấp thụ quang của chất tại bước sóng λ
ε
λ
: hệ số hấp thụ của chất tại bước sóng λ
l : chiều dày cuvet đựng mẫu (cm)
C : nồng độ của cấu tử (mol/L)
Điều kiện sử dụng định luật:
+ Chùm tia sáng đơn sắc
+ Dung dịch phải loãng, trong suốt
+ Chất phân tích phải bền và bền dưới tác dụng của tia UV – VIS
14

1.6.2. Phân tích định lượng
1.6.2.1. Phương pháp đường chuẩn
+ Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác, tăng dần nhất định
C
x1
, C
x2
, C
x3
, C
x4
, của chất chuẩn cần phân tích.
+ Đo độ hấp thụ quang A
x1
, A
x2
, A
x3

15

C
C
x
C
x
+ C
1
C
x
+ C
2
C
x
+ C
n

A
A
x
A
x+1
A
x+2
A
x+nVẽ đường thêm chuẩn A – C được dạng đường như sau

-4
M và ngược lại. Lập đồ thị độ hấp thụ quang phụ thuộc vào sự
thay đổi đó rồi chọn ra tỷ lệ nồng độ thích hợp nhất.
b. Môi trường pH tối ưu
Tiến hành lên màu dung dịch chuẩn nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic
và α-naphthylamin, sau đó đo độ hấp thụ quang tại môi trường pH khác nhau để chọn
ra được pH thích hợp cho phản ứng tạo màu diazo.
c. Thời gian ổn định màu
Tiến hành lên màu dung dịch chuẩn nitrit với hỗn hợp thuốc thử axit sunfanilic
và α-naphthylamin, sau đó đo độ hấp thụ quang tại bước sóng hấp thụ cực đại (λ = 540
nm) liên tục trong 35 phút (mỗi lần đo cách 30 giây), để chọn thời gian ổn định màu
thích hợp cho phương pháp.
2.1.1.2. Khảo sát điều kiện khử từ nitrat qua nitrit
a. Chọn phương pháp khử
Thực hiện phản ứng khử nitrat bằng hai phương pháp: Cột khử Cd-Cu và hỗn hợp
huyền phù kẽm + dung dịch CdSO
4
rồi so sánh hiệu suất khử ở hai phương pháp này.