TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN BAN ĐẦU ĐỂ XÂY
DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN
THỦY TIÊN TÍM (DENDROBIUM AMABILE)
SẠCH VIRUS
SVTH: TRẦN THỊ LỆ THỦY
MSSV: 60604409
CBHD: ThS.NGUYỄN XUÂN DŨNG
KS.NGUYỄN PHÚC TRƯỜNG
TT CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP.HCM
TP HỒ CHÍ MINH 1/2011
iii
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn,
giúp đỡ, động viên của gia đình, thầy cô, các anh hướng dẫn. Xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất đến:
Thạc sĩ Nguyễn Xuân Dũng – Phó trưởng phòng Công nghệ Sinh học Thực vật,
Trung tâm công nghệ sinh học Tp.HCM – đã đồng ý cho tôi thực hiện đề tài này tại
phòng thực vật trung tâm công nghệ sinh học Tp.HCM, anh đã rất tận tình giúp đỡ,
góp ý và động viên tôi trong quá trình làm việc.
Kỹ sư Nguyễn Phúc Trường – nhân viên phòng CNSH Thực vật, Trung tâm
công nghệ sinh học Tp.HCM – đã hướng dẫn tận tình giúp tôi quen dần với môi trường
làm việc ở đây và luôn theo sát chỉ bảo tôi.
Các anh chị kỹ thuật viên của trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể
sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.
Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM
cùng các thầy cô của trường đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập.
Bố mẹ và em tôi luôn sát cánh, động viên tinh thần, giúp đỡ về mặt tái chính để

DANH MỤC HÌNH ix
Chương 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Yêu cầu đề tài 2
1.3. Nội dung thực hiện 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về giống lan Dendrobium 3
2.1.1 Phân loại 3
2.1.2 Phân bố 3
2.1.3 Đặc điểm hình thái 3
2.1.4 Đặc điểm sinh thái 4
2.2. Sơ lược về lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) 5
2.2.1 Đặc điểm hình thái 5
2.2.2 Đặc điểm sinh thái 6
2.2.3 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng sự phát triển của thủy tiên tím 6
2.3. Giới thiệu tổng quan về virus 7
2.3.1 Cách gọi tên virus 7
2.3.2 Thành phần cấu tạo 8
2.3.3 Phương thức sinh sản và lan truyền 9
2.4. Sơ lược về virus thực vật 9
2.5. Sơ lược về virus gây bệnh trên lan 10
2.5.1 Cymbidium mosaic virus (CyMV) 10
2.5.2 Odontoglossum ringspot virus (ORSV) 12
2.6. Sơ lược về phương pháp RT-PCR 15
2.7. Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô 16
vi
2.7.1 Vài nét về kỹ thuật nuôi cấy mô 16
2.7.2 Các giai đoạn của nhân giống in vitro 17
2.7.3 Những thuận lợi và khó khăn của kỹ thuật nhân giống in vitro 17
2.7.4 Một số phương pháp nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 18

BAP Benzylaminopurine
cDNA Complementary Deoxynucleotide Acid
CĐHST Chất điều hòa sinh trưởng
cs cộng sự
Strep Kháng sinh Streptomycin
CyMV Cymbidium Mosaic Virus
DAI Days After Inoculation
NAA Naphthalene acetic acid
ORSV Odotoglossum Ringspot Virus
PCR Polymerase Chain Reaction
PLB Protocorm-like body
RNA Ribose Nucleotide Acid
RT Reverse Transcription
TAE Tris-acetate-EDTA
TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1: Các thành phần phản ứng multiplex RT – PCR 25
Bảng 3. 2: Chu kỳ nhiệt của phản ứng multiplex RT - PCR 25
Bảng 3. 3: Các nồng độ Ca(OCl)
2
không kết hợp kháng sinh 26
Bảng 3. 4: Các nồng độ Ca(OCl)
2
kết hợp kháng sinh 27
Bảng 4. 1: Tỉ lệ sống vô trùng sau 7 ngày nuôi cấy chồi bên từ cây lan Thủy tiên tím. 29
Bảng 4. 2: Tỉ lệ sống vô trùng sau 7 ngày nuôi cấy chồi bên cô lập từ cây lan Thủy
tiên tím. 30
Bảng 4. 3: Tỉ lệ sống vô trùng của chồi bên cô lập từ thân Thủy tiên tím với các nồng
độ Ca(OCl)

Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) là một trong những giống lan rừng đặc
hữu của Việt Nam (Trần Hợp,1998). Đây là giống lan rừng có dáng hoa rất đặc biệt,
hoa to, đẹp, màu sắc nhã nhặn, có mùi thơm dễ chịu lại rất lâu tàn. Tuy nhiên, hiện nay
đang được liệt vào danh sách những giống lan quý hiếm, mức độ đe dọa bậc R. Vì vậy
vấn đề bảo tồn nguồn gen giống lan này là vấn đề đang được quan tâm.
Thông thường có 2 cách để bảo tồn nguồn gen lan là lưu trữ thông qua nhân
giống In vivo và In vitro. Phương pháp nhân giống In vivo thường không đạt hiệu quả
cao trên lan do đặc điểm sinh thái đặc biệt, chịu sự chi phối của các yếu tố tự nhiên,
gây khó khăn cho vấn đề quản lý và chăm sóc bộ sưu tập. Trái lại, việc nhân giống In
vitro phát huy được nhiều ưu điểm như không phụ thuộc vào các yếu tố tự nhiên, dễ
dàng kiểm soát, chăm sóc và sử dụng được cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau.
Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm trên thì phương pháp In vitro vẫn có nhược điểm
là không loại trừ được bệnh virus, một trong những loại bệnh gây hại nghiêm trọng
trên hoa lan nói chung.
Để giải quyết những vấn đề trên, đề tài: “ Khảo sát các điều kiện ban đầu để xây
dựng quy trình nhân giống In vitro cây lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) sạch
bệnh virus được thực hiện nhằm mục đích phục vụ cho việc bảo tồn nguồn gen và
cung cấp cây giống chất lượng cao của giống lan này cho sản xuất.
Chương 1: Mở đầu
2
1.2. Yêu cầu đề tài
Khảo sát và đưa ra được một số điều kiện cần thiết cho việc xây dựng quy trình
nhân giống In vitro cây lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile) sạch bệnh
(Cymbidium mosaic virus, Odotoglossum ringspot virus).
1.3. Nội dung thực hiện
Bao gồm 4 nội dung chính:
Kiểm tra, thanh lọc để tạo nguồn mẫu lan sạch virus bằng kỹ thuật RT-PCR.
Khảo sát loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp cho việc

2.1.3 Đặc điểm hình thái
Dendrobium thuộc nhóm đa thân (hay còn gọi là nhóm hợp trục), mọc bụi,
giả hành thường rất dài, lá mọc xen kẽ nhau ôm lấy giả hành, lá có bẹ thuôn dài ôm
Chương 2: Tổng quan tài liệu
4
lấy thân. Hình dạng lá rất đa dạng, từ hình xoan đến hình kim, dạng lá mềm mại,
mọng nước, nạc, dai, có màu xanh đậm hay nhạt tùy vị trí sống của cây (Dương
Công Kiên, 2006).
Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ giúp cho Dendrobium thích hợp với
nhiều điều kiện sống khác nhau. Rễ mập hay mảnh mai, thân rễ dài hay ngắn, bò đi
xa hay chụm lại thành búi dài. Rễ vừa có nhiệm vụ giúp cây bám chắc chắn vào giá
thể vừa có vòi hút ẩm từ không khí và hút chất dinh dưỡng từ xác thực vật khác
(Dương Công Kiên, 2006).
Hoa Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các
mắt ngủ giữa lá và thân ở vị trí gần ngọn. Hoa mọc thành chùm đơn hoặc kép hoặc
từng hoa một. Mặt khác, số lượng phát hoa trên cây nhiều và cấu trúc hoa của
giống Dendrobium phong phú và hấp dẫn về màu sắc và cấu tạo (Dương Công
Kiên, 2006).
Quả dạng nang, khi quả chín hoặc vỏ nang bị mục thì hạt mới phát tán ra
ngoài. Một quả chứa từ 10.000 – 100.000 hạt, có kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa
phân hóa. Cho nên nhân giống bằng phương pháp gieo hạt in vivo rất khó khăn,
không như các loại thực vật khác (Dương Công Kiên, 2006).
2.1.4 Đặc điểm sinh thái
Giống Dendrobium có hoa lâu tàn, trung bình từ 1 đến 2 tháng. Một số loài
hoa nở quanh năm. Ở một số khác thuộc giống Dendrobium cây trút hết lá trước
khi ra hoa. Các phát hoa không những mọc trên giả hành mới mà cũng có thể mọc
lên từ các giả hành củ đã ra hoa trước đó.
Nguồn khai thác Dendrobium ở Việt Nam chủ yếu là từ rừng. Rừng Việt
Nam có nhiều loại Dendrobium đẹp, trữ lượng cao. Do trên thân Dendrobium có
nhiều mắt ngủ nên có thể nhân giống bằng phương pháp chiết tách, phương pháp

nở vào cuối mùa xuân và có mùi thơm (Sách đỏ Việt Nam, 1996).
Chương 2: Tổng quan tài liệu
6
Hình 2. 1: Cây lan Thủy tiên tím nở hoa.
2.2.2 Đặc điểm sinh thái
Đây là loài thuộc giống Dendrobium ra hoa nhưng không rụng lá. Hoa
thường nở vào tháng 5 hoặc tháng 6. Phát hoa lên ở gần đỉnh của thân còn lá. Tái
sinh lan Thủy tiên tím bằng hạt và bằng chồi (Sách đỏ Việt Nam, 1996 - trang
325). Nếu tái sinh bằng hạt trong điều kiện tự nhiên phải công sinh với nấm tương
thích, hoặc gieo hạt không có nấm cộng sinh trong điều kiện vô trùng trong phòng
thí nghiệm .
2.2.3 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng sự phát triển của thủy tiên tím
a) Ánh sáng
Là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và khả năng ra hoa của cây. Thủy tiên
tím là loài lan ưa sáng, có thể sinh trưởng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay
ánh sáng khuếch tán khoảng 70%. Ánh sáng yếu cường độ quang hợp giảm khi đó
cây sẽ thiếu dinh dưỡng, mảnh khảnh, lá mỏng, hoa nhỏ hoặc không có hoa, trái
lại, ánh sáng quá cao lại gây bỏng lá và cây sẽ bị cháy.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
7
b) Nhiệt độ
Thuộc loài thích hợp với khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiệt độ thích
hợp cho sự sinh trưởng của cây từ 27 – 32
o
C (ban ngày) và từ 16 -18
o
C (ban đêm).
Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm cho phép từ 6 – 9
o
C đối với những cây

8
Tên virus = tên cây chủ + Đặc điểm bệnh + virus
Ví dụ: Odontoglossum Ringspot Virus: virus này gây hại trên cây lan thuộc
chi Odontoglossum, lá cây bị bệnh có các vết bệnh đốm vòng.
Tobaco Mosaic Virus: virus gây hại trên cây thuốc lá, đặc điểm bênh
là gây khảm lá.
2.3.2 Thành phần cấu tạo
Virus là các thể nội kí sinh bắt buộc, không có cấu tạo tế bào. Cấu tạo virus
chỉ gồm hai phần căn bản: phần vỏ capsid và phần lõi.
a) Phần lõi: Bộ máy di truyền của virus có thể là DNA mạch kép, mạch
đơn; RNA mạch kép, mạch đơn. Bộ gen của virus thường là một phân tử
nucleotide acid dạng vòng tròn hay thẳng. Virus nhỏ nhất có khoảng 4 gen, virus
lớn nhất có khoảng vài trăm gen (Phạm Thành Hổ, 2003).
b) Vỏ protein (capsid): Bao bọc bộ gen là vỏ capsid có dạng hình que,
hình ống xoắn, hình đa diện hay phức tạp. Chúng không có hệ sinh tổng hợp
protein riêng (không có ribisome); không có hệ thống biến dưỡng riêng, do đó
chúng chỉ biểu hiện các gen và sinh sản bên trong một tế bào sống khác. Nhờ sự
trao đổi chất của tế bào chủ để tạo ra nhiều bản sao các protein của các cấu phần
khác (capsid, cổ, bao đuôi…).
Chức năng của capsid: Bảo vệ nucleic acid của virus tránh sự tác động của
các enzyme. Đồng thời, các tác dụng nhận biết là lắp khớp vào điểm nhận trên bề
mặt tế bào chủ trong giai đoạn xâm nhập.
c) Màng bao (envelop): Nhiều virus còn có lớp vỏ glycoprotein bao bọc
bên ngoài capsid. Lớp vỏ này bắt nguồn từ màng của tế bào chủ, nhưng ngoài
phospholipid và protein của tế bào chủ, chúng còn có thêm protein và glycoprotein
nguồn gốc virus. Cho nên còn được gọi là lớp màng “lai tạo” (Nguyễn Bá Tiếp,
2007).
Chương 2: Tổng quan tài liệu
9
2.3.3 Phương thức sinh sản và lan truyền

10
2.5. Sơ lược về virus gây bệnh trên lan
Bệnh virus trên lan được biết đến sớm nhất vào những năm 1960. Có ít nhất
25 loại virus gây bệnh đã được đề cập, trong đó Cymbidium mosaic virus và
Odontoglossum ringspot virus là 2 loại phổ biến nhất. Cả hai loại đều gây ảnh
hưởng trên nhiều giống lan nhưng Cymbidium mosaic virus phổ biến hơn (Zettler
và cs, 1990; Flynn, 1996). Hai loài virus này gây ảnh hưởng lớn đến giá trị kinh tế
của phong lan (Robert và cs, 2006).
2.5.1 Cymbidium mosaic virus (CyMV)
Là virus thuộc nhóm IV ssRNA (+), giống Potexvirus, họ Flexividae hay còn
gọi là virus khảm vàng, được mô tả đầu tiên bởi Jensen. Phần tử virus có dạng sợi,
không màng bao, dài 480nm, rộng 13nm (Navalinskiene và cs, 2005) (hình 2.2).
Bộ gen chứa RNA mạch đơn, sợi dương, có chiều dài 6227 nucleotide
không tính đuôi polyA ở đầu tận cùng 3’(Wong và cs, 1997). Có mũ chụp ở đầu 5’
và đuôi polyA ở đầu 3’. Tổ chức bộ gen được bảo tồn cao và bao gồm 3 vùng:
RdRp (RNA-dependent RNA polymerase-RNA polymerase phụ thuộc RNA), TGB
(triple gene block- nhóm gen ức chế bộ ba) và CP (coat protein-protein vỏ). Tương
tự như các virus khác trong nhóm Potexvirus, bộ gen của CyMV có 5 khung đọc
Hình 2. 2: Hình dạng của virus
CyMV (Navalinskiene và cs, 2005).
Chương 2: Tổng quan tài liệu
11
mở (OREs 1-5) mã hóa cho ba loại protein khác nhau: RdRp (RNA-deppendent
RNA polymerase – trọng lượng phân tử 160Kda),TBG (triple gene block – trọng
lượng phân tử 26 Kda/13 Kda/ 10 Kda) và CP (protein vỏ - trọng lượng phân tử 24
Kda) (Wong và cs,1997).
Hình 2. 3: Sơ đồ miêu tả bộ gen của CyMV (Ajjikuttira và cs, 2003)
CyMV gây ra hiện tượng vàng lá thể khảm đi kèm sự hóa đen và chết của
những vùng lá dọc theo gân lá (Moran và Knoxfield, 1999). Cây bị nhiễm virus có
các đốm và vệt mô chết kéo dài, hóa màu nâu đến đen, rải rác trên cả hai mặt của

ORSV là virus gây bệnh đốm vòng vàng, được biết đến lần đầu tiên trên lá
lan Odontoglossum grande Lindl. Tuy nhiên, nó được biết phổ biến hơn với triệu
chứng vàng lá dạng hình thoi đặc trưng trên lá lan Cymbidium. Các đốm hình thoi
này cũng đi kèm với các vệt vàng ở Cymbidium (Moran và Knoxfield, 1999). Triệu
chứng vòng đơn hoặc các vòng tròn đồng tâm xuất hiện trên cả lá già lẫn lá non.
Những vòng này có màu sắc từ vàng nâu đến tía và đen, bao xung quang vùng
Chương 2: Tổng quan tài liệu
14
trung tâm có màu xanh sáng hoặc màu vàng. Những vòng hình tròn, hình thoi, đơn
hoặc đồng tâm này có thể chồng lên nhau tạo thành từng mảng, từng phần trên lá
và chính là nguyên nhân gây chết của chồi non và toàn bộ cây. Trên hoa, ORSV
tạo ra sự khảm màu (đậm, nhạt) (Marais, 2000; McMillian và cs, 2005). Tuy nhiên,
không nên nhầm lẫn sự khảm màu với các vệt màu trắng trên cây Cattleya có hoa
màu xanh nhạt pha đỏ do biến dị di truyền gây ra. Sự khảm màu này trước đây chỉ
có ở Cattleya nhưng hiện nay đã thấy xuất hiện ở nhiều giống lan khác nữa.
a) Biểu hiện biến màu của hoa Cattleya; b) Triệu chứng
đốm vòng trên lá lan Hồ điệp.
Triệu chứng biểu hiện có hai mức độ khác nhau do hai chủng virus riêng
biệt gây ra, đó là chủng nhẹ và chủng nặng. Các cây bị chủng nhẹ ít bị đốm trên
hoa hơn, hoa không bị biến dạng và lá có triệu chứng nhẹ hơn so với chủng nặng
(Universiy of Illinois, 1990).
Nói chung, virus gây ra một loạt các sự biến đổi bất thường trên lan, với các
triệu chứng thay đổi rất lớn trong các giống lan khác nhau bị nhiễm cùng một loại
virus. Các triệu chứng nổi bất nhất là lá vàng (mất diệp lục) và chết mô (hoại tử)
cũng như sự cằn cỗi của cây. Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt, kết hợp
với nhau hoặc hoàn toàn không biểu hiện do điều kiện nuôi trồng ngăn cản sự phát
Hình 2. 7: Triệu chứng của ORSV gây ra
a)
b)
Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Tổng quan tài liệu
16
phiên mã ngược các đoạn DNA dài dưới 600 base, còn những đoạn dài hơn phải
dùng mồi đặc hiệu mới đạt hiệu quả cao.
Có thể nói kỹ thuật RT-PCR là phương pháp nhạy nhất để phát hiện RNA
(Dharmaraj MS., 2008). Đây là phương pháp nghiên cứu các RNA tồn tại với hàm
lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phương pháp cổ điển như Northern
blot…
Có hai kiểu thực hiện RT – PCR: RT – PCR hai bước và RT – PCR một
bước.
Trong RT – PCR hai bước, giai đoạn RT tổng hợp cDNA được thực hiện
trước sau đó, cDNA được khuếch đại ở giai đoạn PCR trong một tube khác có chứa
PCR mix và mồi đặc hiệu. Nhược điểm của RT – PCR hai giai đoạn là nguy cơ
ngoại nhiễm cao do mở nắp tube PCR mix để cho sản phẩm cDNA vào sau giai
đoạn RT. Để hạn chế tình trạng này, có thể cho thêm dUTP và UNG vào phản ứng
PCR (Phạm Hùng Vân, 2009).
Trong RT – PCR một bước, cả hai giai đoạn RT và PCR được thực hiện cùng
một phản ứng. Để thực hiện RT – PCR một bước, trong tube phản ứng phải có đủ các
thành phần hóa học cần thiết cho cả hai giai đoạn. RT – PCR một bước thường được
sử dụng hơn RT – PCR hai bước vì nó tiện lợi và tránh được nguy cơ ngoại nhiễm.
Toàn bộ cDNA tạo ra được tham gia phản ứng PCR sau đó và không nhất thiết phải có
mồi riêng cho giai đoạn RT vì nó sử dụng chính mồi của giai đoạn PCR. Tuy nhiên,
trong RT – PCR một bước không thể ứng dụng kỹ thuật cho dUTP và enzyme UNG
vào dung dịch phản ứng vì UNG sẽ cắt bỏ toàn bộ cDNA tổng hợp được trong giai
đoạn RT.
2.7. Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô
2.7.1 Vài nét về kỹ thuật nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô là một thuật ngữ chung được dùng chỉ một dãy quy trình để
duy trì, nuôi tế bào (callus, tế bào, protoplasts) và cơ quan thực vật (thân, rễ, phôi)
trong điều kiện vô trùng. Phương pháp nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng vào

lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.