TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“Nghiên cứu, xác định mối quan hệ
giữa kiểu gene Halothane và chất lượng tinh dịch
một số lợn đực giống nuôi tại Thái Nguyên ”
Giáo viên hướng dẫn : ThS. Ngô Thành Trung
ThS. Nguyễn Quốc Trung
TS. Ngô Thị Kim Cúc
Sinh viên thực hiện : Đào Văn Hoàng
Lớp : CNSHA - K55
“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu
cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học"
HÀ NỘI – 2013
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản
thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các cá nhân,
tập thể và đơn vị khác.
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy - ThS.
Ngô Thành Trung, bộ môn Công nghệ sinh học Động vật; thầy - ThS. Nguyễn Quốc
Trung, phó trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Phân tử và Ứng dụng, trường Đại
học Nông nghiệp Hà Nội; cô – TS. Ngô Thị Kim Cúc, trưởng bộ môn Di truyền
giống vật nuôi, Viện Chăn nuôi Quốc gia đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ
bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo và các cán bộ bộ môn Công
nghệ sinh học Động vật, khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông nghiệp Hà

2.2.1 Hình thái và cấu tạo tinh trùng 5
2.2.2 Quá trình hình thành tinh trùng 7
2.3 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch lợn 9
2.3.1 Thể tích tinh dịch 9
2.3.2 Hoạt lực tinh trùng 9
2.3.3 Nồng độ tinh trùng 10
2.3.4 Độ pH của tinh dịch 10
2.3.5 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 10
2.3.6 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác 10
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch và tinh trùng lợn 11
2.4.1 Giống 11
2.4.2 Tuổi của lợn đực 11
2.4.3 Các yếu tố thời tiết, khí hậu 11
2.4.4 Trạng thái sức khỏe của lợn đực giống 11
2.4.5 Tần suất khai thác 12
2.4.6 Ảnh hưởng của một số gene 12
2.4.7 Chế độ dinh dưỡng 12
2.5 Tổng quan về gene Halothane trên lợn 13
2.5.1 Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng thịt 19
2.5.2 Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng tinh dịch 20
2.5.3 Ảnh hưởng của gene Halothane đến sức sinh sản 21
2.5.4 Tác động tích cực của kiểu gene Halothane 21
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
3.1 Vật liệu nghiên cứu 23
3.1.1 Đối tượng 23
3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 23
3.2 Nội dung nghiên cứu 24
3.3 Phương pháp nghiên cứu 24
3.3.1 Phương pháp xác định pH của tinh dịch 24
3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng 24

Bảng 4.2. Giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn nghiên cứu 33
Bảng 4.3. Giá trị trung bình thể tích tinh dịch của 3 giống nghiên cứu 34
Bảng 4.4. Giá trị trung bình hoạt lực tinh trùng của 3 giống nghiên cứu 36
Bảng 4.5. Giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu 38
Bảng 4.6. Giá trị trung bình kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu 39
Bảng 4.7. Giá trị trung bình sức kháng tinh trùng của 3 giống nghiên cứu 41
Bảng 4.8. Giá trị trung bình VAC của 3 giống nghiên cứu 42
Bảng 4.9. Bảng giá trị OD các mẫu DNA ở bước sóng 260 nm 44
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu tạo tinh trùng lợn 7
Hình 2.2. Sơ đồ quá trình sinh 8
tinh trùng 8
Hình 2.3. Sơ đồ cơ chế điều hòa 8
nội tiết quá trình sinh tinh 8
Hình 2.4. Trình tự một đoạn của gene Halothane 14
Hình 2.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane 15
(N. Stanisic và cs, 2012) 15
Hình 2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme HhaI 15
(N. Stanisic và cs, 2012) 15
Hình 2.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane với DNA được tách
chiết theo phương pháp 2 16
Hình 2.8. Hình ảnh điện di sản phầm PCR sau khi ủ với Enzyme CfoI 17
(Reginaldo Gaspar Bastos và cs (2000) [34]) 17
Hình 2.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme BsiHKAI 18
Hình 2.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme Hin PI 19
Hình 2.11. Hình ảnh thịt PSE và DFD 20
Hình3.1. Buồng đếm Thoma 25
Hình 3.2. Vùng đếm tinh trùng 25
Hình 3.3. Cách đếm tinh trùng 25

dd Dung dịch
EDTA Etylendiamine tetra acetic acid
TE Tris.HCl/EDTA
TAE Tris.HCl/Axit Axetic/EDTA
DNA Deoxy nucleic acid
NST Nhiễm sắc thể
LH Luteinizing hormone
FSH Follicle-stimulating hormone
GH Hormone sinh trưởng
TNNT Thụ tinh nhân tạo
Nu Nucleotide
ryr1 rynodine receptor
PCR Polymerase Chain Reaction
RE Restriction Enzyme (Enzyme cắt giới hạn)
U Unit (đơn vị)
PSE pale, soft, exudative (nhạt màu, mềm, rỉ dịch)
DFD dark, firm, dry (sậm màu, cứng, khô)
HN Halothane Negative
HP Halothane Positive
GTTB Giá trị trung bình
SD Standard deviation
TÓM TẮT BÁO CÁO
Nghiên cứu nhằm đánh giá, so sánh ảnh hưởng của yếu tố giống (Piétrain
thuần, Landrace thuần và PiDu) đến chất lượng tinh dịch của 1 số lợn đực thí
nghiệm nuôi tại Trạm truyền giống gia súc - Trung tâm giống vật nuôi Thái
Nguyên, xã Hóa Thượng, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Trên cơ sở đó, tiếp
vi
tục đánh giá ảnh hưởng của kiểu gene Halothane tới chất lượng tinh dịch của các
lợn đực thí nghiệm thuộc các giống trên.
Thí nghiệm 1 – Đánh giá ảnh hưởng của nhân tố giống đến chất lượng tinh

bằng enzyme giới hạn để kiểm tra kiểu gene. Cần phải có thí nghiệm tiếp theo để
xác định nguyên nhân và thực hiện thành công quy trình xác định kiểu gene
Halothane của lợn từ mẫu gốc lông.
viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Chăn nuôi lợn trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đóng vai trò
hết sức quan trọng trong hệ thống chăn nuôi. Lợn là loài gia súc được nuôi nhiều và
cung cấp lượng thực phẩm lớn nhất cho con người. Theo số liệu thống kê ngày
01/04/2013 của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, cả nước có khoảng 26.98
triệu con lợn, tăng 1.08% so với cùng kỳ năm 2012 [1]. Đến năm 2011, Việt Nam
đứng thứ tư trên thế giới về tổng số đàn lợn nái, sau Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazil và
đứng thứ hai châu Á về sản xuất thịt lợn.
Để có được những con số ấn tượng đó, ngoài những giống lợn nhập nội, một
phần đóng góp không nhỏ là do chúng ta đã sử dụng lợn đực ngoại hoặc lợn lai 2, 3,
4 và 5 máu (như lai hai máu PiDu) để cải thiện đặc tính di truyền của đàn lợn trong
nước. Các giống lợn này tạo ra tổ hợp mang ưu thế lai cao, đáp ứng được năng suất,
chất lượng thịt và hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi.
Trong cùng điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng, công tác thú y giống nhau thì có
nhiều yếu tố như: giống, nhiệt độ, độ ẩm, kiểu gene… gây hưởng đến khả năng sản
xuất và chất lượng tinh dịch. Trong đó, hai yếu tố giống và kiểu gene mà lợn mang có
ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng tinh dịch. Trong đó, Halothane là gene gây ảnh
hưởng, đã và đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu.
Hiện nay, ở Việt Nam ngành chăn nuôi đang ngày càng phát triển, các trung
tâm, công ty, trại giống đều có đàn lợn giống với quy mô khá lớn. Tuy nhiên, nguồn
giống hiện nay rất đa dạng và thường không được xác định kiểu gene Halothane. Vì
vậy, việc ứng dụng phương pháp xác định kiểu gene Halothane chính xác sẽ làm
tăng hiệu quả sản xuất, nâng cao thu nhập cho người chăn nuôi.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
xác định mối quan hệ giữa kiểu gene Halothane và chất lượng tinh dịch một số

- Giai đoạn thứ 1 tiết ra 10 - 20 ml dịch trong suốt không có tinh trùng, đây gọi
là tinh thanh. Chất này có tác dụng rửa đường niệu sinh dục.
- Giai đoạn thứ 2 kéo dài khoảng 1 - 2 phút, tiết ra khoảng 100 - 120 ml, chất
này gồm tinh trùng và các chất phân tiết của các tuyến sinh dục như tiền liệt,
Cowper, tinh nang.
- Giai đoạn thứ 3 là giai đoạn bài tiết chủ yếu của các tuyến sinh dục phụ (150
- 200 ml). Số lượng tinh trùng ở giai đoạn này ít, giai đoạn này kéo dài khoảng 4 - 5
phút.
Đặc điểm của tinh dịch lợn
Đặc điểm chung
Theo Milovanov (1972) [42], tinh dịch có ba đặc điểm chung :
+ Tinh dịch là dịch tiết của cơ quan sinh dục đực khi con đực thực hiện có
kết quả phản xạ sinh dục.
+ Tinh dịch được hình thành một cách tức thời khi con đực phóng tinh, nghĩa
là lúc nó hưng phấn cao nhất trong quá trình thực hiện phản xạ giao phối.
+ Tinh dịch gồm hai thành phần cơ bản là tinh trùng và tinh thanh.
Tinh trùng là tế bào sinh dục đực, là yếu tố chính làm cho lợn nái có thể thụ
thai. Ở lợn, tinh trùng trong tinh dịch chỉ chiếm 2 - 7% (Ogiuwn f.v, 1977; Levin
K.L,1980) [8].
Tinh thanh là chất tiết của các tuyến sinh dục phụ. Ở các loài gia súc khác
nhau các tuyến này phát triển không giống nhau. Ở lợn, tuyến tinh nang và tuyến
Cowper bài tiết nhiều, cho nên tinh dịch lợn thường nghèo fructose.
Các đặc tính của tinh dịch lợn [12]
3
+ Tỷ trọng
Trong tinh dịch, tỷ trọng tinh trùng nặng hơn tinh thanh nên tỷ trọng tinh
dịch thường chịu ảnh hưởng của số lượng tinh trùng có trong tinh dịch. Trong một
mẫu tinh nếu tỷ trọng càng cao thì nồng độ tinh trùng càng đậm đặc. Tỷ trọng tinh
dịch lợn thường là 1,020 - 1,022.
+ Độ nhớt của tinh dịch

Lipid 0,03 0,15 0,04
Fructose 0,01 0,23 - 0,87 0,005
Acid Citric 0,13 0,72 0,06
Acid Lactic 0,02 0,04 - 0,06 0,03
P tổng số 0,06 0,08 0,02
K 0,10 0,23 0,07
Na 0,28 0,28 0,07
Ca 0,09 0,02
Cl 0,33 0,22 0,48
+ Các enzyme trong tinh dịch
Trong tinh dịch có nhiều loại enzyme như: hyaluronidase, mucidase,
catalase, lipase, amynase, photphotase…, tất cả các enzyme này đều tham gia vào
quá trình sống và hoạt động của tinh trùng. Trong đó, hyaluronidase là enzyme
được tiết ra từ thể đỉnh của tinh trùng, giúp phá vỡ liên kết giữa các tế bào cumulus
bao quanh trứng, giúp cho tinh trùng thụ tinh được với trứng.
2.2 Hình thái, cấu tạo tinh trùng và quá trình sinh tinh ở lợn
2.2.1 Hình thái và cấu tạo tinh trùng
Tinh trùng gia súc nói chung có dạng con nòng nọc. Chiều dài đầu gần gấp
đôi chiều rộng, bề dày không đáng kể, do đó đầu có dạng một tấm bầu dục. Trông
thẳng đầu có hình quả trứng, trông nghiêng đầu có hình tấm hơi cong.
Tinh trùng là một tế bào đơn bội, gồm 3 phần: đầu, cổ thân và đuôi.
Đầu tinh trùng có hình bầu dục, bao gồm nhân và acrosome. Nhân chiếm
87% thể tích của đầu, là nơi chứa thông tin di truyền. Hai phần ba mặt ngoài phía
trước của đầu tinh trùng được bao bọc bởi một "mũ" dày gọi là acrosome hình thành
từ bộ máy Golgi. Acrosome là một loại lysosome đặc biệt, chứa các enzyme tương
tự như các enzyme có mặt trong các lysosome của các tế bào sinh dưỡng. Trong đó,
5
hyaluronidase là enzyme có khả năng phân giải protein. Những enzyme này đóng
vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của tinh trùng vào trứng lúc thụ tinh.
Cổ thân là phần rất ngắn, hơi eo lại, cắm vào hốc ở đáy phía sau của nhân.

trùng.
7
+ Nhân tế bào thu nhỏ lại và biến thành đầu tinh trùng, phần lớn tế bào chất dồn
về một phía tạo thành cổ thân. Một số thể Golgi tập trung ở đầu mút phía trước của
tiền tinh trùng tạo thành acrosome.
+ Các ty thể chuyển tới vùng cổ thân, phần lớn các tế bào chất biến đi chỉ còn
lại một lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi.
+ Quá trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dưỡng Sertoli trong lòng ống sinh
tinh, trong khoảng thời gian 14 - 15 ngày. Sau đó, chúng trở thành tinh trùng non và
rơi vào ống sinh tinh, được đẩy về phía phụ dịch hoàn.
- Giai đoạn phát dục: ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát dục và thành
thục. Trong quá trình di chuyển từ đây đến cuối dịch hoàn phụ, tinh trùng phải di
chuyển với đoạn đường khá dài khoảng trên 100m nằm uốn khúc quanh co. Trong
quá trình này nhiều tinh trùng non bị phân hủy.
Các chất nội tiết liên quan đến quá trình sinh tinh bao gồm GH, FSH, LH,
Testosterone và Inhibin.
Hình 2.2. Sơ đồ quá trình sinh
tinh trùng
Hình 2.3. Sơ đồ cơ chế điều hòa
nội tiết quá trình sinh tinh
8
2.3 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch lợn
2.3.1 Thể tích tinh dịch
Thể tích tinh dịch (V - ml) là số ml tinh dịch sau khi lọc bỏ keo phèn trong
một lần thực hiện thành công phản xạ xuất tinh. Thể tích tinh dịch phụ thuộc vào
các yếu tố: giống, kiểu gene, độ tuổi, cá thể, kỹ thuật khai thác tinh, tần suất lấy tinh
và mùa vụ lấy tinh Trong tinh dịch lợn có chứa một lượng khá lớn hạt thể selatin,
chiếm tỷ lệ 20 - 30% lượng tinh dịch, chúng là sản phẩm của tuyến Cowper. Khi
xuất tinh, những hạt thể selatin gặp enzyme vegikinase của tuyến tinh nang rồi đọng
lại thành những tinh thể lớn hơn. Sau đó, các thể này hấp phụ nước và tăng lên về

tinh trùng hoạt động yếu, thời gian sống kéo dài. Ngược lại, pH của tinh dịch kiềm
tính thì tinh trùng hoạt động mạnh, thời gian sống bị rút ngắn.
Theo Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đại (1996) [7], pH tinh dịch lợn có
tính kiềm yếu (7.2 - 7.5).
2.3.5 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K - %) là số tinh trùng có hình dạng bất thường so
với tổng số tinh trùng đếm được trong quá trình kiểm tra. Có hai thời kỳ có thể gây
nên tình trạng kỳ hình ở tinh trùng:
- Kỳ hình ngay trong quá trình sinh tinh - tinh trùng kỳ hình sơ cấp, bắt
nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý ở cơ quan sinh tinh.
- Sau khi tinh trùng được bài tiết ra - tinh trùng kỳ hình thứ cấp, bắt nguồn từ
nguyên nhân có liên quan đến ngoại cảnh hoặc kỹ thuật không đúng trong khâu xử
lý tinh dịch.
2.3.6 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác
Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác (V.A.C - tỷ tinh
trùng/lần) là một trong các chỉ tiêu quan trọng có liên quan chặt chẽ với sức sống
tinh trùng và số liều tinh dịch có thể sản xuất được. Chỉ tiêu này dùng để đánh giá
khái quát chất lượng tinh dịch và năng lực sản xuất tinh trùng của một đực giống.
Chỉ tiêu này là tích số của V (ml), A (%), C (triệu/ml). V.A.C càng cao thì sức sản
xuất tinh trùng và chất lượng tinh dịch càng tốt. Ví dụ: V.A.C đối với lợn đực giống
từ 30 tỷ trở lên; đối với bò đực từ 4 tỷ trở lên; đối với trâu đực từ 3 tỷ trở lên là tốt
(Trần Tiến Dũng và cs, 2002) [13].
10
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch và tinh trùng lợn
2.4.1 Giống
Các giống khác nhau có phẩm chất tinh dịch khác nhau. Lợn đực nội có
phẩm chất tinh dịch thấp hơn nhiều so với giống lợn ngoại. Các giống lợn nội như:
Móng Cái, Mường Khương chỉ đạt 1 - 6 tỷ tinh trùng tiến thẳng (V.A.C) trong một
lần xuất tinh, trong khi đó các giống lợn ngoại nuôi tại Việt Nam như Yorkshire,
Landrace, Duroc trắng thì tổng số tinh trùng tiến thẳng đạt từ 16 đến 90 tỷ trong

Trái lại, khi sử dụng ít quá, lợn có cơ hội tích lũy các chất dinh dưỡng dưới dạng
mỡ, gây nên hiện tượng béo và tích mỡ dưới da, dẫn tới phản xạ kém và chất lượng
tinh kém. Do vậy, sử dụng lợn đực giống nên đúng và thích hợp với từng cá thể.
Đối với lợn ngoại tần suất khai thác thích hợp nhất là 2 lần/tuần.
2.4.6 Ảnh hưởng của một số gene
Ở lợn đực giống, có 1 số gene có ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng tinh
dịch, ví dụ như gene Halothane. Ở gene Halothane, khi gene này tồn tại ở trạng thái
đồng hợp trội (NN) thì có thể tích tinh dịch trên 1 lần khai thác (V-ml), hoạt lực tinh
trùng (A-%), nồng độ tinh trùng (C-triệu/ml), tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C)
và pH cao hơn khi lợn ở trạng thái dị hợp (Nn) (Hà Xuân Bộ và cs, 2011)[2]. Đỗ
Đức Lực và cs (2013) [4] cũng đã kết luận rằng lợn mang kiểu gene NN có thể tích
tinh dịch, hoạt lực tinh trùng cao hơn lợn mang kiểu gene Nn.
2.4.7 Chế độ dinh dưỡng
Muốn cho lợn đực giống sản xuất nhiều tinh dịch với phẩm chất tốt thì điều
quan trọng nhất là phải cung cấp cho lợn đực giống đầy đủ dinh dưỡng (protein,
khoáng và vitamin).
Protein rất quan trọng trong dinh dưỡng của lợn đực giống, khi thiếu protein
hoặc protein có chất lượng không tốt sẽ làm cho phẩm chất tinh dịch kém, ảnh
hưởng xấu tới đời con, giảm sức khỏe đực giống, sớm bị loại thải. Do vậy, việc
cung cấp protein cần chú ý cân đối các axit amin không thay thế.
Audet và cs (2004) [15] đã nghiên cứu thấy việc bổ sung vitamin có thể tác
động đến hiệu suất sinh tinh của lợn đực giống, đặc biệt trong khoảng thời gian
stress gây ra do tần suất khai thác tinh dịch cao. Vitamin quan trọng nhất là vitamin
A, D, E.
12
Vitamin A cần thiết cho sự sinh trưởng, sinh sản và kháng bệnh. Nếu thiếu
vitamin A thì tinh hoàn có thể bị teo, ống dẫn tinh bị thoái hóa gây cản trở cho sự
sản sinh tinh trùng, làm tinh dịch ít có tinh trùng hoặc tinh trùng có hoạt lực yếu.
Vitamin D có vai trò tham gia vào quá trình chuyển hóa canxi và phospho.
Nếu khẩu phần thiếu vitamin D sẽ làm ảnh hưởng đến hấp thu canxi, photpho của

- Lông được rửa với cồn 90%, sau đó rửa sạch với nước cất khử trùng
- Làm khô lông, sau đó cắt gốc lông với độ dài 0.5 cm, bỏ vào ống Eppendorf
1.5ml
- Bổ sung thêm 500 µl 5% Chelex 100 và ủ ở 56
0
C trong 60 phút
- Voltex ống Eppendorf, để trong bể ổn nhiệt ở 97
0
C trong 30 phút
- Giữ ống Eppendorf ở 4
0
C chờ tới khi PCR.
N. Stanisic và cs [33] sử dụng trình tự mồi chạy phản ứng PCR nhân gene
Halothane:
Mồi xuôi có trình tự: 5’GGAGGGTTCTAAGCTCTGGG3’
Mồi ngược có trình tự: 5’TGACCCCTAGGTGCTGGAT3’
Thành phần các hóa chất của quá trình PCR nhân gene Halothane (V= 20
µl) gồm:
+ 10X PCR Buffer: 2 µl
+ dNTP Mixture (2.5 pmol/µl): 0.6 µl
+ Mồi xuôi và mồi ngược (5 pmol/µl): 0.5 µl mỗi loại
+ DNA (25 ng/µl): 1.0 µl
+ rTaq (5U/µl): 0.2 µl
+ H
2
O:15.2 µl
N. Stanisic và cs [33] tiến hành PCR với chu trình nhiệt (kết quả nhân gen
thể hiện trong hình 2.5):
+ 94
0

0
C
- Sau đó, lấy 5µl dung dịch làm phản ứng PCR
Phương pháp 2 (Drissing và cs, 1996) [36]:
15
- Ủ 1 – 3 gốc lông ở nhiệt độ phòng (5 phút) trong dd 0.5 µl 0.1 M NaOH
- Thêm 4.5 µl 0.02M Tris.HCl (pH 7.4)
Tiến hành phản ứng PCR với thể tích 25 µl gồm các thành phần sau:
- dNTP: 200 µM
- PCR buffer: 2.5 µl
- MgCl2 1.5 mM
- Mồi: 0.2 µM mỗi mồi
+ Mồi xuôi: 5’-GTTCCCTGTGTGGCAATGGTG-3’
+ Mồi ngược: 5’-ATCTCTAGAGCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAAT-3’)
- Taq DNA poly-merase (CENBIOT/RS, UFRGS): 1U
- DNA extraction solution: 5µl
Tiến hành phản ứng PCR theo chu trình nhiệt:
+ 94
0
C – 4 phút
+ 94
0
C – 1 phút; 56
0
C – 1 phút; 72
0
C – 1 phút (30 chu kì)
+ 72
0
C – 7 phút