Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TCH DNG VÀ XC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN
cry1C M HA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CNH
VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP
TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Thái Nguyên - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu
và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công
trình nghiên cứu khác.

Tác giả luận văn Lê Thị Ngọc Thương

i
MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt iii
Danh mục các bảng iv
Danh mục các hình v
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới 3
1.1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam 5
1.2. Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7
1.2.1. Vị trí phân loại 7
1.2.2. Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8
1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9
1.3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10
1.3.1. Độc tố Cry 11
1.3.2. Độc tố Cyt 11
1.3.3. Độc tố Vip 12
1.3.4. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 12
1.3.5. Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể 14
1.4. Gen mã hóa protein độc tố tinh thể 16
1.4.1. Vị trí của các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17
1.4.2. Phân nhóm gen mã hóa độc tố 17
1.5. Tổng quan về dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai và gen cry1C 19

trên sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 40
3.1.4. Kết quả khuếch đại gen cry1C ở các chủng Bacillus thuringiensis
subsp. aizawai bằng phương pháp PCR 43
3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C 44
3.2.1. Tách dòng gen cry1C 44
3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1C 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii

DANH MỤC CC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT STT
Viết tắt
Viết đầy đủ
1
Amp
Ampicillin
2
bp
Base pair
3
Bt
Bacillus thuringiensis
4
Bta

Kilo Dalton
15
dH
2
O
Nước deion
16
cs
cộng sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
DANH MỤC CC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 37
Bảng 3.2. Kết quả phân loại dưới loài của các chủng Bt sinh tinh thể 39
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm 41
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta 42
sau 3 ngày thử nghiệm 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
DANH MỤC CC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS) 7


1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Thái Nguyên là tỉnh trung du miền núi phía Bắc, nông nghiệp chiếm tỷ
trọng lớn trong cơ cấu kinh tế. Cũng như nhiều vùng nông nghiệp khác, sâu
hại cây trồng, đặc biệt là các loài thuộc bộ Cánh vảy như sâu tơ (Plutella
xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)…là một trong những nhân
tố gây thiệt hại lớn tới năng suất và phẩm chất nông sản. Việc sử dụng thuốc
trừ sâu hóa học để diệt côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera) là biện pháp có
hiệu quả tức thời nhưng lại gây ra những tác hại rất lâu dài cho môi trường
sinh thái, đồng thời việc tồn dư thuốc trừ sâu trong nông sản gây ngộ độc cho
người và động vật, là những nguyên nhân khiến thuốc trừ sâu sinh học được
coi như một giải pháp hiệu quả để dần thay thế thuốc trừ sâu hóa học trong
nông nghiệp. Trên thị trường thuốc trừ sâu sinh học hiện nay, các chế phẩm
có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis chiếm thị phần gần như tuyệt
đối [8], [39].
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, trong giai đoạn sinh bào tử
có khả năng tạo ra các protein tinh thể gây độc một cách đặc hiệu với các côn trùng
thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Hai cánh (Diptera), bộ Cánh cứng
(Coleoptera) …. Các tinh thể là hỗn hợp của một hay nhiều loại protein thuộc 2
nhóm độc tố Cry và độc tố Cyt. Các độc tố có tính đặc hiệu với côn trùng đích
nhưng không gây độc cho người, động vật có xương sống, thực vật. Các độc tố tinh
thể được mã hóa bởi các gen cry nằm trên các plasmid [39].
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) là một trong 82 dưới loài của vi
khuẩn Bacillus thuringiensis, có khả năng sinh nhiều loại protein tinh thể có tác dụng
diệt côn trùng thuộc nhiều bộ khác nhau. Protein tinh thể độc Cry1C là một loại protein
do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ
Cánh vảy rất mạnh.
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới
Khả năng diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis đã được biết đến từ rất
lâu. Nhiều nghiên cứu còn cho rằng người Ai Cập cổ đã biết và sử dụng loại vi
khuẩn này để tiêu diệt nhiều côn trùng gây hại. Tuy nhiên Bacillus thuringiensis
mới chỉ được phân lập năm 1901 bởi Sigetane Ishiwata khi ông nghiên cứu bệnh
dâu tằm, gọi là bệnh “sotto”. Năm 1915, vi khuẩn này được mang tên Bacillus
thuringiensis do được phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringien của Đức [29].
Trải qua hơn 100 năm phát triển, lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis
đã trải qua nhiều dấu mốc quan trọng, tập trung vào một số hướng chính như:
Tìm kiếm và phát hiện các dưới loài Bacillus thuringiensis mới có khả năng
diệt côn trùng thuộc nhiều bộ côn trùng khác nhau, từ đó sản xuất các loại chế phẩm
sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
Năm 1930, Bacillus thuringiensis lần đầu được đưa vào thử nghiệm để chống
sâu đục thân ở ngô tại vùng Ostrinia Nubilalis ở châu Âu. Năm 1938, thuốc trừ sâu
sinh học Bt đầu tiên đã được bán trên thị trường Pháp. Năm 1957, công ty Sandoz
(Thụy Sĩ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với số lượng lớn từ Bacillus thuringiensis
var. kurstaki. Công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu Bt thực sự phát triển mạnh với
việc phát hiện thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 (1970)
và Bacillus thuringiensis var. israelensis diệt ấu trùng thuộc bộ Hai cánh (1977).
Năm 1983, Krieg và cs phát hiện dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis

thế giới, đồng thời liên kết với các trình tự công bố trên Gene Bank [36], [41], [42].
Những nghiên cứu về gen cry là cơ sở quan trọng cho công nghệ chuyển
gen, tạo ra hàng loạt các cây trồng biến đổi gen có mang gen Bacillus thuringiensis,
trong đó nhiều loại đã được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới. Năm 1985 các
gen cry1Ab và gen cry1Ac đã được chuyển thành công vào cây ngô và bông. Năm
1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất. Đến năm 2001,
tính riêng tại Mỹ, 26% tổng diện tích ngô, 69% tổng diện tích bông là giống cây 5
chuyển gen Bacillus thuringiensis. Năm 2005, ở Trung Quốc đã có 3,3 triệu ha
bông chuyển gen, đem lại nhiều lợi ích về kinh tế, môi trường, giảm thiểu việc sử
dụng thuốc trừ sâu hoá học [14], [29].
Tình hình dịch bệnh, sâu hại trong nông nghiệp diễn biến ngày càng phức tạp
với nhiều loại bệnh mới phát sinh, nhiều côn trùng biểu hiện kháng với các sản
phẩm Bacillus thuringiensis. Điều này đòi hỏi lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn
Bacillus thuringiensis phải có những thay đổi phù hợp. Dự báo trong những năm tới,
các nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis sẽ tập trung vào các vấn đề như:
- Nghiên cứu phát triển Bacillus thuringiensis thành một loại thuốc trừ sâu có
tác dụng bảo vệ kép (Dual control), vừa trừ sâu lại vừa chống bệnh cho cây trồng.
- Nghiên cứu sâu và có hệ thống hơn về cơ chế kháng của côn trùng với các
protein tinh thể độc tố của Bacillus thuringiensis, từ đó tạo ra các loại thuốc
Bacillus thuringiensis có độc lực mạnh hơn, cũng như khắc phục các loại chế phẩm
đã bị côn trùng kháng lại.
- Tiếp tục sàng lọc tuyển chọn thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis mới.
- Tiếp tục tách dòng và đọc trình tự các gen cry mới làm cơ sở phục vụ cho
công nghệ chuyển gen.
1.1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam
Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt
Nam được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác

Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng Bacillus
thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [2]. Năm
2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của
vi khuẩn Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được
22 dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [3], [13].
Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng
Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và
biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli
thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng [4]. 7
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào
cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ
cuối thế kỷ 20. Đã nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng có khả
năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông [7], [9], [12]. Năm 2003, Phan
Đình Pháp và cs đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng
súng bắn gen. Năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [15].
1.2. Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.2.1. Vị trí phân loại
Bacillus thuringiensis thuộc chi Bacillus, gồm hơn 20 loài khác nhau, trong
đó có nhiều loài rất quan trọng như Bacillus subtilis là nguồn cung cấp enzyme
trong công nghiệp, Bacillus cereus gây bệnh tiêu chảy và Bacillus anthracis, tác
nhân gây bệnh than. Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus hầu hết là Gram dương, có khả
năng tạo bào tử và thường sống trong đất [29], [49], [50].
Nhóm Bacillus cereus gồm có Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus
anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium. Khả năng sinh tinh thể là một đặc
điểm phân biệt Bacillus thuringiensis với các vi khuẩn khác thuộc nhóm Bacillus cereus
Hình 1.2. Phản ứng ngƣng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
với kháng nguyên lông roi H [6]
Tế bào vi khuẩn với
kháng nguyên bề mặt
Phân tử kháng thể với
2 vị trí liên kết đặc
hiệu.
Phản ứng ngưng kết. 9
1.2.3
Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.3.1. Đặc điểm hình thái
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, tế bào dạng hình que, kích
thước 0,8-1,4 μm × 2,5 - 10μm, có thể tồn tại riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô
hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc
trên bề mặt tế bào [24]. (hình 1.3).
Mỗi tế bào Bacillus thuringiensis khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử
và tinh thể độc diệt côn trùng (hình 1.3). Bào tử hình thành trong điều kiện bất lợi
như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng…khi gặp điều kiện thuận lợi,

năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa
0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà [49], [50].
Bacillus thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát
triển của Bacillus thuringiensis là pH = 7. Bacillus thuringiensis có khả năng oxy
hóa hydrocacbon đến acid hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden –
Meyerhoff – Panas [49], [50].
1.3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn Bacillus thuringiensis có
khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là độc tố Cry (Crystal δ
endotoxin), Cyt (Cytolytic) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein). Trong đó, độc
tố Cry và độc tố Cyt thuộc loại độc tố tinh thể. Dựa vào tính tương đồng của trình tự
acid min, các họ độc tố này lại được chia thành các lớp khác nhau. Ngoài 3 họ độc
tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một số độc tố khác như hemolysin,
enterotoxin, chitinase, phospholipase…[19], [20], [24], [35]. 11
1.3.1. Độc tố Cry
Đây là họ độc tố có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất, có bản chất là một
protein trong đó các amino acid như glutamic acid , asparaginic, chiếm trên 20% tổng
số amino acid trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân làm cho nội độc tố
có điểm đẳng điện thấp. Lượng cysteine nhỏ hơn 20% tổng số amino acid, quy định sự
không hòa tan của tinh thể, ngoài ra còn có các amino acid: arginine, threonine,
leucine, isoleucine. Xét về thành phần hóa học thì độc tố tinh thể chứa chủ yếu các
nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn,
Al, Cu, Mn, nguyên tố P hầu như không có [38], [26], [31].
Độc tố Cry không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong môi
trường có pH kiềm cao, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi đun nóng ở 65
0
C


Hình 1.8. Cây phân loại của hai họ độc tố Cyt và Vip [42]

1.3.4. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể
Kết quả nghiên cứu của Hofte và Whiteley về trình tự amino acid tương đồng
giữa các độc tố cho thấy có 5 “vùng” (block) amino acid bảo thủ có mặt ở hầu hết các
độc tố Cry. So sánh các đầu tận cùng C ở các trình tự với trên 1000 “residues” cho thấy
còn có thêm 3 block nằm ngoài nhân độc (trung tâm hoạt động) của các độc tố [26], [31].
Cấu trúc không gian của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật
nghiên cứu tinh thể bằng tia X với những nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và
Cry1Aa, sau đó được mở rộng cho các độc tố khác. Các protein tinh thể có cấu trúc
chung gồm 3 vùng (domain) riêng biệt:
Vùng I gồm 1 bó 7 chuỗi α, trong đó chuỗi α-5 nằm ở trung tâm được bao
quanh bởi 6 chuỗi còn lại. 6 chuỗi α này có tính lưỡng cực và đủ dài để bắc cầu
xuyên qua lớp kị nước dầy 30 Å của màng kép và tạo nên kênh trên màng. Để tạo 13
được lỗ rò xuyên qua màng tế bào, những chuỗi α bên ngoài phải biến đổi đảo
ngược để mặt kị nước của nó tiếp xúc lớp màng photpholipid trong khi mặt ưa nước
kết hợp với vùng II tạo ra một lỗ rò không có tính đặc hiệu. Một số nghiên cứu gần
đây phát hiện ra những vị trí amino acid rất quan trọng trong hoạt động của nội độc
tố. Khi bị mất Glu-129, Arg-131, Asp-136 của chuỗi α-4 thì Cry1Aa không còn độc
tính với côn trùng, trong khi mất Arg-127 và Asn-138 thì độc tính không hề bị ảnh

Hình 1.7. Mô hình cấu trúc chung của độc tố Cry [26]
1.3.5. Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể
Cơ chế tác động của protein tinh thể là nguyên nhân tạo nên tính đặc hiệu
của Bacillus thuringiensis cũng như các chế phẩm từ Bacillus thuringiensis với côn
trùng đích. Cơ chế tác động của các độc tố tinh thể có thể được chia thành 3 giai 15
đoạn: Quá trình hòa tan của tinh thể độc tố, quá trình hoạt hóa độc tố, cuối cùng là
quá trình tạo kênh, lỗ rò trên màng ruột giữa của côn trùng [26], [31].
Quá trình hòa tan tinh thể độc tố: Khi côn trùng ăn phải tinh thể độc, tinh thể
sẽ được hoà tan nhờ pH kiềm cao trong môi trường ruột giữa. Sự khác biệt về độ
hòa tan đôi khi cũng giải thích sự khác biệt về độc tính giữa các loại tinh thể độc
khác nhau. Sự giảm độ hòa tan cũng có thể là một trong những cơ chế của hiện
tượng kháng thuốc Bacillus thuringiensis ở côn trùng [26], [31].
Quá trình hoạt hóa độc tố: sau khi hòa tan, nhiều độc tố phải được hoạt hóa
bởi hệ enzyme protease của ruột giữa côn trùng để trở thành độc tố hoạt động. Phần
lớn protease ở côn trùng bộ Cánh vảy là dạng trypsin hoặc chymotrypsin. Cũng có
những dẫn chứng cho thấy DNA cũng có liên quan đến quá trình phân giải protein
tinh thể [26], [29], [31].
Quá trình tạo kênh , tạo lỗ rò : Độc tố Cry ở dạng hoạt hóa có 2 chức năng
chính là gắn với thụ thể và hoạt động tạo kênh ion.
Quá trình gắn của độc tố với thụ thể đặc hiệu gồm có 2 bước: gắn thuận
nghịch và không thuận nghịch. Bước thứ 2 được cho là có liên quan đến sự gắn chặt
của độc tố với thụ thể và sự chèn của độc tố vào màng ruột. Các độc tố Cry có thể
có thụ thể đặc hiệu khác nhau. Ở Manduea sexta, thụ thể của Cry1Ab là dạng
protein màng cadeherin có khối lượng phân tử khoảng 210 kDa, trong khi Cry1Ac
và Cry1C lại có thụ thể đặc hiệu là APN (aminopeptidase N) với khối lượng phân tử
lần lượt là 120 kDa và 106 kDa [26], [31], [36].


thủng biểu mô ruột giữa côn trùng [26], [30], [31].
1.4. Gen mã ha protein độc tố tinh thể
Năm 1982, Held và cs đã lần đầu tiên sử dụng chữ viết tắt cry từ chữ Crystal
(tinh thể) để đặt tên các gen tổng hợp protein tinh thể diệt sâu. Các chủng Bacillus
thuringiensis sinh tổng hợp 3 dạng độc tố đó là: Độc tố Cry (dạng chủ yếu – tinh thể
độc) được mã hóa bởi các gen cry, độc tố Cyt (độc tố phân huỷ tế bào) do gen cyt
mã hoá và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp.
Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể [11], [27].
Tinh thể
Tiêu hóa
Hòa tan tinh thể
Hoạt hóa độc tố
Tế bào ruột
giữa côn trùng
Độc tố gắn
với thụ thể
Độc tố chèn
vào màng và
tạo kênh, lỗ rò
Tế bào bị
chết

Trích đoạn Gen cry1C Sâu tơ (Plutella xylostella) Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) Phương pháp định lượng mật độ bào tử Phương pháp tách dòng gen cry1C

---