Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------
Nguyễn Ngọc Sơn
TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT
MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG
LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học (IBT)
Thái Nguyên - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1
LỜI CAM ĐOAN
công trình nghiên cứu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS.
Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán
bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp
đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực
nghiệm và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo
vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của
virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản
lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng
tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học
Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN,
các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều
kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 2
MỤC LỤC .............................................................................................................. 3
DANH MỤC T
Ừ
1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26
2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 27
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27
2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27
2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28
2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29
2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29
2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30
2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31
2.3.8. Tách chiết plasmit .............................................................................. 32
2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn............................................................. 32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 34
3.1. THIẾT KẾ MỒI.......................................................................................... 34
3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ................... 34
3.2.1. RT-PCR .............................................................................................. 34
3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ............. 37
3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR .................................. 37
3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen ............................... 39
3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG
GENOME CỦA RGSV ..................................................................................... 40
Coat protein/
Nucleocapsid Protein (Protein vỏ)
Đ/c Đối chứng
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
DEPC Diethyl pyroCarbonate
DNA Deoxyribonucleic acid
DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật),
http://www.dpvweb.net
EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên
kết với enzym)
g gram
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về
phân loại virus).
ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on
Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV),
http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk
IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside
IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế),
http://www.irri.org
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6
Kb Kilobase
LB Luria và Bertani
M Nồng độ mol/lit
ml mililitre
mm milimeter
NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................
13
Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................
15
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV.........................................................
16
Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử.............................................
17
Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................
18
Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu.....................................................
19
Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ....
26
Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT .................................................................................
30
Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của
tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV.......................
35
Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV
43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới,
đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein,
các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục
đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng
đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL.
Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt
Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là
nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt
Nam.
Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy
nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong
thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm
virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice
Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus-
RTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43],
[48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại
virut này. Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch
bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh
hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị
giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12].
Rất nhiều thành tựu đã đạt đƣợc trong nghiên cứu các biện pháp phòng
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.1.1. Thế giới
Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)
đã nổi lên nhƣ một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á. Nhiều trận dịch
rầy đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chƣa từng thấy ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ,
Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan... gây tổn thất nặng nề về kinh
tế [17]. Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất
trắng. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm
cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng
lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam. Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979)
thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn
300 triệu USD [22].
Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á
[43]. Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện ở vụ mùa thứ hai ở Đài Loan,
biểu hiện cây lúa bệnh và hình thái, cấu tạo của RWSV tƣơng tự RGSV [20]. Năm
1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm rầy và virut, gây thiệt hại
03 triệu tấn thóc [40]. Năm 1992 – 1993 cả vụ mùa giống SP60 ở Thái Lan bị mất
do tác hại của rầy nâu [50].
Rầy nâu mang các loại virut gây bệnh trên cây lúa nhƣ RGSV và RRSV, nên
có nguy cơ gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. Hai phƣơng pháp
truyền thống đƣợc sử dụng để bảo vệ cây lúa là phun thuốc trừ sâu và dùng giống
cây kháng rầy. Dùng thuốc trừ sâu hóa học đắt, độc hại và ô nhiễm môi trƣờng, do
đó biện pháp trồng cây lúa mang gen kháng rầy thông qua lai giống đƣợc nghiên
cứu và áp dụng rộng rãi. Tinjuangjun và CS (2000) đã chuyển gen gna thành công
vào hai giống gạo Thái Lan là Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) và Supanburi 60
(SP60), 37% số lƣợng rầy giảm đi khi gna biểu hiện bằng promoter RSs1 và 42%
khi gna biểu hiện bằng promoter Ubi-1 [50]. Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen
kháng rầy đang gặp trở ngại do sự thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chóng của
2008, dịch rầy nâu và các bệnh virut hại lúa tuy có giảm so với năm trƣớc nhƣng
vẫn đang ở mức nghiêm trọng. Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm
rầy nâu: 76.795 ha, trong đó có 4.298 ha bị nhiễm nặng. Diện tích bị nhiễm bệnh
VL&LXL trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập trung trên lúa hè thu giai đoạn đòng trổ,
trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha (tỉ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 ha
(tỉ lệ bệnh trên 10-20%), nhiễm nặng 138 ha (tỉ lệ bệnh trên 20-50%) [11].
Năm 2009, dịch rầy nâu và bệnh VL&LXL vẫn xảy ra trên nhiều vùng với
diện tích lớn. Tính đến tháng 08/2009 tại các tỉnh phía Nam diễn tích nhiễm rầy vụ
Hè Thu là 87.246 ha tập trung tại các tỉnh Kiên Giang, Long An, Sóc Trăng, Bạc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13
Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đông là 18.747 ha tại Vĩnh Long,
Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phƣớc, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh. Diện tích
nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu là 68 ha chủ yếu ở hai tỉnh Đồng Nai và Bình Thuận
[12].
1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL
Triệu chứng ban đầu chƣa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình thƣờng. Bụi
lúa bệnh chỉ hơi ngã màu xanh nhạt, đôi khi có những lá màu vàng đến cam. Thời
gian sau cây lúa bệnh có vẻ kém phát triển hơn (lúc này rất dễ nhầm lẫn với hiện
tƣợng kém dinh dƣỡng nên nông dân thƣờng bón thêm phân đạm) [8]. Lúa nhiễm
bệnh trong giai đoạn còn non thƣờng rất lùn, mọc nhiều chồi và có lá thẳng đứng.
Các lá bệnh thƣờng ngắn, hẹp, có màu nhạt, và có nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình
dạng không cố định [32],[43]. Các lá non mọc sau khi bị nhiễm bệnh thƣờng bị
sọc loang lổ, tuy nhiên lá lúa có thể vẫn xanh bình thƣờng nếu đƣợc cung cấp đủ
phân đạm [32]. Nhìn toàn cảnh thấy lúa hồi xanh không đều sau khi cấy, lá hẹp và
dựng đứng, lá có màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá có màu xanh đậm có thể có
nhiều đốm màu rỉ sắt (Hình 1.1).
virut thƣờng không thể đƣợc tách biệt rõ ràng với thiệt hại của rầy nâu và của virut
lùn xoắn lá (RRSV- cũng đƣợc truyền bởi rầy nâu) [40]. Trong năm 1974- 1977, có
tổng cộng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm bởi rầy nâu và virut vàng lùn lúa.
Sự thất thu năng suất do cả hai loài dịch hại này gây nên khoảng 03 triệu tấn lúa
[40].
RGSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh hoặc qua phấn hoa [31].
Virut cũng không đƣợc truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây
lúa bệnh, hoặc qua lây bệnh bằng tay. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy nâu
(Nilaparvata lugens) và một số loài rầy khác (N. bakeri, N. muiri) [28], [43].
Virut đƣợc truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật số trong rầy ký
chủ, nhƣng không đƣợc truyền qua trứng rầy [36]. Rầy nâu một khi nhiễm bệnh sẽ
truyền virut cho đến lúc chết. Kể từ năm 1984, RGSV thƣờng ít xuất hiện và gây
thiệt hại tại châu Á. Mặc dù không đƣợc báo cáo nhiều, sự ít xuất hiện của RGSV
có lẽ là do sự thay đổi trong khả năng truyền bệnh của quần thể rầy nâu. Tại
Philippin, tỉ lệ rầy nâu có thể lấy và truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trƣớc năm
1977 [32] sang 0- 15% trong năm 1984 [26]. Từ đây ta có thể giả thiết là một trong
những khả năng của sự bùng phát của dịch RGSV tại miền Nam Việt Nam hiện nay
là do sự thay đổi về khả năng truyền bệnh của rầy nâu: tỉ lệ rầy có khả năng lấy và
truyền virut có thể đã tăng lên đáng kể trong quần thể rầy nâu tại vùng này trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15
những năm vừa qua.
Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, và vài phân
tử RdRp [35]. Thể virut khó đƣợc quan sát thấy trong dịch trích thực vật dƣới kính
hiển vi điện tử. Thể virut sau khi đƣợc ly trích có dạng sợi dài 2µm và rộng 6- 8 nm
khi đƣợc quan sát bằng cách nhuộm trong uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2).
đoạn mã theo chiều bổ sung với RNA5 [21].
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV
Các thanh đen hình sợi chỉ tƣợng trƣng cho các RNA với chiều dài đã đƣợc xác
định. Các mũi tên đen tƣợng trƣng cho các sản phẩm protein. Chiều mũi tên là chiều của
quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide. “Nguồn: Hồ Xuân Thiện, 2006”
1.3.2. Các loại virut khác
1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)
Bệnh lùn xoắn lá lúa đƣợc miêu tả đầu tiên năm 1977 [48]. Bệnh xuất hiện
chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp. và đƣợc gây ra bởi virut có tên khoa học là
Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58].
RRSV xuất hiện tại nhiều nƣớc trồng lúa châu Á nhƣ Ấn Độ, Bangladesh,
Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung
Quốc [60], và Việt Nam. RRSV là một virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng
kể. Virut không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh [20]. Virut không đƣợc
truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ
mạnh với cây lúa bệnh [60]. Rầy nâu Nilaparvata lugens là tác nhân truyền bệnh
duy nhất đƣợc biết [18], [48].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
Thể virut của RRSV có dạng hình cầu, bao gồm một vỏ, một phần trung tâm,
loài rầy xanh. Loài rầy truyền bệnh chủ yếu của RTSV tại vùng Đông Nam Á là rầy
xanh đuôi đen Nephotettix virescens (tên khác là N. impicticeps) [47], [59].
A B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử
Xem trong dung dịch uranyl acetate. “Nguồn: Hull R., 1996”
RTSV có thể virut hình cầu, đƣờng kính 30 nm (Hình 1.5), chứa một phân tử
RNA sợi đơn có chiều dƣơng và dài khoảng 12 kb [37], và ba protein cấu tạo vỏ
virut là CP1 (kích thƣớc 22.900 kDa), CP2 (22.300 kDa) và CP3 (33.000 kDa)
[23],[46], [49], [52], [53].
1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV)
Virus tungro hình nhộng có tên khoa học là Rice tungro bacilliform virus
(RTBV), thuộc chi Tungrovirus, họ Caulimoviridae [27], [34]. RTBV đƣợc tìm
thấy tại hầu hết các nƣớc trồng lúa tại Nam và Đông Nam Á. Sự phân bố của virut
có lẽ có mối quan hệ chặt chẽ với sự phân bố của rầy xanh (côn trùng truyền bệnh
tungro) [59].
Giống nhƣ RTSV, RTBV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh.
Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành
với cây lúa bị bệnh. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy xanh (Nephotettix virescens) khi
có sự giúp đỡ của RTSV. RTBV chỉ đƣợc truyền khi rầy xanh hút RTSV trƣớc hoặc
A. Trứng rầy; B. Rầy con (ấu trùng);
C. Rầy nâu trƣởng thành cánh ngắn; D. Rầy nâu trƣởng thành cánh dài
“Nguồn: http://www.vaas.org.vn/”
1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại
Vòng đời của sâu gai từ 25- 30 ngày và thay đổi theo mùa
+ Thời gian trứng: 5- 14 ngày
+ Thời gian rầy non: 12- 32 ngày
+ Thời gian rầy trƣởng thành: 3- 20 ngày
A
B
C D
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20
Rầy cái trƣởng thành có thể đẻ 150- 250 trứng và có tính hƣớng sáng mạnh.
Con trƣởng thành và rầy non đều hút nhựa cây từ dảnh và lá lúa. Rầy nâu xâm nhập
vào ruộng lúa ngay từ khi mới cấy và hại cả trên mạ. Rầy nâu phát sinh với mật độ
cao và gây hại nặng vào giai đoạn trƣớc lúc lúa trỗ bông, ngậm sữa và bắt đầu chín
[65]. Nếu chỉ đơn thuần rầy gây hại không là môi giới truyền bệnh thì đánh giá mức
gây hại của rầy nâu là không lớn nhƣng cách phòng trừ loại rầy này lại tƣơng đối
khó. Rầy nâu có phản ứng kháng, nhiễm với các giống lúa rất rõ, nó có khả năng
hình thành các nòi sinh học mới khi có sức ép chọn lọc của môi trƣờng đủ lớn. Rầy
có khả năng di cƣ đám đông rất xa và kháng thuốc cao. Rầy nâu còn có tác hại chủ
yếu là truyền lan các loại virut [10]. Nguy hiểm hơn cả là bệnh VL&LXL lúa khi
truyền các loại virut là RGSV và RRSV. Rầy nâu thích hợp với điều kiện khí hậu
ấm nóng, độ ẩm cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở Miền Nam rầy có thể gây hại liên tục các
vụ lúa, còn ở phía Bắc cháy rầy thƣờng xảy ra vào tháng 5 (vụ xuân) và cuối tháng
9 đầu tháng 10 (vụ mùa) [54].
Tỉ lệ rầy nâu N. lugens có thể truyền bệnh khác nhau theo từng vùng trên
diệt ngay sau khi phun thuốc) [6].
Nhiều kết luận cho rằng không một biện pháp đơn lẻ nào có thể phòng trừ
rầy nâu một cách hoàn hảo. Vấn đề chỉ có thể giải quyết bằng cách thực hiện một
chƣơng trình phòng trừ tổng hợp, trong đó giống kháng, biện pháp sinh học, biện
pháp canh tác và dùng thuốc hóa học phải đƣợc kết hợp với nhau một cách hợp lý
[9], [44]. Vì vậy, đòi hỏi phải có những nghiên cứu chi tiết về các chủng virut gây
bệnh và môi giới truyền bệnh VL&LXL trên qui mô rộng lớn.
1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN
CỨU BỆNH VIRUT
1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử
Trong sinh học phân tử, có nhiều loại enzym quan trọng, trong đó phải kể
đến những loại sau:
Enzym phiên mã ngƣợc có vai trò quyết định trong quá trình hình thành
ngành sinh học phân tử Eucaryot. Enzym này do các retrovirut sản sinh nhằm sao
chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào vật chủ. Enzym phiên mã ngƣợc tổng hợp
nên một mạch DNA bổ sung (cDNA- complementary DNA) từ RNA khuôn theo
chiều 5’-3’, khi có mặt của mồi. Các ứng dụng chủ yếu là: Thiết lập ngân hàng
cDNA, tiến hành phản ứng PCR trên mRNA, và xác định trình tự của các axit
nucleic bằng phƣơng pháp sử dụng các dideoxynucleotit.
DNA ligase là enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA hay
RNA (RNA ligase). Enzym này đƣợc tách chiết từ E.coli và xúc tác cho phản ứng
nối hai trình tự DNA có đầu so le. T
4
DNA ligase có nguồn gốc từ phage T
4
xâm
nhiễm E.coli. Enzym này có cùng chức năng với ligase tách chiết từ E.coli nhƣng
đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên T
4
DNA ligase đƣợc
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản
ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen
quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng
enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ
RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác
nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có
intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là
sinh vật nhân sơ hoặc virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với
mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi
RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các
Copyright: Tài liệu đại học ©