LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành được luận văn tốt nghiệp này, Tơi xin bày tỏ lịng
kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Diễm Hồng – Trưởng phịng
Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi đều kiện, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi
hồn thành luận văn này.
Tơi mong muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ban Lãnh đạo Viện Công
nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu
Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi
điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tơi trong suốt q trình học tập và
nghiên cứu.
Bên cạnh đó, tơi cũng đã nhận được sự ủng hộ nhiệt tình và các ý kiến đóng
góp q báu của tất cả các Anh/Chị và các Bạn đồng nghiệp của Phịng Cơng nghệ
Tảo. Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn mọi sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến người Mẹ của tơi, đến gia đình
người thân cũng như Bạn bè đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi trong q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận
văn của mình.
Hà Nội, ngày tháng
Học viên cao học

năm


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn
toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và
các thơng tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.




2.1.3. Thiết bị.................................................................................................... 26
2.2. Phương pháp.................................................................................................27
2.2.1. Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào..................................................27
2.2.2. Xác định hình thái và kích thước tế bào bằng kính hiển vi quang học....27
2.2.3. Xác định sinh trưởng qua sinh khối khô..................................................28
2.2.4. Phương pháp nhuộn lipid bằng Nile red..................................................28
2.2.5. Tách chiết lipit........................................................................................ 29
2.2.6. Định lượng squalene bằng phương pháp so màu.....................................29
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô.......................................................30
2.2.7.1. Tách chiết squalene thô.................................................................... 30
2.2.7.2. Tinh sạch squalene thô...................................................................... 31
2.2.8. Xác định squalene bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng..........................31
2.2.9. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột....................................32
2.2.10. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp.......................................... 32
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..........................33
3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng làm nguyên liệu
cho tách chiết squalene.........................................................................................33
3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao...........36
3.2.1...........................Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red
36
3.2.2. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên
cứu...38
3.2.3. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối tảo bằng phương pháp so
màu

38

3.2.4. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối bình lên men 30 lít bằng sắc
ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp...................................................................43

2

DHA

Docosahexaenoic Acid (C22: 6n-3)

3

EPA

Eicosapentaenoic Acid (C20:5n-3)

4

GC

Gas chromatography (sắc ký khí)

5

GC-MS

Gas chromatography mass spectrometry

6

GOT

Glutamatoxaloacetat transaminase



12

MJA

Methyl jasmonate

13

PFAD

Palm fatty acid distillate

14

Ras

Rat sarcoma

15

Rf

Retention factor

16

SKK

Sinh khối khô


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các thơng số lý hóa của squalene..............................................................5
Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở người...................................................................13
Bảng 1.3. Hàm lượng squalene trong các loại dầu...................................................16
Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng, 2 loài dị dưỡng và điều kiện
ni cấy chúng trong điều kiện phịng thí nghiệm..................................34
Bảng 3.2. Hàm lượng lipit của một số lồi VTB đã được sử dụng trong nghiên cứu. 38
Bảng 3.3. Hàm lượng squalene của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu...........................41
Bảng 3.4. Hàm lượng squalene của chủng PQ6 được phân tích bằng TLC và HPLC.46

8

Nguyễn Cẩm Hà - K16


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C30H50).....................................................4
Hình 1.2. Squalene synthase trong con đường sinh tổng hợp cholesterol..................7
Hình 1.3. Mặt cắt các tuyến bã nhờn ở da người.....................................................13
Hình 1.4. Hình thái của tế bào Schizochytrium........................................................23
Hình 3.1. Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp dưới kính
hiển vi quang học.........................................................................................34
Hình 3.2. Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6
(A) và Thraustochytrium striatum (B).........................................................35
Hình 3.3. Hệ thống ni trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mơ
bình từ 250 mL đến bình 10 lít...................................................................35
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa ni trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 và....36
Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh



MỞ ĐẦU
Squalene là tiền chất steroit của động, thực vật, được ứng dụng rộng rãi trong
cơng nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khơ da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ
da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho
thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột
kết, phổi, da ở động vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể bởi nó là một
chất chống oxy hố tự nhiên có vai trị bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy
phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch. Việc
cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày)
đã được chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm
đáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy chúng cũng được dùng phổ biến trong
dược phẩm.
Cho đến nay, các nguồn sản xuất squalene được biết đến nhiều nhất là các
loại dầu động, thực vật. Dầu o liu chứa hàm lượng squalene cao nhất trong khi một
số loại dầu khác như dầu cọ, dầu ngô, dầu vừng lại có hàm lượng squalene khơng
cao. Dầu gan cá mập là một nguồn nguyên liệu truyền thống cho tách chiết squalene
có hàm lượng và chất lượng cao. Tuy nhiên, việc duy trì nguồn cung cấp squalene
liên tục và lâu dài ngày càng gặp khó khăn do sự suy giảm nguồn cá trong tự nhiên
cũng như các vấn đề về thổ nhưỡng và mùa vụ của các loại cây trồng. Trong khi đó,
hiện nay, trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm
nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm đang ngày càng tăng.
Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn
truyền thống để tách chiết squalene là rất cần thiết và đang được các nhà khoa học
trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong đó, vi sinh vật nói chung và vi tảo
biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên qui mơ lớn.
Tảo lục Botrycoccus braunii có khả năng tổng hợp squalene cao nhưng tốc
độ sinh trưởng rất thấp và là cơ thể quang tự dưỡng bắt buộc nên gây khó khăn cho
việc thương mại hóa sản phẩm này. Trong khi đó, một số các lồi vi tảo biển dị

nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về squalene
1.1.1. Nguồn gốc squalene
Mặc dù ở độ sâu từ 500m -1000m dưới lịng biển, nơi hầu như khơng có ánh
sáng mặt trời, khơng có thực vật, do đó hàm lượng oxy rất thấp, nhiệt độ trung bình
2

quanh năm khoảng 2°C, áp suất nước là 50-100kgf/cm nhưng cá mập biển sâu vẫn
sống và tồn tại được. Một vấn đề được nêu ra là làm sao lồi cá mập đại dương lại
có thể sinh tồn trong một môi trường sống khắc nghiệt như vậy được. Các nhà sinh
vật học đã nghiên cứu và nhận thấy ở loài cá mập đại dương này có bộ phận gan lớn
hơn rất nhiều so với gan của các lồi cá khác. Trong đó, 80% gan cá này là dầu có
chứa một chất được xem là “thần bí”. Sau này, chất này được xác định là squalene.
Khả năng tồn tại được trong điều kiện sống bất lợi nêu trên đối với cá mập đại
dương liên quan nhiều đến sự có mặt squalene với hàm lượng cao ở gan của nó.
Squalene có khả năng nâng cao sức sống cho tế bào và tăng sức đề kháng của cơ thể
cá mập và chính những điều này đã giúp cho lồi cá này có thể tự do sinh tồn trong
mơi trường biển với độ sâu 500m – 1000m.
Dầu gan cá mập chứa khoảng 60-85% chất hữu cơ nêu trên trong khi ở dầu
oliu chất này có hàm lượng chỉ khoảng 0,4- 0,8 %. Cư dân của bán đảo Izu của
Nhật Bản đã uống một loại dầu được đặt tên địa phương là “Samedawa” có
nghĩa là “chữa được tất cả” các bệnh. Theo các dẫn chứng khoa học thì từ xa
xưa, người Nhật Bản chủ yếu đã sử dụng nhiều hải sản trong chế độ ăn uống của
họ. Vì vậy, khơng quá ngạc nhiên vào năm 1916, một nhà hóa học người Nhật
Bản là Tiến sĩ Tsujimoto đã chứng minh được rằng “Samedawa” chứa một
lượng rất lớn các hydrocacbon không bão hịa. Ơng gọi nó là squalene do sự xuất
hiện của nó trong dầu gan cá mập, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [90].



khiết, nó gần như khơng màu, khơng mùi, khơng vị. Ngoài ra, squalene hấp thụ oxy
và trở nên sền sền trông gần giống như dầu hạt lanh (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Các thơng số lý hóa của squalene
( />Trạng thái
Nhiệt độ nóng chảy (độ C)

Chất lỏng
-5

Điểm sôi (độ C)

429

Điểm chớp cháy (độ C)

254

Trọng lượng phân tử
Độ tan trong nước (g/l)

410,73
Không tan trong nước

Tỷ trọng tương đối (khơng khí =1)

>1

Nhiệt độ bay hơi (kJ/mol)

bào ảnh hướng đến tốc độ tổng hợp enzyme HMG-CoA reductase do đó ảnh hưởng
đến tồn bộ quá trình tổng hợp của isoprenoit và cholesterol. Các nghiên cứu lâm
sàng đã cho thấy ức chế sinh tổng hợp squalene có tác dụng làm giảm hàm lượng
cholesterol cũng như LDL-C. Squalene synthase đóng một vai trị quan trọng trong
con đường sinh tổng hợp cholesterol vì nó chịu trách nhiệm phân bố các chất trung
gian của cả nhóm sterol và khơng sterol (Hình 1.2.). Tuy nhiên, tổng hợp squalene
nhiều có thể là một trong các nguyên nhân gây ra bệnh tăng cholesterol trong máu.
1.2. Vai trò của squalene
1.2.1. Squalene là một tác nhân chống lão hóa
Theo Tổ chức Y tế thế giới, “lão hóa” hoặc “q trình lão hóa” là sự thay đổi
một loạt hình thái và sinh lý xuất hiện như một hệ quả tất yếu qua thời gian, giảm
khả năng thích ứng của các cơ quan và hệ thống cũng như khả năng đáp ứng với
những tác nhân có hại. Lão hóa là một q trình phức tạp được thể hiện trong một
cơ thể sinh vật ở nhiều mức cấp độ: di truyền, phân tử, tế bào, trong các cơ quan và
hệ thống. Mặc dù các cơ chế phân tử của q trình lão hóa vẫn chưa được biết rõ
nhưng ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra vai trò của oxy và nito là một trong
những nhân tố quyết định chính trong q trình lão hóa. Tình trạng stress oxy hóa
xảy ra ở con người có thể do chế độ ăn uống và hoạt động thể chất gây ra. Tình
trạng stress oxy hóa này cũng có thể giảm xuống mức độ bình thường thơng qua


việc bổ sung các chất chống oxy hóa tự nhiên có vai trị ngăn chặn và bảo vệ cơ thể
chống lại các bệnh về tuổi tác [21].

Hình 1.2. Squalene synthase trong con đường sinh tổng hợp cholesterol [28].
Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy chế độ ăn kiểu Địa Trung Hải trong
những năm 90s là rất tốt cho sức khỏe con người, giảm tỷ lệ mắc bệnh mạch vành
[47] và một số loại bệnh ung thư [94]. Đó là do trong thành phần thức ăn rất giàu
vitamin, chất chống oxy hóa và các chất béo khơng bão hịa đa nối đôi [58], [68].
Nghiên cứu được tiến hành trên người tình nguyện đã cho thấy một số thành

với các ion hydro từ nước và axit trong cơ thể đi kèm với việc giải phóng oxy
trong cơ thể theo phản ứng sau:
C30H50 (squalene) + 6H2O (nước) -> C30H62 (squalane) + 3O2 (oxy) [88]
Như vậy, squalene đã giúp cho việc bảo đảm oxy ở nồng độ nhất định trong
tế bào, và tình trạng này giúp cải thiện hơn nữa các chức năng của cơ quan thơng
qua q trình trao đổi chất hiếu khí, ngăn ngừa hội chứng bị axit hóa (acidotic)
trong tế bào - nơi các tế bào có tính axit có thể trở nên xấu đi và chết do thiếu oxy


[25]. Hai tác giả Alvaro và Eduardo cũng đã công bố squalene có tính chất hóa học
như isoprenoit, có cấu trúc tương tự với carotenoit như lycopene, với vitamins A và
E cũng như các chất chống oxy hóa nội sinh khác như glutathione, superoxide
dismutase và ubiquinone (coenzyme Q10) [7]. Tất cả các chất nêu trên đều có khả
năng chống oxy hóa cao.
Ở trong cơ thể người, squalene được vận chuyển trong máu bởi các
lipoprotein tỷ trọng thấp, nó phân bố chủ yếu trên da. Squalene dễ dàng xâm nhập
vào màng tế bào do tính chất kị nước và có thể được vận chuyển trong tế bào nhờ
các protein chuyên chở squalene tổng hợp trong gan. Chính vì vậy, squalene đóng
vai trị quan trọng như một chất chống oxy hóa trong màng tế bào cũng như ở các
bào quan khác nhau trong tế bào.
Nhìn chung có thể nói squalene có khả năng bổ sung dưỡng khí cho tế bào,
có tác dụng chống lại q trình oxy hóa, bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương do
gốc tự do, tăng tốc độ tuần hoàn của máu, tăng khả năng tái sinh của tế bào, phịng
ngừa hiện tượng lão hóa của da và các cơ quan trong cơ thể, giúp cho làn da và cơ
thể hồi phục lại sức sống và nét thanh xuân.
1.2.2. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con người
1.2.2.1. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư
Squalene đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ chống lại một số chất
gây ung thư [83]. Năm 1996, Desai và các cộng sự của ông đã làm thử nghiệm trên
50 con chuột cái, gây thực nghiệm các khối u trên da bằng 7,12-dimethylbenz [a]

của squalen được quyết định bởi đặc điểm cấu trúc của nó; giúp cho việc chống
ung thư có hiệu quả hơn.
Nhiều cơng bố đã khẳng định squalene có vai trị là chất chống oxy hóa
mạnh cũng như có hoạt tính chống ung thư thông qua con đường của các gen gây
ung thư thuộc họ ras (ras-oncogene pathway) (ras là tên viết tắt của Rat sarcoma được sử dụng để nói về họ gen mã hoá cho các protein GTPase nhỏ, tham gia vào
q trình truyền tín hiệu trong tế bào) thể hiện tiềm năng chữa bệnh của nó [16].
Ras được tìm thấy ở 30% các bệnh ung thư. Tế bào ung thư kích hoạt gen ras
tổng hợp protein ras và thực hiện chức năng ras. Protein ras gây ung thư ở trạng thái
kích hoạt liên tục dẫn đến khơng kiểm sốt được sự phân chia tế bào trong trường
hợp khơng có dấu hiệu tăng trưởng [40]. Sự kích hoạt của các protein này phụ thuộc


vào sự chuyển hóa isoprenoit trong các tế bào ung thư. Thông qua isoprenylation,
farnesylpyrophosphate đã sửa chữa protein ras và các protein quan trọng khác ở
màng tế bào hay màng nhân. Nếu thiếu bước quan trọng này thì các gen gây ung
thư đã không bị hạn chế hoạt động. Một lượng squalene được bổ sung hàng ngày
đã có thể ức chế sản xuất isoprenoit trong các tế bào ung thư và ngăn chặn khối
u phát triển. Đây là bằng chứng khoa học giải thích cho khả năng chống ung thư
của dầu o liu đã được khám phá vào năm 2007.
1.2.2.2. Vai trò của squalene trong giải độc
Nhiều bằng chứng thực nghiệm cho thấy squalene có tác dụng hỗ trợ để loại
bỏ các chất độc ưa mỡ ra khỏi cơ thể. Squalene là một chất khơng phân cực, khi có
mặt nó thì những tương tác thuộc dạng khơng ion hóa sẽ xuất hiện [46].
Squalene có tác dụng tăng cường loại bỏ hexanchlorobenzen (HCB). Chế độ
ăn có bổ sung squalene (8%) đã làm tăng rõ rệt sự bài tiết HCB theo phân cao gấp 3
lần và thời gian đào thải giảm đáng kể (từ 34-38 ngày so với 110 ngày ở đối chứng)
ở chuột sau 3 tuần thí nghiệm [74]. Tuy nhiên, tác dụng hữu hiệu này của squalene
khi HCB có hàm lượng cao lại phụ thuộc vào loại mô nhưng sự khác biệt về tác
dụng nêu trên lại không đáng kể ở mô gan và máu.
Trong vấn đề giải độc, squalene được xem là một ứng cử tốt để làm giảm độc

của ánh sáng mặt trời, bao gồm cả tia cực tím (UV). Tế bào da rất giàu lipit và
được cho là dễ bị oxy hóa bởi ánh sáng mặt trời. Tuyến bã nhờn là một loại tuyến
tiết trong cơ thể, thường đi kèm với một nang chân lông (nên gọi tắt là tuyến bã
nhờn lông) tiết ra chất bã nhờn (Sebum) có tác dụng làm trơn bề mặt da (Hình
1.3.). Ở người, tuyến bã nhờn lơng được tìm thấy nhiều nhất trên mặt và da dầu,
mặc dù chúng được phân bố ở khắp các vị trí trên da ngoại trừ lòng bàn tay và
lòng bàn chân. Bã nhờn di chuyển tới bề mặt da, kết hợp với độ ẩm, khơng khí và
mồ hơi, từ đó tạo thành một lớp lipit, là hàng rào bảo vệ của da. Squalene là một
hợp chất triterpene có cấu trúc độc đáo, nó là một trong những thành phần chính
của các lipit trên bề mặt [70]. Hơn nữa, một con số đáng lưu ý là squalene được
tiết ra từ bề mặt da nằm trong khoảng từ 125 đến 475 mg/ngày [53]. Thông thường
nó được vận chuyển trong huyết thanh và được kết hợp với lipoprotein có trọng
lượng phân tử thấp, phân bố khắp nơi trong các tế bào mô người, tập trung lớn
nhất trong bã nhờn của da (13%) (Bảng 1.2) [73].


Hình 1.3. Mặt cắt các tuyến bã nhờn ở da người
( />Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở người [73]
Các thành phần bã nhờn

Thành phần (%)

Wax esters

25

Squalene

13


trung gian trong ngành công nghiệp dược phẩm. Nhiều công bố cũng chỉ ra rằng
squalene được sử dụng làm chất chất diệt khuẩn hữu hiệu; còn là chất trung gian
trong sản xuất các hợp chất hữu cơ, cao su hóa chất, chất thơm hay các chất có hoạt
tính hoạt động bề mặt [8], [43].
Hiện nay, trên thế giới ngày càng xuất hiện nhiều sản phẩm chứa squalene ở
dạng mỹ phẩm hay thực phẩm chức năng, có giá trị thương mại cao. Việc bổ sung
squalene vào chế độ ăn uống cũng được quan tâm đáng kể trong những năm gần
đây. Ví dụ như người dân ở vùng Địa Trung Hải có được một lối sống lành mạnh là
do trong chế độ ăn uống của họ có thành phần squalene chứa trong dầu oliu. Lượng
tiêu thụ dầu o liu ở những đất nước này khá lớn [69]. Cũng theo khảo sát USDA
thực hiện trong những năm 2000s, tiêu thụ squalene mỗi ngày trong chế độ ăn trung
bình của người Mỹ dao động 24-38 mg/2000 calo từ các thực phẩm khác nhau.
Để đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng về squalene trong các ngành dược
phẩm, công nghiệp, mỹ phẩm…đối với nhu cầu cuộc sống con người nên các nhà
khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu để có thể tách chiết và tinh sạch được
một lượng lớn squalene từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
1.3. Các nguồn khai thác squalene
Hiện nay, các viên dầu squalene trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc từ dầu
gan cá mập và dầu của các hạt thực vật. Nguồn truyền thống ban đầu được biết đến
là dầu gan cá mập. Với dầu gan cá mập, squalene là thành phần chính, chiếm tới


89% lượng dầu với độ tinh sạch cao từ 99-100%, được coi là nguồn chứa squalene
dồi dào nhất [34].
Trong dầu cọ, squalene có hàm lượng từ 250-730 ppm cho đến khoảng 1 %;
vitamin E-700-1000 ppm; phytosterol -300-620 ppm và 250-730 ppm squalene.
Mặc dù, hàm lượng squalene này khá thấp nhưng với sự có mặt của vitamin E hay
co-enzyme Q10 đã giúp tăng cường lợi ích điều trị bệnh của squalene.
Ngồi ra, các sản phẩm axit béo chưng cất từ dầu cọ (Palm fatty acid
distillate - PFAD) cũng chứa hàm lượng squalene cao lên đến 1,03 % (w/w), cao