Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
*** NGUYỄN CẨM HÀ
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ
CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, năm 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
*** Nguyễn Cẩm Hà
điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ nhiệt tình và các ý kiến đóng
góp quý báu của tất cả các Anh/Chị và các Bạn đồng nghiệp của Phòng Công nghệ
Tảo. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn mọi sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến người Mẹ của tôi, đến gia đình
người thân cũng như Bạn bè đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận
văn của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Học viên cao học Nguyễn Cẩm Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn
toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Nguyễn Cẩm Hà
1.2.4. Vai trò của squalene đối với các ngành công nghiệp khác 14
1.3. Các nguồn khai thác squalene 14
1.4. Nghiên cứu khai thác squalene từ vi tảo trên thế giới 18
1.5. Một số hướng nghiên cứu về squalene trên thế giới 20
1.6. Nghiên cứu trong nước về squalene 21
1.7. Một số giới thiệu về chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium của Việt Nam 22
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 25
2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy 25
2.1.2. Hóa chất 26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.1.3. Thiết bị 26
2.2. Phương pháp 27
2.2.1. Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào 27
2.2.2. Xác định hình thái và kích thước tế bào bằng kính hiển vi quang học 27
2.2.3. Xác định sinh trưởng qua sinh khối khô 28
2.2.4. Phương pháp nhuộn lipid bằng Nile red 28
2.2.5. Tách chiết lipit 29
2.2.6. Định lượng squalene bằng phương pháp so màu 29
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô 30
2.2.7.1. Tách chiết squalene thô 30
2.2.7.2. Tinh sạch squalene thô 31
2.2.8. Xác định squalene bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 31
2.2.9. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột 32
2.2.10. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp 32
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng làm nguyên
liệu cho tách chiết squalene 33
1
Cs
Cộng sự
2
DHA
Docosahexaenoic Acid (C22: 6n-3)
3
EPA
Eicosapentaenoic Acid (C20:5n-3)
4
GC
Gas chromatography (sắc ký khí)
5
GC-MS
Gas chromatography mass spectrometry
6
GOT
Glutamatoxaloacetat transaminase
7
GPT
Glutamate pyruvate transaminase
8
HCB
Hexan chloro benzene
9
HPLC
High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng cao áp)
10
HMG-C
Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A
Thin layer chromatography
(sắc ký lớp mỏng)
Terbinafine
Vi tảo biển Nguyễn Cẩm Hà - K16
ii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene 5
Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở người 13
Bảng 1.3. Hàm lượng squalene trong các loại dầu 16
Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng, 2 loài dị dưỡng và điều kiện
nuôi cấy chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm 34
Bảng 3.2. Hàm lượng lipit của một số loài VTB đã được sử dụng trong nghiên cứu 38
Bảng 3.3. Hàm lượng squalene của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu 41
Bảng 3.4. Hàm lượng squalene của chủng PQ6 được phân tích bằng TLC và HPLC 46
Nguyễn Cẩm Hà - K16
iii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C
30
Hình 3.12. Sắc ký đồ của squalene chuẩn xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC và
HPLC 45
Nguyễn Cẩm Hà - K16
iv
Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu PQ6 squalene được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng
và xác định bằng HPLC 46
Hình 3.14. Áp dụng phương pháp TLC (bản nhôm, bản nhỏ) để sàng lọc nhanh các
chủng vi tảo biển có hàm lượng squalene cao. Đường 0- saqualene chuẩn . 47
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng xác định squalene từ mẫu chuẩn và mẫu lipit không xà
phòng hóa của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau 49
Hình 3.16. Ảnh minh họa cho quá trình tinh sạch squalene từ lipit không xà phòng hóa 49
Hình 3.17. Sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký đồ (B) của mẫu squalene từ chủng PQ6
sau khi tinh sạch qua cột silicagel 50
Hình 3.18. Tách lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6 51
Hình 3.19 Tách squalene thô từ lipit tổng số của chủng PQ6 52
Hình 3.20. Tinh sạch squalene thô từ lipit tổng số 53
Nguyễn Cẩm Hà - K16
1
MỞ ĐẦU
Squalene là tiền chất steroit của động, thực vật, được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ
da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho
bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và không cần có ánh sáng bởi vì cơ thể chúng có bộ
máy quang hợp đã bị thoái hóa. Do vậy, việc nâng cấp quy mô nuôi trồng chúng
bằng các hệ thống bình lên men khác nhau để bảo đảm cung cấp đủ nguồn nguyên
liệu cho sản xuất squalene hứa hẹn sẽ có thành công.
Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam hiện đang có một tập đoàn giống vi tảo biển quang tự
dưỡng và dị dưỡng của Việt Nam. Nhiều loài vi tảo trong tập đoàn giống có thể
là nguồn cung cấp cho việc tách chiết squalene trên quy mô lớn. Chính vì vậy,
chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc
squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam” nhằm cung cấp cơ
sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene ở vi tảo biển Việt Nam, có được các
phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm về tách chiết,
xác định squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số
chủng tiềm năng cho việc nghiên cứu sâu hơn theo định hướng sử dụng squalene
làm thực phẩm chức năng và dược phẩm trong tương lai ở Việt Nam
Luận văn nghiên cứu có một số nội dung như sau:
1. Sàng lọc một số chủng vi tảo biển của Việt Nam có khả năng nuôi trồng trên
quy mô lớn và có hàm lượng squalene cao.
2. Xây dựng các phương pháp xác định nhanh chóng hàm lượng squalene phù
hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam để sử dụng cho việc sàng
lọc nhanh các chủng tiềm năng cho sản xuất squalene.
3. Bước đầu tách chiết và làm sạch squalene từ chủng tiềm năng lựa chọn được.
Công việc nghiên cứu được thực hiện tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công
nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyễn Cẩm Hà - K16
3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Nguyễn Cẩm Hà - K16
4
sinh tổng hợp của steroit [39]. Năm 1934, Robinson đã công bố cấu trúc vòng của
squalene với phân tử steroit [78]. Tuy nhiên, đến năm 1936 công thức hóa học của
squalene mới được công bố đầy đủ do Karrer, (1943) – người cũng đã khám phá ra
cấu trúc hóa học của vitamin A và E.
Squalene từ dầu gan cá mập được đặt tên theo tiếng Latin là “squalene
oxogene oleum”. Trong y học nó được gọi là Spinacene hay Supraene.
Theo công bố của Kohno và cộng sự (1995) [52] thì squalene có cấu tạo:
(2,6,10,15,19,23–hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexane) - là một hydrocacbon
hợp chất béo không bão hòa (C
30
H
50
), với 6 liên kết đôi, chứa 6 đơn vị isoprene để
cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol axit mật và steroit, là một chất trao đổi
trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và triterpenes ở động vật và thực vật
(Hình 1.1).
Do cấu trúc của liên kết đôi trong sáu nhóm CH
3
, các isoprenoit có tác
dụng chống oxy hóa tự nhiên một cách mạnh mẽ. Squalene có cấu trúc tương tự
như các isoprenoit khác như β-carotene, lycopene, vitamin A, vitamin E, và
coenzyme Q10 [24].
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C
30
H
50
) [48]
Tỷ trọng hơi (không khí =1)
14,2
1.1.4. Con đƣờng sinh tổng hợp cholesterol
Kể từ khi được phát hiện vào đầu thế kỉ XX, squalene đã được công nhận là
mắt xích quan trọng trong con đường trao đổi chất, là một bước trung gian trong
quá trình sinh tổng hợp cholesterol và tất cả các hormone steroit. Cholesterol gắn
với lipoprotein có trọng lượng phân tử thấp (LDL-C, Low Density Lipoprotein -
Cholesterol) có hàm lượng cao là một nguy cơ đối với những người mắc bệnh tim.
Statins là một trong những loại thuốc làm hạ cholesterol máu, có tác dụng ngăn
chặn bệnh tim ở người bởi nó ức chế enzyme hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A
reductase (HMG-CoA reductase) có vai trò xúc tác tạo ra cholesterol. Tuy nhiên,
statins có thể gây ra tác dụng phụ ở một số bệnh nhân và đối với một phạm vi người
nào đó thì nó lại không có hiệu quả. Thay thế cho statins, hiện nay, một số tác nhân
làm giảm cholesterol bằng cách ức chế trực tiếp quá trình sinh tổng hợp squalene
được cho là đầy hứa hẹn. Squalene được chứng minh là một chất ức chế hoạt tính
Nguyễn Cẩm Hà - K16
6
của nhóm HMG-CoA reductase và làm tăng hoạt động của Acyl CoA cholesterol
acyltransferase [53]. Trong thực tế, tổng hợp nội sinh của squalene bắt đầu bằng
việc sản xuất HMG-CoA. Giảm hàm lượng HMG-CoA sẽ kéo theo hình thành
mevalonate [7]. Cholesterol được tổng hợp theo con đường mevalonate. Sau các
phản ứng sinh hóa, các nhóm prenyl được bổ sung, các phân tử của nhóm trung gian
farnesyldiphosphate được tập hợp và giảm đi, kết quả là hình thành squalene. Sau
quá trình sinh tổng hợp, squalene có thể được vận chuyển tới các khu vực khác của
cơ thể trong các mô hoặc được chuyển hóa để cuối cùng cholesterol và các chất
chuyển hóa steroit của nó được tổng hợp [65]. Sự xuất hiện squalene trong các tế
bào ảnh hướng đến tốc độ tổng hợp enzyme HMG-CoA reductase do đó ảnh hưởng
đến toàn bộ quá trình tổng hợp của isoprenoit và cholesterol. Các nghiên cứu lâm
phần trong dầu ô liu (polyphenol, squalene) được con người sử dụng rất có lợi đối
với sức khỏe. Ăn nhiều thức ăn chứa nhiều chất béo thì tình trạng stress oxy hóa sẽ
gây ra viêm, rối loạn chức năng nội mô, tăng đông máu, xơ vữa động mạch nhưng
với một chế độ ăn có bổ sung chất chống oxy hóa có thể giảm thiểu tình trạng nêu
trên [67].
Nguyễn Cẩm Hà - K16
8
Squalene bảo vệ tế bào và màng sinh học của các cơ quan bào tương khỏi sự
oxy hóa cũng như góp phần duy trì ổn định quá trình chuyển hóa cholesterol và giữ
LDL-cholesterol ở mức tối thiểu [35]. Màng sinh học dễ bị tổn thương bởi các gốc
tự do, đặc biệt là ở nhóm kị nước giữa hai lớp lipidic. Squalene được quan tâm chú
ý bởi khả năng tuyệt vời của nó trong việc nhận và cho điện tử mà không gây ra bất
kỳ một sự thay đổi phân tử nào. Khả năng và hiệu quả chống oxy hóa ổn định là do
sáu đơn vị isoprenoit trong cấu trúc của squalene quyết định. Squalene có hai dạng
là dạng vòng và dạng không tạo vòng. Dạng không tạo vòng có tính kỵ nước hoàn
toàn và không tham gia vào màng sinh học. Nó bị thu hút do các nhóm giữa hai lớp
lipit, tích tụ ở đó và thực hiện nhiệm vụ chống oxy hóa, bắt giữ các gốc tự do [24].
Một số mô hình thí nghiệm đã chỉ ra rằng loại hydrocacbon như squalene khi
nằm ở giữa lớp màng lipit kép sẽ ức chế sự vận chuyển proton và việc này có thể
dẫn đến sự tiêu thụ không hiệu quả năng lượng tế bào [38]. Đặc biệt, các axit béo
không bão hòa đa nối đôi (bao gồm cả các thực phẩm có chứa lipit) dễ dàng bị oxy
hóa và quá trình trên có một vai trò quan trọng liên quan đến tính toàn vẹn của
màng sinh học. Thật tuyệt vời khi squalene có khả năng bảo vệ các axit linoleic,
linolenic, docosahexaenoic (DHA) và eicosapentaenoic (EPA) chống lại sự o xy
hóa phụ thuộc vào nhiệt độ [27].
Từ những năm 50s nhiều công bố đã cho thấy sự tạo vòng của squalene
với lanosterol để tạo thành oxydosqualene liên quan tới sự tổng hợp cholesterol
và hoạt động chống oxy hóa [95]. Ở một số điều kiện nhất định, squalene dạng
không vòng bị mất đi sự ổn định của nó và trở thành dạng vòng cùng với việc
vào màng tế bào do tính chất kị nước và có thể được vận chuyển trong tế bào nhờ
các protein chuyên chở squalene tổng hợp trong gan. Chính vì vậy, squalene đóng
vai trò quan trọng như một chất chống oxy hóa trong màng tế bào cũng như ở các
bào quan khác nhau trong tế bào.
Nhìn chung có thể nói squalene có khả năng bổ sung dưỡng khí cho tế bào,
có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa, bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương do
gốc tự do, tăng tốc độ tuần hoàn của máu, tăng khả năng tái sinh của tế bào, phòng
ngừa hiện tượng lão hóa của da và các cơ quan trong cơ thể, giúp cho làn da và cơ
thể hồi phục lại sức sống và nét thanh xuân.
1.2.2. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con ngƣời
1.2.2.1. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư
Squalene đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ chống lại một số chất
gây ung thư [83]. Năm 1996, Desai và các cộng sự của ông đã làm thử nghiệm trên
50 con chuột cái, gây thực nghiệm các khối u trên da bằng 7,12-dimethylbenz [a]
anthracene và 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Sau đó, chuột được điều trị
với 5% squalene đã làm giảm tỷ lệ mắc khối u ở nhóm này là 26,7% [26]. Squalene
có vai trò ngăn ngừa ung thư phổi trên chuột thực nghiệm cũng đã được công bố
[84]. Các nghiên cứu thực nghiệm đã cho thấy squalene có thể ức chế về mặt hóa
học một cách hiệu quả các khối u trên da ở loài gặm nhấm. Squalene cũng có vai trò
trong hóa trị liệu đối với ung thư tuyến tụy ở người. Việc bổ sung squalene vào
trong màng bụng để tăng cường chức năng của hệ thống lưới nội mô, đặc biệt là
kháng thế IgM đã cho thấy loài gặm nhấm cái có mang bướu thịt 180 có thể kéo dài
được sự sống của nó [66]. Hơn nữa, squalene cũng có tác dụng bảo vệ tế bào dựa
Nguyễn Cẩm Hà - K16
10
trên tế bào tạo máu đa năng có nguồn gốc từ tủy xương nhưng không bảo vệ được
các dòng tế bào của u nguyên bào thần kinh do cisplatin gây ra độc tính [25]. Khi
đó, squalene sẽ có hoạt tính bảo vệ đối với các tế bào bình thường trước những độc
tính do hóa trị liệu gây ra nhưng lại không bảo vệ được các tế bào ung thư.
farnesylpyrophosphate đã sửa chữa protein ras và các protein quan trọng khác ở
màng tế bào hay màng nhân. Nếu thiếu bước quan trọng này thì các gen gây ung thư
đã không bị hạn chế hoạt động. Một lượng squalene được bổ sung hàng ngày đã có
thể ức chế sản xuất isoprenoit trong các tế bào ung thư và ngăn chặn khối u phát
triển. Đây là bằng chứng khoa học giải thích cho khả năng chống ung thư của dầu o
liu đã được khám phá vào năm 2007.
1.2.2.2. Vai trò của squalene trong giải độc
Nhiều bằng chứng thực nghiệm cho thấy squalene có tác dụng hỗ trợ để loại
bỏ các chất độc ưa mỡ ra khỏi cơ thể. Squalene là một chất không phân cực, khi có
mặt nó thì những tương tác thuộc dạng không ion hóa sẽ xuất hiện [46].
Squalene có tác dụng tăng cường loại bỏ hexanchlorobenzen (HCB). Chế độ
ăn có bổ sung squalene (8%) đã làm tăng rõ rệt sự bài tiết HCB theo phân cao gấp 3
lần và thời gian đào thải giảm đáng kể (từ 34-38 ngày so với 110 ngày ở đối chứng)
ở chuột sau 3 tuần thí nghiệm [74]. Tuy nhiên, tác dụng hữu hiệu này của squalene
khi HCB có hàm lượng cao lại phụ thuộc vào loại mô nhưng sự khác biệt về tác
dụng nêu trên lại không đáng kể ở mô gan và máu.
Trong vấn đề giải độc, squalene được xem là một ứng cử tốt để làm giảm độc
tính các chất đi vào cơ thể một cách ngẫu nhiên. Ví dụ như ở mô hình động vật thực
nghiệm, người ta đã nhận thấy sự đào thải phylline và schychnine theo phân tăng
lên khi chúng ăn thức ăn có bổ sung squalene [46].
1.2.2.3. Đối với các bệnh khác
Squalene có chức năng giống với tế bào hồng cầu như hấp thụ oxy. Nó có
khả năng liên kết với nguyên tử hydro trong phân tử nước để tạo ra oxygen mới,
được máu vận chuyển đến các tế bào giai đoạn cuối trong cơ thể; tăng tác dụng
của tổ chức oxygen; kháng lại những căn bệnh gây ra do cơ thể thiếu hụt oxy;
đồng thời nâng cao khả năng chịu đựng của cơ thể, cải thiện chức năng tim, tăng
cường thể chất.
Hơn nữa, squalene có khả năng hỗ trợ chức năng gan và sự bài tiết của dịch
mật, làm giảm hoạt độ glutamatoxalo acetat transaminase (GOT)/glutamate
lượng phân tử thấp, phân bố khắp nơi trong các tế bào mô người, tập trung lớn
nhất trong bã nhờn của da (13%) (Bảng 1.2) [73].
Nguyễn Cẩm Hà - K16
13 Hình 1.3. Mặt cắt các tuyến bã nhờn ở da ngƣời
(http://simple.wikipedia.org/wiki/Sebaceous_gland)
Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở ngƣời [73]
Các thành phần bã nhờn
Thành phần (%)
Wax esters
25
Squalene
13
Cholesterol
2
Triglycerides, free fatty acids, and diglycerides
57
Các thành phần khác
3
bình của người Mỹ dao động 24-38 mg/2000 calo từ các thực phẩm khác nhau.
Để đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng về squalene trong các ngành dược
phẩm, công nghiệp, mỹ phẩm…đối với nhu cầu cuộc sống con người nên các nhà
khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu để có thể tách chiết và tinh sạch được
một lượng lớn squalene từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
1.3. Các nguồn khai thác squalene
Hiện nay, các viên dầu squalene trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc từ dầu
gan cá mập và dầu của các hạt thực vật. Nguồn truyền thống ban đầu được biết đến
là dầu gan cá mập. Với dầu gan cá mập, squalene là thành phần chính, chiếm tới
Copyright: Tài liệu đại học ©