ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THỊ BÍCH NGA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ
GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
TẠI VIỆT NAM ĐỂ TẠO NGUỒN NGUYÊN
LIỆU SẢN XUẤT VACXIN THẾ HỆ MỚI
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 30 15 THÁI NGUYÊN, 2012 1MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) do
2kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi. Hiện tại, năm 2011 và những tháng đầu năm
2012, cúm A/H5N1 bùng nổ với clade clade 2.3.2.1 xuất hiện mới tại Việt Nam, làm
cho tình hình dịch tễ quan hệ lây nhiễm và phòng chống bằng vaccine càng phức tạp
hơn.
Tìm hiểu sự thay đổi phân tử các vật liệu di truyền của virus cúm A/H5N1, đặc
biệt là đặc điểm phân tử phân đoạn gen kháng nguyên HA (type 5) và NA (type 1) ở
các chủng phân lập trên gia cầm tại Việt Nam trong giai đoạn 2004 đến nay là cần
thiết, nhằm đánh giá cấu trúc gen, khả năng tiến hoá của virus liên quan đến thay đổi
đặc điểm kháng nguyên để từ đó có thể đưa ra những dự báo về dịch tễ học ở mức độ
phân tử, định hướng sử dụng nguồn gen kháng nguyên để sản xuất và sử dụng vaccine
phòng bệnh cúm gia cầm thích hợp đạt hiệu quả.
Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 phân lập tại
Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới”.
2. Mục tiêu của đề tài
1- Giải mã toàn bộ phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 một số chủng virus cúm
A/H5N1 thu nhận tại một số địa phương của Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011.
2- Lưu giữ các gen H5 và N1 trong vector tách dòng để làm nguồn vật liệu cho
nghiên cứu tiếp theo làm nguyên liệu để tạo vaccine thế hệ mới.
3- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử các gen kháng nguyên H5 và N1, xác định
mối quan hệ phả hệ với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là công trình giải trình tự toàn bộ gen H5 và N1 theo cặp trong hệ gen của
từng chủng của virus cúm A/H5N1 đại diện của một số địa phương tại Việt Nam được
phân lập theo thời gian từ năm 2004 – 2011.
Các kết quả phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ trong nghiên cứu này cho
định được loại vaccine phù hợp cho công tác phòng chống dịch cúm gia cầm. 4CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM
1.1.1. Virus cúm và phân loại virus cúm
Virus cúm chủ yếu gây bệnh đường hô hấp ở người và động vật được phân
thành các nhóm:
1/ Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường tồn tại trong các loài vật (gia
cầm, ngựa, gà, vịt, ngỗng, ngan và các loài chim di cư hoang dã) sau đó tiếp xúc với
con người và gây bệnh cho loài người. Virus cúm A có thể gây nên những vụ dịch hoặc
những trận đại dịch toàn cầu.
2/ Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con người,
chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu.
3/ Nhóm virus cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn.
Ba nhóm virus cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc
kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên động
vật có xương sống. Virus cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein
hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF (hemagglutinin esterase fusion).
4/ Nhóm Thogotovirus gây bệnh cho động vật, người và động vật không xương
sống (muỗi, rận biển). Kháng nguyên bề mặt của Thogotovirus là GP (glycoprotein).
Virus cúm A được định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học của các
glycoprotein bề mặt HA và NA. Hiện nay, người ta đã xác định được 16 phân type HA
(H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9). Từ năm 1980, việc xác định phân type HA
đã được tiêu chuẩn hóa cho tất cả các virus cúm type A từ gia cầm, chim, ngựa và
người. Huyết thanh từ gia cầm và chồn sương phục hồi sau khi mắc bệnh và kháng thể
những năm 2001 - 2002. Tiếp tục trong năm 2002 - 2003, gen HA(H5) có những đột
biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift) để tạo nên
biến chủng có tính gây bệnh cao, đặc biệt đối với vịt, và có khả năng lây nhiễm sang
người [56]. Đặc tính thích ứng và gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng
với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập
xuống các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan [34], [45].
Tại Việt Nam, virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện từ năm 2001, nhưng đến cuối
năm 2004 mới chính thức được công bố [5], [7]. Virus H5N1 thể độc lực cao và H5N2, 6H9N3 thể độc lực thấp đã được phân lập ở ngỗng và vịt từ năm 2001 và 2003 [122].
Phân tích phả hệ cho thấy nhóm virus này không phải clade 1 thuộc phân dòng Quảng
Đông đã gây bệnh ở người vào cuối năm 2003 [71]. Tiến hóa chủng/phân type và phân
dòng tái tổ hợp mới thường xuất phát từ phía của Nam Trung Quốc [107], [118], [122].
Sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện về
đặc tính gây bệnh trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong
các năm 2004 - 2005 [107]. Tuy nhiên, xét về di truyền học phân tử và tính kháng
nguyên, các chủng virus H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng
nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng Đông [34] và bắt đầu
phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (Hình 1.1).
(Hình 1.2A).
Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã
không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E) nhưng thêm nhiều genotype kế tiếp,
bao gồm GD, A, B, C, D, E, X(X
0
-X
3
), V, Y, W, Z(Z
+
) và G, tiếp tục tiến hóa xuất hiện
và tồn tại 8 genotype của H5N1 (V, W, X
1
, X
2
, X
3
, Y, Z và Z+) [85].
Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh cao ở các nước Đông Nam Á là
bằng chứng của sự đột biến “lệch kháng nguyên” của virus cúm A/H5N1 [125].
Các chủng virus A/H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2004 - 2006 thuộc dòng
Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện thêm genotype G
nhưng được phân biệt thành 2 nhóm: dưới nhóm N (North) phổ biến ở phía Bắc Việt
Nam và dưới nhóm S (South) phân bố ở phía Nam [94], [107]. Từ năm 2001 đến 2007,
đã có 9 nhóm di truyền là VN1 – VN9 (genotype) xuất hiện hoặc xâm nhập vào Việt Nam,
được xác định dựa trên phân tích trao đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình thành
genotype [117] (Hình 1.2B), theo đó dựa trên thành phần H5 chúng thuộc vào các clade
khác nhau. 8
Hình 1.3 Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm A/H5N1 [45].
9Các nhóm di truyền và clade, cụ thể đó là: VN1, năm 2001 (clade 3), VN2, năm
2003 (clade 5), VN3, các năm 2003 – 2007 (clade 1), VN4, từ năm 2005 (clade 2.3.2),
VN5, năm 2005 (clade 0), VN6, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN7, từ năm 2007 (clade
2.3.4), VN8, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN9, từ năm 2007 (clade 2.3.4) [117]. Các
chủng thuộc clade 7, dòng Á - Âu đã được xác định ở Lạng Sơn năm 2007 - 2008 và
biến mất sau đó [95] và clade 2.3.2 xuất hiện từ 2009 đến nay [42], [117]. Một số
chủng virus chỉ xuất hiện rồi biến mất trong vòng một năm và chỉ trao đổi nguồn gen
trong quá trình tiến hoá (Hình 1.3), một số khác chỉ tồn tại vài năm rồi sau đó không
phát hiện được, số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như phân dòng 2.3.4 có
nguồn gốc từ Phúc Kiến và phân dòng 2.3.2 phát hiện năm 2009 có nguồn gốc từ vùng
hồ Thanh Hải (Trung Quốc) hiện nay có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng
biến đổi khác nhau.
Genotype Z phổ biến hầu hết các nước trong khu vực châu Á. Đặc điểm của
genotype Z là các gen NA và NS đều bị mất đoạn, và vùng chuỗi nối HA
Trung thay thế cho clade 2.3.4 trước đây [50, 123, 124] (Phụ lục 3).
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại
Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1. Clade 1.1 đã được
phát hiện ở gia cầm của Việt Nam tại phía Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia gây
chết 9/9 người từ cuối 2010 đến nay [123]. Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại
Việt Nam, virus cúm gia cầm A/H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm
và cộng đồng và là mối nguy cơ lại càng gia tăng khi vaccine hiện nay không có đáp ứng
miễn dịch đối với các chủng virus thuộc các clade mới xuất hiện năm 2011. Kết quả thí
nghiệm của Cục Thú y liên quan đến clade 2.3.2.1 xuất hiện năm 2011 cho thấy, sau
khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòng 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7
ngày. Như vậy nhóm virus này có độc lực cao với gà hơn đối với vịt (nhánh cũ có thể
gây chết 60 – 70% vịt) (http://www.cucthuy.gov.vn/)
Hiện tại chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người. Tuy
nhiên vấn đề chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 này, như
vậy, gia cầm hoàn toàn bỏ ngỏ không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus
cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ đáng lo ngại gây
bệnh trên người [124]. Do đó, việc quan trọng cần làm là phải tăng cường công tác
giám sát virus cúm ở gia cầm, chủ động áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích
hợp. Mục đích nhằm ngăn chặn sự lây truyền dịch ở gia cầm và ngăn chặn lây truyền
từ gia cầm sang người. 111.2. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA VIRUS CÚM A
1.2.1. Đặc tính cấu trúc chung
Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu
đường kính từ 50 - 100 nm (Hình 1.4A). Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm
và dài từ 200 - 300 nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài
liệu di truyền của virus vào bên trong tế bào. NA có chức năng thúc đẩy sự lắp ráp để
giải phóng virus từ các tế bào cảm thụ. Các glycoprotein HA và NA quyết định tính
kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type virus khác nhau và cũng là vị trí để các loại
thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt virus. Đồng
thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng nguyên
trong sản xuất vaccine. Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa
khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate
[91].
(A)
Hình 1.4 (A) Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi
điện từ truyền qua. (Nguồn: Dr. Erskine Palmer, Centers for Disease Control and Prevention
Public Health Image Library), (B) Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (hemagglutinin: phân tử
kháng nguyên HA, neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị
phức hợp enzym polymerase của virus), (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP
của virus cúm (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu
như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch
cúm trong lịch sử ở động vật và người [70], [121]. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh
chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật,
cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người
1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A
Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11
protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục,
nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho
một loại protein của virus.
Hai đầu 5' và 3' của RNA của hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn, đó là 5'-
AGUAGAACAAGG và 3'-UCG(U/C)UUUCGUCC [70]. Sáu phân đoạn (từ 1- 6)
mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho một loại protein riêng biệt, phân đoạn 7 và
8 mã hoá cho từng phần của gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và
mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối-ghép (splicing) sẽ
được dịch mã tổng hợp protein [70]. Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi
nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết hợp với 3 loại
polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của
virus.
Protein kháng nguyên bề mặt là HA thuộc protein màng type I liên quan đến sự
bám dính của virus và là thụ thể của virus, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà,
hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus. 14Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu
hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng
liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein.
Protein mang hoạt tính enzym là NA thuộc protein màng type II có chức năng
của một enzym cắt thụ thể để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào.
Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng
"gắn" vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình nhân lên
và giải phóng virus.
trình khởi đầu xâm nhiễm của virus. HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được
glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA
1
là 48
kDa và HA
2
là 29
kDa) [108], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type virus, đối với H5N1
là 1704 - 1707 bp, H7N1 là 1683 - 1695 bp, H9N1 là 1683 bp, H1N1 là 1701 bp.
Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử tính
toán là 56
kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp [70].
Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA là các gai hình nấm
trên bề mặt của virus, NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym phân
cắt liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan truyền
virus trong tế bào chủ. NA có trọng lượng phân tử theo tính toán 50 kDa (thực tế: 48 -
63
kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350 – 1410 bp [32].
Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và
M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao gói
và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus. Tiểu phần M2 là protein nội màng, có
chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính toán
của M1 là 28 kDa (thực tế: 25
kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M
có độ dài khoảng 1027 bp [63].
Phân đoạn 8 là gen NS có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A, mã hoá
Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hemagglutinin (lipid bilayer of envelope: Lớp màng bao lipid kép,
4 Major antigenic variable regions: 4 vùng biến đổi kháng nguyên chính, Receptor site: vị trí
gắn với receptor) [116].
Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm 3 đơn
phân (trimer) (Hình 1.5), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị
HA
1
(36 kDa) và HA
2
(27 kDa). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa
(glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA
2
, phần đầu tự do hình
chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA
1
chứa vị trí gắn thụ thể thích hợp của HA trên
bề mặt màng tế bào đích [27].
Gen HA gồm 2 đoạn là HA
1
và HA
2
nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã
hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm
cắt của protease. Đây là vùng quyết định độc lực của virus hay tính gây bệnh của
H5N1. Phần HA
1
và HA
H5 của virus gây bệnh ở gà và H9 ở lợn, cũng như H5 của virus thích ứng gây bệnh
trên người cho thấy : virus cúm gà thích hợp với loại tế bào có thụ thể HA chứa acid
sialic liên kết với đường galactose góc quay α-2,3, trong khi ở lợn và người virus cúm
có thụ thể thich hợp ở góc quay α-2,6. Vị trí amino acid 226 (aa 226) của tiểu đơn vị
HA
1
được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu. Ở hầu hết
các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ
thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của
galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật
chủ tự nhiên của virus cúm A). Ở các chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2
gây bệnh ở người, vị trí này trên protein HA là leucine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6
sialic acid có mặt ở tế bào biểu mô đường hô hấp dưới của người [108]. Các tế bào cảm
thụ với virus cúm A của lợn có cả hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ
trung gian để virus cúm A tiến hóa thích ứng lây nhiễm sang người [108]. 18Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: glutamine 222, glycine 224, hay cấu
trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với
thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ [73]. Đặc biệt, một số chủng virus
cường độc A/H5Nx, A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi
chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia
cầm nhiễm bệnh) [25], [68].
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như
các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các
chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA [73]. Protein HA kích
thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia
thường là -RRRKK- [39], [86] còn ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến (Fujian-like
sublineage) các amino acid của vùng chuỗi nối là -RRRK- [6], [9].
Mức độ gây bệnh của virus cúm A còn phụ thuộc rất lớn đến chức năng
hoạt động của vùng tiếp nhận enzym protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic
acid [108]. Virus cúm A không có gen tổng hợp enzym protease, mà phải nhờ vào
hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus. Càng có điểm cắt protease hoàn chỉnh và
cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzym tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh
chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều virus mới và
mức độ gây bệnh cũng vì thế mà nặng nề hơn. Khi cơ thể gia cầm bị đa nhiễm
nhiều vi khuẩn, đặc biệt là tụ cầu khuẩn Staphylococcus và liên cầu khuẩn
Streptococcus, thì hoạt động tương tác gây bệnh của virus cúm A càng mạnh mẽ
hơn, do các loại cầu khuẩn này có nhiều protease trợ giúp cho virus cúm trong
quá trình thực hiện cắt hemagglutinin khỏi thụ thể để gây bệnh [35].
1.3.2. Protein neuraminidase (NA)
Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là
một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus
cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [24], [116]. Phân
tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu đơn vị
giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid
[32], [116].
Protein NA có 3 chức năng chính:
- NA cắt sialic acid ra khỏi phân tử HA và cắt những phân tử NA khác ra khỏi
các glycoprotein và glucolipit ở bề mặt tế bào, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong
cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Virus
cần phải có NA thì mới có thể xâm nhập được qua lớp màng mucin của biểu mô hô
hấp. Hai phân type N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người liên quan đến các đại
dịch cúm trong lịch sử [34].
60 nucleotide (mã hoá cho 20 amino acid) tại vùng đầu tận cùng N của protein 21neuraminidase. Sự đột biến ‘‘xoá gen’’ kiểu này của N1 có liên quan đến tính thích
ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86].
Gen N1 của virus cúm A/H5N1 đã trải qua nhiều giai đoạn tiến hoá cho đến khi
hình thành thể độc lực cao HPAI thì độ dài của gen chỉ còn lại 1350 nucleotide so với
gen N1 trước đó có độ dài 1410 nucleotide. Trong hệ gen của virus cúm A, chức năng
của gen NA chịu trách nhiệm trong quá trình tổng hợp neuraminidase.
Gen NP chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp nucleoprotein (giúp phân biệt 3
loại A, B, C). Gen M chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp matrix protein.
Gen NS chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp protein không cấu trúc (non-
structural protein). Các gen còn lại là PA, PB1, PB2 là các thành phần tạo nên các
RNA polymerase.
Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích
chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở nghiên
cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm
ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [118].
Phân tích hệ gen của các phân lập cúm gia cầm A/H5N1 cho thấy NA, HA và
NS1 thường biến đổi nhất trong hệ gen của virus cúm gia cầm [96]. Biến đổi trượt xóa
amino acid trong protein NA vùng cuống (NA-stalk) có thể làm thay đổi đặc tính sinh
học của virus cúm A/H5N1 dẫn đến mở rộng phạm vi vật chủ cảm nhiễm [119].
1.4. CÁC YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH ĐỘC LỰC
Trong đa số trường hợp độc lực virus do nhiều gen quyết định, nhưng một gen
(hoặc đột biến trong một gen) cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến độc lực của chúng.
Chuỗi nối giữa HA
1
chủ mới, cũng như sự lây truyền giữa các loài [72], [107]. Protein PB1-F2, được tạo
thành bởi một khung đọc mở của gen PB1 của virus cúm A, đã làm gia tăng độc lực
của virus trên chuột [127]. Protein PB1-F2 làm tăng độc lực của virus cúm A do gây
chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các đại thực bào, do đó làm giảm đáp ứng
miễn dịch của cơ thể vật chủ đối với sự lây nhiễm của virus cúm A [37].
1.5. CÁC PHƯƠNG THỨC BIẾN ĐỔI KHÁNG NGUYÊN
Đặc tính cơ bản của virus cúm A là hệ gen luôn biến đổi, sự thay đổi kháng
nguyên theo thời gian tồn tại giúp cho virus lưu hành rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều
loài vật chủ khác nhau [91].
Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [125].
1.5.1. Hiện tượng «lệch kháng nguyên»
«Lệch kháng nguyên» (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra
trong các phân đoạn gen/hệ gen của virus, chủ yếu là ở phân đoạn 4 của phân đoạn HA 23(Hình 1.6). Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản
sao” (proof-reading) trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích, cho nên
sự thiếu hụt enzym sửa chữa RNA dẫn đến các enzym sao chép phụ thuộc RNA sẽ có
thể thêm nucleotide (đột biến thêm), làm mất đi (đột biến xoá) hoặc thay thế (đột biến
điểm) [12] một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA
chuỗi đơn mới trong quá trình nhân lên của virus [41], [91].
Hình 1.7 Minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift)
của virus cúm A [88]
Hiện tượng này xảy ra như sau : Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của
virus cúm A được hai chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào
có thể trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap)
các phân đoạn gen giữa hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại thành một hệ gen
mới, tạo ra các dạng khác nhau của RNA hệ gen ở các hạt virus mới sinh ra, hỗn hợp từ
thành phần các phân đoạn của hệ gen từ những virus ban đầu. Kết quả là tạo ra thế hệ
virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây
nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh [35], [61], [85].
1.5.3. Hiện tượng glycosyl hoá
Thông thường, các virus cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng có mức độ
đột biến điểm cao làm thay thế một số nucleotide tại những vị trí mà ở đó có thể tạo
nên các amino acid mới có khả năng tiếp nhận carbon hydrate tạo nên hiện tượng
glycosyl hoá (glycosylation). Hay nói cách khác, ở virus cúm A (và A/H5N1), glycosyl
Copyright: Tài liệu đại học ©