1
MỞ ðẦU

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI
Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc ñộ lây
lan nhanh, với tỷ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân
týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ
Orthomyxoviridae gây ra. Bệnh gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành
chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm từ ñộng
vật sang người.
Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần ñầu tiên tại Việt
Nam năm 2003. Trong một thời gian rất ngắn, bệnh ñã lây lan trên toàn
bộ ñất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn
cho nền kinh tế quốc dân; và từ ñó ñến nay bệnh xảy ra liên tục trở thành
một vấn ñề dịch tễ phức tạp cần giải quyết tại nước ta.
Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến ñổi, tái tổ hợp biến chủng và
thay ñổi cấu trúc kháng nguyên ñể thích ứng gây bệnh. Trình tự nucleotide hệ
gen là cơ sở ñể xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các biến chủng
virus cúm A/H5N1. Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung cấp thông
tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những biến
chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.
Thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide
và amino acid có thể xác ñịnh những vùng gen thường biến ñổi, vùng gen
ổn ñịnh làm cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1
xuất hiện từ những năm ñầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại
vaccine thích hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm.
ðể có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ
ñó làm cơ sở dữ liệu cho những nghiên cứu về gen/hệ gen của virus cúm
A/H5N1 và nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứng dụng
trong chẩn ñoán và phòng bệnh, chúng tôi tiến hành ñề tài: Nghiên cứu hệ
gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang.

ñóng góp dữ liệu cho ñối chiếu với các vaccine sử dụng tại Việt Nam.
(4) ðã khảo sát và xác ñịnh ñược các cặp mồi sử dụng có hiệu quả ñể
thu nhận và giải trình tự hệ gen của virus cúm A/H5N1 thuộc những phân
dòng lần ñầu tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN:
luận án gồm 159 trang (không kể phần phụ
lục), chia thành các phần như sau: Mở ñầu (3 trang), Chương 1: Tổng
quan tài liệu (52 trang), Chương 2: Nội dung, nguyên liệu và phương
pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
(66 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Các công trình ñã công bố liên
quan ñến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (21 trang). Luận án có 31
bảng biểu, 28 hình minh họa. Tổng số tài liệu tham khảo là 170, gồm 32
tài liệu tiếng Việt, 138 tài liệu tiếng Anh (có 3 trang web).
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM
Cúm gia cầm (avian influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, do
nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. ðây là nhóm virus
có biên ñộ chủ rộng, ñược phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa
trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm
virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 ñến H16) và 9 phân type NA (từ
N1 ñến N9).
Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể ñộc lực cao
xuất hiện ở vùng Quảng ðông, Trung Quốc năm 1996 và ñã lan ra hơn 60
nước trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi, ñược chứng minh là có
khả năng lây nhiễm từ ñộng vật sang người. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1
lần ñầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003, từ ñó ñến nay
bệnh xảy ra liên tục, ñang là vấn ñề dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều
phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải giải quyết tại nước ta.

- Phân ñoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hoá cho
protein ñệm (matrix protein) gồm hai tiểu phần là M1 và M2 ñược tạo ra
bởi những khung ñọc mở khác nhau của cùng một phân ñoạn RNA.
- Phân ñoạn 8 (gen NS) là gen mã hoá protein không cấu trúc, có ñộ
dài ổn ñịnh nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp,
mã hoá tổng hợp hai protein là NS1 và NS2.
Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1) có hệ gen ñược cấu trúc
từ 8 phân ñoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA,
tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các ñột biến ñiểm trong các phân
ñoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao ñổi
các phân ñoạn gen giữa các chủng virus cúm ñồng nhiễm trên cùng một tế
bào, rất có thể dẫn ñến thay ñổi ñặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng
virus cúm A mới.
1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM
A/H5N1 TẠI VIỆT NAM
Nghiên cứu ñặc tính sinh học phân tử (ñịnh týp, biến ñổi di truyền và gen
học tiến hoá) của virus gây bệnh cúm gia cầm H5N1 ñược các cơ quan
nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng ñầu tiên xảy ra dịch
cúm gia cầm cuối năm 2003. Các chuỗi gen giúp xác ñịnh phân týp H5, phân
týp N1 và các gen cấu trúc ñã ñược Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Trung tâm chẩn
ñoán thú y trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen.
Các nhà khoa học Việt Nam kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế
giới xây dựng các phương pháp chẩn ñoán, phát hiện nhanh virus gây
bệnh, phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác,
cũng như phân biệt các phân týp HA và NA. Các phương pháp phát hiện
nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác bao gồm việc sử dụng
kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử cũng ñã ñược xây
dựng. Các nhà khoa học Việt Nam ñã có những ñóng góp nhất ñịnh trong
lĩnh vực nghiên cứu vaccine và miễn dịch. Những chế phẩm kháng nguyên,

ñộc cúm A/H5N1 thu nhận từ gà bị bệnh tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu
chủng: A/Ck/Vietnam/HG4/2005(H5N1), viết tắt CkHG4). Bệnh phẩm ñã
ñược vô hoạt ở nhiệt ñộ 100
o
C trong 30 giây, ñảm bảo an toàn sinh học, bảo
quản ở -20
o
C cho ñến khi sử dụng ñể tách RNA tổng số.
2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN) ñể tách
RNA tổng số theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.5.2 Phương pháp RT-PCR
Chúng tôi sử dụng phản ứng RT-PCR một bước (QIAGEN) ñể thu
nhận các phân ñoạn gen của virus cúm A/H5N1.
6
2.5.3 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR
Sản phẩm RT-PCR ñược kiểm tra bằng cách ñiện di ở 100-120V, 400
mA trong 25-30 phút trên thạch agarose 1%. Chỉ thị DNA sử dụng trong
nghiên cứu là DNA thực khuẩn thể Lamda, có kích thước 43 kb, ñược
cắt bằng enzym giới hạn HindIII.
2.5.4 Phương pháp dòng hóa
Sản phẩm PCR/RT-PCR tinh sạch ñược dòng hóa vào vector là pCR2.1
hay pCR2.1TOPO (Invitrogen).
2.5.5 Phương pháp giải trình tự
Sản phẩm giải trình tự sau khi tinh sạch, ñược ñông khô và ñọc trình
tự trên máy tự ñộng ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ).
2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản ñồ chromatogram của
chuỗi nucleotide thô bằng chương trình SeqEd1.03, sau ñó sử dụng chương

PB2F-PB2R1), và phần sau của phân ñoạn 1 có ñộ dài khoảng 1,4 kb (cặp
mồi PB2F3-PB2R).

DNA plasmid tái tổ hợp sau ñó ñược giải trình tự, sắp xếp nối chuỗi và
phân tích bằng các chương trình tin-sinh học chuyên biệt, chúng tôi thu ñược
chuỗi DNA của gen PB2 gồm 2280 nucleotide.
3.1.4 Giải trình tự gen PB1
Phân ñoạn 2 (gen PB1) của chủng CkHG4 ñược nhân lên bằng phản
ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số, bằng 2 phản ứng sử dụng 2
cặp mồi PB1F1-PB1R2 và PB1F3-PB1R3. Phản ứng RT-PCR với cặp
mồi PB1F1-PB1R2 cho ñoạn DNA sản phẩm (ñầu phân ñoạn) có ñộ dài
1,7 kb. Kết quả phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi PB1F3-PB1R3 cho
sản phẩm 0,75 kb (cuối phân ñoạn), tổng ñộ dài của toàn bộ phân ñoạn 2
khoảng 2,35 kb ñã ñược thu nhận.
Các DNA plasmid tái tổ hợp ñược giải trình tự và chuỗi DNA của
phân ñoạn 2 chủng CkHG4 thu ñược chứa toàn bộ gen PB1 gồm 2274 bp.

3.1.5 Giải trình tự gen PA
Phân ñoạn 3 (gen PA) ñược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số
bằng các phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi thiết kế cho gen PA. Sản
phẩm cuối cùng của phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi PAF-PAR là phần
ñầu của phân ñoạn 3 có ñộ dài khoảng 0,75 kb; với cặp mồi PAF2-PAR2 là
phần giữa của phân ñoạn có kích thước khoảng 1,2 kb và với cặp mồi
PAF3-PAR3 là phần sau của
phân ñoạn có ñộ dài khoảng 0,73 kb; tổng ñộ
dài của toàn bộ phân ñoạn 3 thu nhận ñược là khoảng 2,23 kb.
DNA plasmid tái tổ hợp của các clone ñược giải trình tự và thu ñược
chuỗi DNA của gen PA gồm 2151 nucleotide.
3.1.6 Giải trình tự gen NP
Phân ñoạn 5 chứa gen NP của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4

- Chuỗi nucleotide và polypeptide gen H5 chủng CkHG4 có cùng
kích thước với gen tương ứng của các chủng thuộc phân dòng Quảng
ðông là 1707 bp và 568 amino acid so với 1704 bp (thiếu hụt 3
nucleotide) và 567 amino acid (thiếu hụt 1 amino acid) của các chủng
phân dòng Phúc Kiến.
- Chủng CkHG4 có tổng cộng 363 vị trí sai khác nucleotide với các
chủng so sánh, chủ yếu là ñột biến ñồng hoán (transition) (ñột biến xảy ra
giữa các base trong cùng nhóm purine hay pyrimidine với nhau, giữa A và G
hoặc C và T).
- Gen H5 của chủng CkHG4 có 15 vị trí sai khác nucleotide với hầu
hết các chủng so sánh và 10 nucleotide sai khác so với các chủng cùng phân
lập ở vùng Hậu Giang (thứ tự 2-5) tại các vị trí 159, 415, 445, 582, 676, 677,
933, 945, 1170 và 1494.
Trong tổng số 363 sai khác về nucleotide của chủng CkHG4 với các
chủng so sánh có một số sai khác không làm thay ñổi amino acid, nhưng
một số sai khác ñã làm biến ñổi bộ mã của amino acid dẫn ñến thay ñổi
amino acid tại 104 vị trí. Do ñó có thể ảnh hưởng ñến tính kháng nguyên -
miễn dịch và tính gây bệnh của các chủng ñó.
- Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 có 5 vị trí sai khác về
amino acid với tất cả các chủng so sánh tại các vị trí: F11V, I242M,
9
R275K, T325N và V512A (
Bảng 3.1).
- Thành phần chuỗi polypeptide nối giữa HA
1
và HA
2
của chủng
CkHG4 bao gồm các amino acid RRRKK, và motif này không biến ñổi
qua các năm 2003–2009 ở hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng

F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
13
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
14
F V V V S K S I R M E K T L M N R A I
15
F V V V S K S M R M E K T L V N R A I
16
L I A N N N N L K M D K A L I N R A T
17
L T A N E R D L K M E K T L M N K S T
18
L T A N D R D L K M E K T L V N R S T
19
L V A N D T N L K M D K A V I N K A T
20
L V A N D T N L K M D K A V I N K A T
21
I V A N D S N L K M D K A V M N K A T
22
L I A D D V N L K M D K A V I N K A T
23
L I A N D V N L K M D K A V I N K A T
24
L V A N D S N L K M D K A V M N K A T
25
F V A N D N N L K I D K T V M N K A T
26
L V A N D T N L K M D K A V M N K A T
27

amino acid, chủ yếu là do có sự biến ñộng lớn giữa các chủng phân lập
năm 2003-2007 với 3 chủng phân lập năm 2008-2009.
- So sánh các chủng phân dòng Phúc Kiến với nhau, tỷ lệ ñồng nhất
nucleotide biến ñộng rất lớn (94-99%); tương tự, tỷ lệ tương ñồng amino
acid cũng phản ánh ñúng mức ñộ biến ñổi lớn (94-100%).
- Tỷ lệ ñồng nhất nucleotide và tương ñồng amino acid của các chủng
phân dòng Quảng ðông so với các chủng phân dòng Phúc Kiến là rất thấp,
90-96% về nucleotide và 88-96% về amino acid.
3.2.1.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
Gen hemagglutinin HA (H5) thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào
phân tích phả hệ cùng với 54 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới phân lập qua các năm 1996-2011 (
Hình 3.1).
Hình 3.1 cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với
các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở phía Nam của Việt Nam giai ñoạn
2004-2007, ñó là: Ck-VN-DT-171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04
(DQ099758), Dk-VN-HG680F-05 (ISDN230184), Ck-VN-LA636-05
(ISDN230180), Dk-VN-1231-05 (CY029519), Dk-VN-1771-05
(CY029551), Ck-VN-29-07 (CY029631); và một số chủng phân lập từ
Thái Lan là Ck-TL-NIAH7618-04 (AB450562), Ck-Uthaithani-05
(FJ265572), Ck-TL-CU-354-08 (CY047457). ðiều này cho phép nhận xét,
có thể các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang, ðồng Tháp, Tiền
Giang, Long An, Sóc Trăng là có cùng nguồn gốc và thuộc nhóm di
11
truyền 1 (clade 1). ðây là các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông,
genotype Z.
Hình 3.1 cũng cho thấy, các chủng phân lập ở phía Nam của Việt
Nam giai ñoạn 2008-2011, bao gồm Dk-VN-VL-NCVD080162-08, Dk-
VN-CT-NCVD-361-09, Ck-VN-ST-R6-2-10, Ck-VN-TG-R6-2819-11
cũng tạo thành một nhóm kháng nguyên phụ khác, ñược xác ñịnh thuộc

Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-VL-NCVD080162-08
Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-CaMau498-06
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-36-04
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-DT-171-04
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09

55
100
88
100
99
54
61
100
68
71
98
99
90
99
70
39
35
30
41
98
39
47
95
72
71
90
77
42
47
86

Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-VL-NCVD080162-08
MDk-VN-OIE-559-11
Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Dk-VN-CaMau498-06
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-DT-171-04
Ck-VN-36-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08

98
82
51
27
48
40
23
39
88
65
50
32
80
58
43
61
81
65
57
21
24
31
62
74
21
79
28
31
59
60

Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-CaMau498-06
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-36-04
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-DT-171-04
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09
A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11

88
100
99
54
61
100
68
71
98
99
90
99
70
39
35
30
41
98
39
47
95
72
71
90
77
42
47
86
95
85

Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-CaMau498-06
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-36-04
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-DT-171-04
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09
A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11

88
100
99
54
61
100
68
71
98
99
90
99
70
39
35
30
41
98
39
47
95
72
71
90
77
42
47
86
95
85

MDk-VN-OIE-559-11
Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Dk-VN-CaMau498-06
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-DT-171-04
Ck-VN-36-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08
Ck-Fujian-584-06
Dk-TL-KU-56-07

51
27
48
40
23
39
88
65
50
32
80
58
43
61
81
65
57
21
24
31
62
74
21
79
28
31
59
60
76
61

Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Dk-VN-CaMau498-06
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-DT-171-04
Ck-VN-36-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08
Ck-Fujian-584-06
Dk-TL-KU-56-07
Dk-PhuTho-07-92-07
Dk-VN-50-07

48
40
23
39
88
65
50
32
80
58
43
61
81
65
57
21
24
31
62
74
21
79
28
31
59
60
76
61
46
35

giới phân lập qua các năm 2003-2009.
Bảng 3.2: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1
giữa 27 chủng virus cúm
Vị trí sai khác về amino acid
Chủng
17 26 39 56 64 75 80 233 250 320 434
1
T V H N K N Y H N S G
2
T V H T K N Y H D S G
3
T V H N K N Y H D S G
4
T V H T K N Y H D S G
5
T V H T K N Y H D S G
6
T V H T K N Y H N S G
7
T L H T K N Y H D S G
8
T V H T K N Y H D S G
9
T I H T K N Y H D S G
10
T I H T K N Y H D S G
11
T V H T K N Y H D S G
12
T V N T K N Y H D S G

Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5 là các chủng phân lập ở
vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng
của thế giới.
Kết quả so sánh cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 262 vị trí sai khác
về nucleotide với các chủng so sánh. Các ñột biến chủ yếu xảy ra ở vùng 5’
của gen N1 và hầu hết là các ñột biến ñồng hoán (A↔G hoặc C↔T). Chủng
13
CkHG4 chỉ có 4 nucleotide sai khác với phần lớn các chủng Việt Nam và thế
giới ở các vị trí: 30, 167, 748 và 867. Trong ñó, sai khác ở 2 vị trí 167 và 748
là có dẫn ñến sai khác amino acid.
Các sai khác về nucleotide ñã làm biến ñổi tổng cộng 91 amino acid giữa
chủng CkHG4 với các chủng so sánh. Các biến ñổi lớn chủ yếu tập trung ở
vùng tận cùng N của 80 amino acid ñầu tiên. Mười một vị trí có biến ñổi lớn
về amino acid giữa các chủng so sánh ñược trình bày ở Bảng 3.2. Chuỗi
polypeptide N1 của chủng CkHG4 chỉ có 2 amino acid sai khác với phần lớn
các chủng so sánh ở 2 vị trí N56T và N250D (tương ứng với 2 vị trí sai khác
về nucleotide 167 và 784 trong gen N1).
Phân tích ñặc tính glycosyl hoá của protein N1 ở các chủng cúm
A/H5N1
Kết quả phân tích ñặc tính glycosyl hóa cho thấy, chuỗi polypeptide N1
của chủng CkHG4 và 26 chủng so sánh cùng có 3 vị trí glycosyl hóa. Vị trí I
có motif là NSS (amino acid 68-70), vị trí II là NGT (amino acid 126-128)
và vị trí thứ III là NGS (amino acid 214-216). ðiều này chứng tỏ, không có
sự biến ñổi vị trí có tiềm năng glycosyl hóa trong protein N1 ở các chủng
cúm A/H5N1 phân lập trong các năm 2003-2009.
3.2.2.2 Phân tích ñột biến “trượt–xoá” gen N1 qua thời gian tiến hóa
41 chủng virus cúm A/H5N1 phân lập trong 50 năm qua, trong ñó có
chủng CkHG4 do chúng tôi giải trình tự gen N1, ñược ñối chiếu so sánh
về thành phần nucleotide và amino acid của gen N1.
Các chủng so sánh ñược phân thành 3 nhóm chính: (i) nhóm các

(DQ094286), VN-HG-207-05 (DQ094292), Ck-VN-CT-018-04
(DQ094280). ðiều này cho thấy, các chủng cúm A/H5N1 từ người và gia
cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long là có cùng
nguồn gốc, hoàn toàn giống như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử
dụng gen H5.
3.2.3 Phân tích gen PB2
3.2.3.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Gen PB2 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2280 bp, mã hóa cho 759
amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Trình
tự nucleotide và amino acid của gen PB2 ñược so sánh với 26 chủng cúm
A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2004-2009.
Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 455
nucleotide sai khác với các chủng so sánh. Chủng CkHG4 có 3 nucleotide
sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 365, 580, 2080; và cả
3 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi amino acid.
Sai khác về nucleotide giữa chủng CkHG4 với các chủng so sánh dẫn
ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 82 vị trí. Trong số ñó,
mười ba vị trí sai khác lớn ñược liệt kê ở
Bảng 3.3. Chủng CkHG4 có 3
amino acid sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí A122V,
K194Q và L694F (Bảng 3.3), tương ứng với 3 vị trí ñột biến nucleotide
15
như ñã phân tích ở trên.
Vị trí amino acid 627 ở protein PB2 ñược cho là có liên quan ñến tính
thích nghi nhiệt ñộ cơ thể loài vật chủ và ñộc lực của virus. Ở virus cúm
gia cầm vị trí này là glutamic acid (E), còn ở virus thích nghi trên người
là lysin (
Wasilenko và cs, 2008) [155]. Các chủng virus H5N1 ñộc lực cao
ñối với ñộng vật có vú, thành phần amino acid của PB2 có chứa lysin (K) ở
vị trí 627 hoặc tổ hợp 627E/701N (

T T V T Q V T H Q N P V F
12
A A V I Q V K H R D T I F
13
A A V I Q I K Y R D T I F
14
T T V T Q V T H Q N P V F
15
T T V I Q V K H R D P V F
16
A A V I Q I K Y R D T I F
17
A A V I Q I K Y R D T I F
18
T T V T Q V A H Q N P V F
19
T T V V Q V K H R D P V F
20
T A V I Q V T H R D P V F
21
T T V T Q V T H Q N P V F
22
T T V T Q V T H Q N P V F
23
T A V I Q V T H R D P V F
24
T T V T Q V T H Q N P V F
25
T T V T Q V T H Q N P V F
26

nucleotide của
PB1, từ vị trí 95 ñến 367 là PB1-F2, có ñộ dài 273 bp bao gồm 90 amino
acid, khởi ñầu bằng bộ ba ATG và kết thúc bằng bộ ba TGA. Trình tự
nucleotide và amino acid gen PB1 và PB1-F2 ñược so sánh với 26 chủng
A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009.
Kết quả phân tích cho thấy, gen PB1 của chủng CkHG4 có tổng cộng
428 vị trí sai khác về nucleotide với các chủng so sánh. Những thay ñổi
về nucleotide dẫn ñến sai khác về amino acid ở 62 vị trí, trong ñó có 8 vị
trí sai khác lớn. Chủng CkHG4 có sai khác hoàn toàn 4 amino acid trên
protein PB1 so với tất cả các chủng, cụ thể ở các vị trí
R206G, S306N,
M323T, L631F.
Gen PB1-F2 của chủng CkHG4 có tổng cộng 52 nucleotide (trong ñó
có 1 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng của Việt Nam và thế giới ở
vị trí 131) và 41 amino acid sai khác với các chủng so sánh.
17
Chuỗi polypeptide PB1-F2 của chủng CkHG4 chỉ có một amino acid
sai khác so với hầu hết các chủng ở vị trí
K44R.
3.2.4.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid
Kết quả phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid gen PB1 và PB1-F2 của chủng CkHG4 cho thấy:
ðối với gen PB1: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng
cao so với các chủng Việt Nam giai ñoạn 2004-2007, 97-99% về
nucleotide và 98-99% về amino acid. ðối với các chủng của thế giới, mức
ñộ ñồng nhất và tương ñồng dao ñộng lớn hơn, tỷ lệ tương ứng là 91-98%
và 97-99%.
ðối với gen PB1-F2: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide
và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang theo thứ tự
tương ứng là 99-100% và 97-100%, với các chủng Việt Nam khác là 97-

. Mặc dù
chủng CkHG4 có ñến 11 nucleotide sai khác với các chủng miền Bắc và
thế giới, nhưng những sai khác này chỉ làm thay ñổi thành phần amino
acid ở một số chủng.

Nghiên cứu gần ñây cho thấy, các ñột biến T515A trong PA và Y436H
trong PB1 ñã làm mất tính gây bệnh của virus H5N1 (
Hulse-Post và cs,
2007
) [82], nhưng chỉ ñột biến riêng lẻ ở các amino acid này thì không ảnh
hưởng ñến ñộc lực của virus. Trong thành phần amino acid của chủng
CkHG4 và tất cả các chủng A/H5N1 lựa chọn so sánh, threonin (T) ở vị trí
515 phát hiện không biến ñổi qua các năm 2003-2009.
3.2.5.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid
Kết quả phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid cho thấy:
- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các
chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 98-99% về
thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid.
- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng biến ñộng lớn hơn
khi so với các chủng của Việt Nam. Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 92-
99% và tương ñồng amino acid là 96-99%; trong ñó với các chủng miền
Bắc là 92-97% và 96-98% (theo thứ tự tương ứng), với các chủng miền
Nam là 98-99% (cả 2 thành phần).
- ðối với các chủng thế giới, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về
nucleotide là 90-97%, tương ñồng về amino acid là 96-98%.
3.2.5.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 tập hợp trong
cùng một nhóm với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam:

với các chủng khác của Việt Nam. Nếu so với các chủng của thế giới thì
các tỷ lệ tương ứng sẽ là 92-97% và 98-99%.
Xét một cách tổng thể, mức ñộ ñồng nhất về thành phần nucleotide và
tương ñồng về thành phần amino acid của gen NP chủng CkHG4 với các
chủng Việt Nam và thế giới là tương ñối cao, ñặc biệt là thành phần amino
acid.
3.2.6.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Gen NP thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ
cùng với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích
cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền
Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792), Ck-
VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các
chủng A/H5N1 từ người và gia cầm các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu
20
Long có cùng nguồn gốc.
3.2.7 Phân tích gen M
3.2.7.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Toàn bộ gen M thu nhận từ chủng CkHG4 có kích thước 982 bp, mã
hóa cho 2 chuỗi polypeptide M1 và M2. Gen M1 có ñộ dài 759 bp (từ
nucleotide ñầu tiên ñến nucleotide 759), mã hóa cho 252 amino acid, khởi
ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen M2 có kích
thước 294 bp bao gồm 97 amino acid, bắt ñầu bằng bộ mã ATG và kết
thúc bằng bộ mã TAA. Gen M1 và M2 có chung 27 nucleotide ñầu 5’ của
vùng mã hóa và gen M2 ñược tạo ra do nối 27 nucleotide này với 267
nucleotide từ vị trí 716 trở về sau cho ñến nucleotide 982.
Trình tự nucleotide gen M1 và M2 ñược so sánh, phân tích với 26
chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-
2009. Kết quả phân tích cho thấy:
- Gen M1 của chủng CkHG4 có tổng cộng 87 nucleotide sai khác với
các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi tổng cộng 12 amino acid trong chuỗi

là I26, V27, A30 và N31. Như vậy là ñã có ñột biến ở vị trí 31 (S→N)
trong protein M2 của chủng CkHG4, và ñột biến này có thể làm cho virus
ñề kháng với amantadine.
3.2.7.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid
Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương
ñồng về amino acid cho thấy:
- Gen M1 của chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng với
các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là rất cao, 98-99% về
thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid; so với các
chủng khác của Việt Nam thì tỷ lệ này là 96-99% và 98-99%; so với các
chủng của thế giới thì các tỷ lệ tương ứng là 96-98% và 96-99%.
- Gen M2 chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về thành phần nucleotide
và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang tương ứng là
99% và 97-98%, với các chủng khác của Việt Nam là 97-99% và 89-98%,
với các chủng của thế giới là 94-98% và 90-97%.
3.2.7.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Gen M thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ
cùng với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
Kết quả phân tích
cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền
nam Việt Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04
(DQ099792), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), Ck-VN-CT-018-04
(DQ094258) tạo thành một nhóm, chứng tỏ gen M của các chủng
A/H5N1 từ người và gia cầm các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có
thể có cùng nguồn gốc.

3.2.8 Phân tích gen NS
3.2.8.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Gen NS thu nhận từ chủng CkHG4 mã hoá cho 2 chuỗi polypeptide

phân lập ở miền Bắc và thế giới, tuy nhiên các sai khác này không làm
biến ñổi thành phần amino acid.
Nhằm tìm hiểu kỹ hơn sự biến ñộng thành phần nucleotide và amino
acid của gen NS, chúng tôi tiến hành so sánh chủng CkHG4 với một số
chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới qua các năm 1996-2009. Gen NS
của chủng CkHG4 và một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập sau năm
2000 (giai ñoạn 2001-2009) bị xóa 15 nucleotide. Sự thay ñổi này dẫn ñến
xóa ñi 5 amino acid “(A/T)IAS(V/S)” ở các vị trí 80 - 84 trong protein NS1.

Theo Long và cộng sự (2008) [102] protein NS1 bị xóa 5 amino acid ở các
23
vị trí 80 - 84 dẫn ñến ñột biến D92E làm tăng ñộc lực của virus cúm
A/H5N1 ở gà và chuột. ðồng thời, glutamic acid
(E) ở vị trí 92 trong
protein NS1 còn liên quan ñến khả năng của virus A/H5N1 ñiều chỉnh ñáp
ứng với cytokine và tính ñộc lực cao của virus trên lợn
(Seo và cs, 2002)
[132]
. E92 cũng ñược phát hiện trong thành phần protein NS1 của chủng
CkHG4. Theo
Jackson và cộng sự (2008) [84], bốn amino acid ở ñầu C
của protein NS1 là vùng liên quan ñến ñộc lực của virus. Các chủng virus
cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm với tỷ lệ chết cao gần ñây ñều có các
amino acid ở ñầu C trong NS1 là ESEV hoặc EPEV. Bốn amino acid ở
ñầu C của protein NS1 chủng CkHG4 cũng có motif là 222ESEV225.
Các amino acid R38, K41 (Wang và cs, 1999) [153] và A149 (Li và
cs, 2006
) [99] trong protein NS1 ñược cho là liên quan ñến khả năng của
virus ức chế tế bào sản xuất interferon và kháng lại ñáp ứng của chúng.
Arginin (R) ở vị trí 38 và lysin (K) ở vị trí 41 cũng ñã ñược phát hiện

ngắn nhất là PB1-F2 (90 amino acid), dài nhất là PB2 (759 amino acid).
- Tất cả 11 gen ñều khởi ñầu bằng bộ mã ATG. Các gen PB2, PB1,
PA và N1 kết thúc bằng bộ mã TAG. Bộ mã kết thúc của các gen H5, NP,
M2 và NS2 là TAA. Riêng các gen PB1-F2, M1 và NS1 có bộ mã kết
thúc là TGA.
- Kết quả phân tích thành phần gen cho thấy chuỗi polypeptide H5 có
7 vị trí glycosyl hóa, chuỗi nối giữa HA
1
và HA
2
có ñầy ñủ các amino
acid RRRKK; chuỗi polypeptide N1 có 3 vị trí glycosyl hóa; chuỗi
polypeptide NS1 bị xóa 5 amino acid ở các vị trí 80 - 84; chuỗi
polypeptide PB2 chứa glutamic acid (E) ở vị trí 627 và asparatic acid (D)
ở vị trí 701, thích ứng gây bệnh ở gia cầm và ñặc trưng của virus cúm
A/H5N1 ñộc lực cao.
(2) Hệ gen của chủng CkHG4 phù hợp với các chủng virus cúm
A/H5N1 phân dòng Quảng ðông, thuộc nhóm kháng nguyên clade 1,
nhóm di truyền genotype Z.
(3) Chủng CkHG4 có mức ñộ ñồng nhất (về nucleotide) và tương
ñồng (về amino acid) cao ở tất cả 8 phân ñoạn gen với các chủng cúm
A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam trong các năm 2004-2005.
(4) Phân tích mối quan hệ phả hệ từng gen riêng biệt của toàn bộ hệ
gen cho thấy chủng CkHG4 tập hợp trong cùng nhóm với các chủng virus
cúm A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm vùng ñồng bằng sông Cửu
Long giai ñoạn 2004-2007.

KIẾN NGHỊ
Tiếp tục giải trình tự hệ gen của các chủng virus cúm A/H5N1 mới
xuất hiện trong những năm gần ñây tại Việt Nam, phân tích ñặc tính sinh