“Giám sát sự lưu hành của virus cúm
A/H5N1 trên gia cầm tại một số huyện của tỉnh
Hà Tĩnh bằng phương pháp rRT - PCR”
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
Cùng với ngành trồng trọt, chăn nuôi là ngành không thể thiếu trong sản
xuất nông nghiệp của nước ta. Trong những năm qua, ngành chăn nuôi đã phát
triển rất đa dạng với nhiều đối tượng và phương thức chăn nuôi khác nhau góp
phần mang lại những bữa ăn ngon, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con
người, góp phần tăng thu nhập cho người chăn nuôi. Trong đó, phải kể đến
ngành chăn nuôi gia cầm, là một ngành đóng vai trò quan trọng và thiết yếu.
Hàng năm, ngành chăn nuôi gia cầm cung cấp một khối lượng thực phẩm đứng
thứ hai sau chăn nuôi lợn, chiếm 17% tổng thịt hơi các loại. Theo số liệu từ
Tổng cục thống kê năm 2010 đàn gia cầm có 300,5 triệu con, tăng 7,3% so với
năm 2009. Số lượng thịt gia cầm 621,2 nghìn tấn, tăng 17,5% so với năm 2009.
Trứng gia cầm 6371,8 triệu quả, tăng 16,5% so với năm 2009. Cũng theo Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2011 lượng thịt gia cầm tăng 16,8%,
sản lượng trứng tăng 18,97% so với năm 2010. Như vậy, chăn nuôi gia cầm
đang ngày càng phát triển với sự tăng lên về số lượng. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây, ngành chăn nuôi gia cầm đã và đang gặp không ít khó khăn. Nhiều
dịch bệnh đã xảy ra buộc phải tiêu hủy toàn đàn gây thiệt hại lớn cho người chăn
nuôi và nền kinh tế đất nước. Đặc biệt, nhiều dịch bệnh không chỉ xảy ra trên vật
nuôi mà còn lây sang người gây tử vong. Một trong số đó là bệnh cúm gia cầm.
1
Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lây sang người. Nhiều
nước trên thế giới và ở Việt Nam, cúm gia cầm đã làm nhiều người bị thiệt
mạng. Kể từ thời gian đầu có dịch (tháng 12/2003) cho đến nay (12/4/2012) đã
có 258 người tử vong do cúm gia cầm trong số 423 ca nhiễm H5N1 tại 15 nước,
chủ yếu là ở Châu Á. Ở Việt Nam đã có 123 người nhiễm virus cúm A/H5N1 tại
40 tỉnh/thành phố, trong đó có 61 trường hợp tử vong (theo số liệu của Tổ chức
Y tế thế giới – WHO). Trong thời gian gần đây, mặc dù đã có nhiều biện pháp
plague) là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ
Orthomyxoviridae với nhiều type phụ khác nhau.
Các virus cúm type A gây nhiễm cho gia cầm được chia làm hai nhóm:
Nhóm virus gây bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian -
HPAI) có tỉ lệ chết cao (có thể lên đến 100%) chủ yếu ở các phân type H5 và
H7. Nhóm virus cúm gia cầm thể độc lực thấp (Lowly Pathogenic Avian -
LPAI) gây ra bệnh có triệu chứng nhẹ, chủ yếu ở đường hô hấp.
Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI) là một trong những bệnh đầu
tiên do virus gây ra được mô tả ở gia cầm. Đây là một bệnh truyền nhiễm cấp
tính lây lan rất mạnh ở gia cầm. Bệnh được tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp
vào bảng A - bảng danh mục các bệnh nguy hiểm nhất ở động vật. Bệnh xảy
ra ở nhiều nơi trên thế giới và gây thiệt hại rất lớn về kinh tế cũng như đời
sống xã hội.
3
2.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.2.1. Tình hình bệnh trên thế giới
Bệnh cúm gia cầm xảy ra nhanh và mạnh trên đàn gia cầm, làm chết và tiêu
hủy với số lượng lớn. Vụ dịch đầu tiên được ghi nhận vào năm 1878 tại Italia
với tỉ lệ chết cao ở đàn gia cầm và được gọi tên là “dịch tả gà”.
Năm 1959, bệnh xảy ra trên đàn gia cầm tại Scotland do H5N1 gây ra [7].
Năm 1983-1984, virus cúm gia cầm chủng H5N2 gây ra vụ dịch ở Pensylvania,
bang New Jersay, Virginia Mỹ làm chết hơn 10 triệu gà, thiệt hại 60 triệu đô la.
Chính phủ Mỹ còn phải chi 349 triệu đô la cho công tác chẩn đoán, tiêu độc môi
trường và hỗ trợ thiệt hại cho các cơ sở chăn nuôi phải tiêu hủy đàn gà [32].
Năm 1997, ở Hồng Kông dịch cúm gia cầm xảy ra do chủng virus H5N1
gây ra, làm tiêu hủy gần như toàn bộ đàn gia cầm. Điều quan trọng là người có
khả năng nhiễm chủng virus cúm Hồng Kông/1997 ở dạng cấp tính và tỉ lệ tử
vong cao [30].
Năm 2000, dịch cúm gia cầm lại tái phát ở vườn thú Hồng Kông [17].
Từ cuối năm 2003 bệnh cúm A/H5N1 đã xảy ra với quy mô lớn và tốc độ
Bắc (Hà Nội, Bắc Ninh, Nam Định, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Hà Nam,
Phú Thọ), tiếp đó là các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên.
Đợt dịch thứ hai (đợt cao điểm từ ngày 01/02 đến ngày 10/02/2004):
Trong những ngày đầu tháng 2 dịch bùng phát rất nhanh, xảy ra trên quy
mô lớn và diễn biến phức tạp. Bình quân mỗi ngày có khoảng 150 – 230 xã, 15
– 20 huyện phát sinh ổ dịch mới trên phạm vi cả nước.
Ngày cao điểm nhất có 27 xã, 20 huyện thị mới phát sinh dịch. Số gia cầm
phải tiêu hủy hàng ngày từ 2 – 3 triệu con, ngày cao điểm nhất phải tiêu hủy 4
triệu con (ngày 06/02).
Đợt dịch thứ ba (từ ngày 11/02 đến ngày 27/02/2004):
- Từ ngày 11-20/02 dịch có chiều hướng giảm dần, không có huyện, tỉnh
mới phát sinh ổ dịch. Bình quân mỗi ngày có từ 20 – 30 xã phát sinh ổ dịch mới.
Số gia cầm phải tiêu hủy hàng ngày giảm chỉ còn từ 0,2 – 0,7 triệu con (cao nhất
ngày 11/02 là 0,84 triệu con, thấp nhất ngày 15/02 là 17.864 con).
- Từ ngày 21/02 dịch cơ bản đã được khống chế, chỉ phát sinh thêm một vài
thôn ấp của một số xã đã phát dịch trước đây, số gia cầm phải tiêu hủy giảm rõ
rệt (ngày 25/02 là 1.438 con, ngày 26/02 chỉ còn 45 con).
5
- Tính đến ngày 27/02, dịch bệnh đã xảy ra ở 2.574 xã, phường (24,6% số
xã phường), 381 huyện, thị (60% số huyện, thị) thuộc 57 tỉnh, thành phố ở đồng
bằng sông Cửu Long, Đông Nam Bộ, đồng bằng sông Hồng. Dịch xảy ra nặng ở
các tỉnh: Long An (185 xã), Tiền Giang (135 xã), An Giang (145 xã), Đồng
Tháp (116 xã), Hà Tây (134 xã), Hải Dương (144 xã). Một số tỉnh xuất hiện ở
diện hẹp như: Cao Bằng, Lai Châu (2 xã), Hà Tĩnh (5 xã), Hòa Bình, Bình
Phước (6 xã), Lạng Sơn (8 xã), Kiên Giang (9 xã).
Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trong các năm 2005 – 2012 được tóm
tắt như sau:
− Năm 2005 tổng số gà, vịt, ngan mắc bệnh, chết, tiêu huỷ hơn 4,78 triệu
con (trong đó có 2,38 triệu con tiêu huỷ trong ổ dịch, 2,42 triệu con tiêu huỷ tự
nguyện do không tiêu thụ được hoặc thuỷ cầm phải tiêu huỷ bắt buộc do ấp nở
− Đầu năm 2008, dịch cúm gia cầm mới chỉ xảy ra trên tỉnh Trà Vinh sau
đó dịch đã xảy ra trên các tỉnh khác như Thái nguyên, Tuyên Quang, Quảng
Bình, Hải Dương, Nam Định, Nghệ An, Hà Tĩnh và nhiều tỉnh khác. Trong năm
2008 dịch đã xảy ra trên 80 phường/xã thuộc 54 huyện/thị trấn của 27 tỉnh/thành
phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 13.007 con và tổng số gia cầm tiêu hủy là
106.058 con [10].
− Năm 2009, tính từ đầu năm đến ngày 22/12/2009 cả nước đã có 129 ổ
dịch tại 17 xã/phường của 35 huyện/thị xã thuộc 17 tỉnh/thành phố phát dịch
cúm gia cầm là: Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, Điện Biên, Đồng Tháp, Hậu
Giang, Khánh Hòa, Nghệ An và một số tỉnh khác. Tổng số gia cầm mắc bệnh,
chết và tiêu hủy là 105.605 con, trong đó gà 23.733 con (chiếm 22,51%), vịt
79.138 con (chiếm 74,94%) và ngan 2.690 con (chiếm 2,55%). Trong năm 2009,
dịch bệnh đã diễn ra trên 72 xã/phường thuộc 36 huyện/thị trấn của 18 tỉnh.
Tổng số gia cầm mắc bệnh 68.463 con, tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là
105.601 con [10].
Qua những số liệu trên ta thấy năm 2009 dịch bệnh đã giảm về phạm vi (số
phường/xã) tuy nhiên số lượng gia cầm chết và tiêu hủy năm 2009 tương đương
năm 2008 và bằng 1/3 so với năm 2007.
− Trong năm 2010, dịch cúm gia cầm xảy ra trên 68 xã/phường của 41
huyện/quận thuộc 23 tỉnh/thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh 59.809 con,
tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 87.590 con.
− Năm 2011, trên cả nước dịch bệnh đã xảy ra ở 82 xã/phường của 43
huyện/quận thuộc 22 tỉnh/thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 110.311 con,
số gia cầm chết và tiêu hủy là 151.356 con.
− Trong năm 2012 (tính từ ngày 01/01/2012 đến ngày 22/2/2012), dịch
cúm gia cầm xảy ra ở 36 xã, phường của 29 huyện, quận thuộc 12 tỉnh, thành
phố là: Hải Phòng, Hải Dương, Thái Nguyên, Hà Nam, Bắc Giang, Bắc Ninh,
Quảng Trị, Thanh Hóa, Sóc Trăng, Kiên Giang, Hà Tĩnh và Quảng Nam. Tổng
7
số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 51.983 con, trong đó gà là 5.058 con
ngoài nguyên sinh chất.
- NS1: Là protein không cấu trúc (không là đơn vị tạo thành hạt virus) được
tổng hợp trong quá trình nhân lên của virus và có nhiệm vụ cắt ARN và kích
thích sự phiên mã trong quá trình nhân lên của virus [1].
9
Hình 2.1. Virus H5N1 (cytokinestorm.com)
2.3.2. Tính đa dạng và độc lực của virus
Các virus cúm type A gây nhiễm cho gia cầm được chia làm hai nhóm:
Loại virus có độc lực thấp - LPAI và chủng virus có độc lực cao - HPAI bao
gồm các virus thuộc phân type H5 và H7 [22]. Độc lực của các phân type virus
cúm A trên gia cầm thay đổi tuỳ theo loài vật chủ (gà, vịt, chim hoang dại ), và
có thể biến chuyển mức độ độc lực theo thời gian hoặc khi xảy ra hiện tượng tái
tổ hợp gen với các phân type virus cúm khác [28].
Hiện nay, virus cúm A có tất cả 16 kháng nguyên H (H1 – H16), 9 kháng
nguyên N (N1 – N9) và hầu hết chúng đều liên quan đến động vật. Chúng có thể
tạo ra 144 chủng virus cúm và hơn 256 dạng cúm. Tuy nhiên, trong những năm
gần đây, subtype virus cúm A/H5N1 có độc lực đã gây nhiễm chéo giữa các loài
và có thể gây nhiễm cho người [15], [18], [21].
Độc lực của virus cúm gia cầm được đánh giá bằng cách gây bệnh cho gà
4-6 tuần tuổi: Tiêm vào tĩnh mạch cánh 0,2 ml nước trứng đã được gây nhiễm
virus với tỉ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm.
- Loại virus có độc lực cao: Sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà, virus phải
làm chết 75 – 100% số gà thực nghiệm. Sau khi phân lập virus từ gà bệnh thì
virus phải phát triển tốt và gây bệnh tích tế bào đặc trưng trong môi trường nuôi
cấy tế bào không có Trypsine.
10
- Loại virus có độc lực trung bình: Là những chủng virus gây bệnh với triệu
chứng lâm sàng rõ rệt nhưng không chết quá 15% gà bị nhiễm bệnh tự nhiên
hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm.
- Loại virus có độc lực thấp (nhược độc): Là những virus phát triển tốt
protein của virus (Hình 2.2).
11
Hình 2.2. Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào vật chủ
- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn
lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng
“nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào
để kết hợp với ARN thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được
hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế
bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các
liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế
bào khác.
2.3.4. Sức đề kháng của virus
Điều kiện ngoại cảnh có ảnh hưởng rõ rệt tới sức đề kháng của virus cúm
H5N1. Virus thường sống lâu hơn trong không khí ở độ ẩm tương đối thấp,
trong phân ở điều kiện nhiệt độ thấp và độ ẩm cao.
Virus có thể sống trong chuồng gà tới 35 ngày, trong phân gia cầm bệnh tới
3 tháng.
Virus cúm dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ 60 - 70
0
C trong 5 phút. Trong tủ
lạnh và tủ đá, virus sống được hàng tháng.
Những chất sát trùng thông thường đều diệt được virus cúm gia cầm như:
Xút 2%, Formol 3%, Crezin 5%, Chloramin B 3%, cồn 70 - 90
0
, vôi bột hoặc
nước vôi 10%, nước xà phòng đặc, Người ta có thể dùng các chất này để tổng
12
tẩy uế chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và các thiết bị chăn nuôi khi cơ sở bị đe
dọa [6], [24].
2.4. DỊCH TỄ HỌC
trở thành nguồn gieo rắc virus cho các loài khác, đặc biệt là gia cầm [25].
Vịt bài thải một số lượng lớn virus (103.5 – 105.5/ml) theo đường hô hấp
cũng như theo phân. Lượng virus H5N1 bài thải từ vịt đủ để lây truyền trực tiếp
virus từ vịt có biểu hiện lâm sàng khoẻ mạnh sang gà. Lượng virus bài thải ở vịt
nuôi có biểu hiện khoẻ mạnh cũng xấp xỉ với lượng virus do gà bệnh và gà có
biểu hiện ốm bài thải. Điều này cho thấy vịt là vật chủ tàng trữ “thầm lặng” đối
với virus cúm H5N1 gây bệnh thể độc lực cao cho gà [23].
Virus cúm H5N1 hiện đang lưu hành ở châu Á đã tăng độc lực của nó với
gà và chuột, đồng thời mở rộng phổ vật chủ của nó trên các động vật có vú như
các động vật họ mèo, lợn, ngựa, hải cẩu, chồn. Vì vậy, các động vật trên đóng
vai trò quan trọng trong việc tàng trữ và phát tán mầm bệnh [23].
2.4.3. Sự truyền lây bệnh
Khi gia cầm nhiễm cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường
tiêu hoá. Sự truyền lây bệnh được thực hiện theo 2 phương thức là trực tiếp và
gián tiếp.
- Truyền trực tiếp giữa con mắc bệnh và con khoẻ mạnh. Lây trực tiếp do con
vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung được thải ra
từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nước uống có chứa mầm bệnh.
- Lây gián tiếp thông qua không khí, gió đưa bụi phân có chứa virus đi xa,
dụng cụ chăn nuôi, thức ăn, nước uống, xe vận chuyển, côn trùng, chim, chuột,
vật nuôi, phân rác hoặc tay chân, giày dép của người có tiếp xúc gia cầm mắc
bệnh và vô tình truyền mầm bệnh đi nơi khác [6].
14
Đối với gia cầm nuôi, nguồn dịch đầu tiên thường thấy là:
- Từ các loại gia cầm nuôi khác nhau ở trong cùng một trang trại hoặc trang
trại khác liền kề như vịt lây sang gà hoặc từ gà tây sang gà.
- Từ gia cầm nhập khẩu.
- Từ chim di trú, đặc biệt thủy cầm được coi là đối tượng chính dẫn nhập
virus vào đàn gia cầm nuôi.
- Từ người và các động vật có vú khác. Phần lớn các ổ dịch cúm gia cầm
hóa gây tịt mũi, thối mí mắt.
- Khí quản phù nề, đọng nhiều dịch rỉ (exudate), viêm sero đến casein,
nhiều đờm.
- Túi khí dày lên, có nhiều casein bám dính.
- Phúc mạc bị viêm nặng từ cata đến fibrin.
- Buồng trứng bị viêm xuất huyết, trứng non dập vỡ, ống dẫn trứng viêm
dịch rỉ đến casein.
- Ruột bị viêm xuất huyết từ cata đến fibrin. Nặng nhất là vùng ruột non,
ruột thừa và hậu môn.
Trường hợp bệnh nặng:
Một số chết quá nhanh không để lại bệnh tích điển hình, nhưng đại bộ phận
những gà khác thì các biến đổi đại thể lại thể hiện khá rõ.
- Mũi bị viêm tịt.
- Mào tích thâm tím, sưng dày lên, xuất huyết điểm và hoại tử. Khi cắt đôi
mào hoặc tích thấy chúng có màu vàng xám, óng ánh như gelatin.
- Mí mắt và mặt phù nề, đầu sưng to.
- Xuất huyết dưới da: chân, kẽ móng chân, lưng, đùi
- Xác gà béo nhưng thịt thâm và khô.
- Viêm teo, xuất huyết và gây hoại tử ở gan, lách, thận.
Các bệnh tích khác
Ở gà: Dạ dày tuyến, van hồi manh tràng, niêm mạc hậu môn bị viêm xuất
huyết, tụy teo do mất nước, bao tim tích nước vàng, xuất huyết điểm, viêm dính
phúc mạc và túi khí, xuất huyết dưới da và cơ ở vùng đùi, ngực, bụng, bao tim
màng treo ruột và niêm mạc khí quản. Trong khí quản thường chứa nhiều đờm, dãi.
16
Ở ngan, vịt: Một trong hai lá phổi luôn bị viêm xuất huyết nặng, gan hóa
(khi bỏ vào nước thì phổi bị chìm: > 2/3 nằm dưới mặt nước), bao tim tích nước
vàng và bị xuất huyết điểm nặng, xuất huyết bên trong lồng ngực, đường ruột
chứa rất ít thức ăn.
Bệnh tích vi thể
có thể giám định virus bằng các HI test để giám định subtype H và N.
Gần đây, phương pháp real time PCR (RT – PCR) trực tiếp sử dụng nguồn
gen của virus cúm A và cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm cũng được đưa vào
ứng dụng cho phép chẩn đoán chính xác, tin cậy cao và phân biệt sự hiện diện
của các chủng virus cúm A gây bệnh chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm.
Ngoài ra, còn có các phương pháp chẩn đoán khác như: kỹ thuật ELISA, kỹ
thuật khuếch tán trên thạch, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)…
2.6.3. Dựa vào dịch tễ
Bệnh cúm gia cầm có tính lây truyền nhanh, mạnh.
Loài mắc bệnh thường là gia cầm và chim. Chim hoang dã là nguồn truyền
lây bệnh.
Một số động vật có vú cũng có thể mắc bệnh: người, lợn, ngựa…
2.7. PHÒNG BỆNH
2.7.1. Phòng bệnh bằng vệ sinh
2.7.1.1. Các biện pháp vệ sinh tổng hợp
Do đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như đặc tính biến đổi kháng nguyên bề
mặt của virus khá phức tạp. Do vậy, để phòng bệnh và ngăn chặn bệnh xảy ra thì
các biện pháp vệ sinh thú y tổng hợp như: vệ sinh chuồng trại, khu vực chăn
nuôi, thiết bị cho ăn uống… phải được áp dụng định kỳ ở những vùng chưa có
dịch. Đối với những vùng nguy cơ có dịch, vùng có dịch thì phải được áp dụng
một cách thường xuyên và nghiêm ngặt.
2.7.1.2. Phòng bệnh đối với những địa phương chưa có dịch xảy ra hoặc
nguy cơ có dịch
Trong thời gian xảy ra dịch ở các địa phương khác thì các trại chăn nuôi gia
cầm giống áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nhằm ngăn cản mầm bệnh
đưa vào. Dụng cụ chăn nuôi, xe chuyên chở, dụng cụ bảo hộ lao động và con
người ra vào trại phải được vệ sinh, khử trùng. Thức ăn, nước uống, chất độn
chuồng phải đảm bảo không chứa mầm bệnh.
Trên các trục đường giao thông chính thành lập các chốt kiểm dịch tạm thời
nhằm ngăn chặn việc dịch chuyển gia cầm, sản phẩm gia cầm từ các địa phương
chế tạo vacxin.
Đối với bệnh truyền nhiễm, vacxin được coi là biện pháp có tính chiến
lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1
ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vacxin không
những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn
19
truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người. Kháng thể đặc hiệu có thể
được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vacxin, và đó là các
kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm,
góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Các
vacxin phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vacxin truyền thống
và vacxin thế hệ mới.
• Vacxin truyền thống:
Bao gồm vacxin vô hoạt đồng chủng và dị chủng.
Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại vacxin
được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh
trên thực địa.
Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous) là vacxin sử dụng các chủng virus
có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên
NA dị chủng.
• Vacxin thế hệ mới hay vacxin công nghệ gen: là loại vacxin được sản
xuất dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và
đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:
Vacxin tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu
gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type
H5N1 và H7N1.
Vacxin dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách
chiết làm vacxin.
Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc Newcastle
virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là vịt bán tại một số chợ buôn bán gia cầm
sống được lựa chọn theo dự án 604, và gia cầm ốm chết, nghi ngờ mắc bệnh
cúm gia cầm H5N1 trên địa bàn tỉnh Hà Tĩnh được các hộ gia đình chăn nuôi
gửi đến Cơ quan thú y vùng III để chẩn đoán.
3.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
− Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 09/01/2012 đến ngày 05/05/2012
− Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được tiến hành tại Tổ sinh học phân tử
thuộc trạm chẩn đoán bệnh động vật – Cơ quan thú y vùng III, (thành phố
Vinh - Nghệ An).
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1) Tình hình lưu hành virus cúm A/H5N1 ở vịt lấy tại các chợ của tỉnh
Hà Tĩnh.
2) Xác định tỉ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 trên gia cầm ốm chết hoặc có
biểu hiện nghi bị cúm gia cầm.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Dụng cụ và máy móc
- Các loại tủ lạnh: - 20
0
C, - 80
0
C, 4
0
C
- Buồng an toàn sinh học cấp độ II
- Hệ thống chiết tách ARN bằng chân không hoặc ly tâm
- Ly tâm lạnh ống eppendorf
- Ly tâm ống lớn, ly tâm ống nhỏ
M
probe 5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’
Mồi xuôi (F) CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC
Mồi ngược (R) AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA
H5
probe 5’-HEX-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1-3’
Mồi xuôi (F) ACGTATGACTACCCGCAGTATTCA
Mồi ngược (R) AGACCAGCTACCATGATTGC
N1
probe 5’-FAM-TGGTCTTGGCCAGACGGTGC-BHQ1-3’
Mồi xuôi (F) TGGACTAGTGGGAGCAGCAT
Mồi ngược (R) TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC
3.5. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU, XỬ LÝ VÀ BẢO QUẢN MẪU
23
3.5.1. Đối với mẫu phủ tạng
∗
Nghiền mẫu bằng cối chày sứ:
Phun sát trùng bên ngoài hộp đựng mẫu bệnh phẩm bằng dung dịch sát
trùng (virkon 1%).
Lấy 2g bệnh phẩm (não, phổi, lách, hạch) cho vào cối sứ nghiền và cho 2g
bệnh phẩm vào ống falcon để lưu mẫu. Nghiền mẫu bệnh phẩm, pha thành
huyễn dịch 10-20% với PBS, cho vào ống falcon dùng giấy thấm dung dịch
virkon 1% lau xung quanh sau đó cho vào tủ -40
0
C 1 giờ thì lấy ra giải đông.
Còn mẫu lưu được cho vào tủ -80
0
C trong thời gian dài trong phòng lưu mẫu.
Mẫu xét nghiệm sau 1 giờ được lấy ra giải đông, sau đó cho vào ly tâm
8000 vòng/phút trong 5 phút và dùng pipet hút lấy dung dịch nổi để xét nghiệm.
trình sao chép ADN. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại
được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di ADN trên gen
agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT – PCR cho phép phát hiện và
định lượng sự tích lũy ADN khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả
năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát quang.
Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết ADN và
những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi
ADN tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng
lượng tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ với sự gia tăng lượng ADN. Khi sử dụng máy
Bio – Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi
quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta
không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản
phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại
đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là
chu kỳ ngưỡng Ct (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả
phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là ARN nên trong phản ứng
real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ ARN thành ADN gọi là
Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là real time RT – PCR.
* Nguyên lý hoạt động của probe:
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa
chất được sử dụng trong phản ứng real time RT - PCR là Taqman probe.
Taqman probe được sử dụng như một trình tự Oligonucleotide đặc hiệu,
gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
25
Copyright: Tài liệu đại học ©