BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lê Thị Đoan Thục

TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA
LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang - 2019


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lê Thị Đoan Thục

TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA
LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS

người đã giúp tơi hồn thành tốt phần thực nghiệm của mình.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và cơng
nghệ, khoa Hóa học và Phịng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi
thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và ứng
dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại
Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trường Đại học Nha
Trang, Trường Đại học Khánh Hòa đã giảng dạy, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động
viên, giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hồn thiện luận văn này.
Và cuối cùng, tơi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, trường
THPT Lý Tự Trọng – Nha Trang đã tạo điều kiện để tơi có thể hồn thành
khóa học sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ.
Xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 25 tháng 09 năm 2019
Học viên

Lê Thị Đoan Thục


1

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục ............................................................................................................ 1


1.2.4.4 Kháng virus cúm .................................................................. 23
1.2.4.5 Kháng virus coronavirus ...................................................... 24
1.2.4.6 Kháng ung thư ...................................................................... 24
1.2.4.7 Kháng vi khuẩn .................................................................... 24
1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước ............................ 25
1.4 Các phương pháp tinh chế lectin từ rong biển ....................................... 25
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 28
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................... 28
2.2. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu .................................. 29
2.2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................ 29
2.2.2. Hóa chất ....................................................................................... 29
2.2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 29
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 30
2.3.1 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % ........................................ 30
2.3.2 Phân tích hoạt tính lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu 30
2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry ................ 31
2.3.4 Bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................ 32
2.3.5 Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong Betaphycus
gelatinus ....................................................................................................... 34
2.3.5.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết ......................... 34
2.3.5.2 Khảo sát nồng độ dung môi chiết ........................................ 35
2.3.5.3 Khảo sát thời gian chiết ....................................................... 36
2.3.6 Khảo sát nồng độ tác nhân tủa thích hợp để thu tủa protein-lectin 37
2.3.7 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAFSepharose ..................................................................................................... 37
2.3.8 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S–200 ... 38
2.3.9 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng
phương pháp điện di SDS-PAGE ................................................................. 38
2.3.10 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính lý, hóa của lectin từ
rong biển B. gelatinus ................................................................................... 41

3.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC của
lectin ........................................................................................................... 56
3.4.4 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin .................................... 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 63
PHỤ LỤC


4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên đầy đủ

CP
DC
DCT
HC
HTR
HTTS
NKHC
A
MAC

Chế phẩm
Dịch chiết
Dịch chiết thô
Hồng cầu
Hoạt tính riêng

N,N,N',N'-Tetramethyl
ethylenediamin


5

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh của lectin từ rong biển ........................... 16
Bảng 1.2 Cấu trúc của một số lectin từ rong biển .......................................... 21
Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển ...................................... 22
Bảng 1.4 Các phương pháp tinh chế lectin ..................................................... 26
Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm .......................... 29
Bảng 2.2 Các loại đường monosaccarit và glycoprotein sử dụng để khảo sát
đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ........................................ 42
Bảng 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong đỏ
B. gelatinus với các dạng hồng cầu khác nhau ............................... 45
Bảng 3.2 Kết quả tinh sạch lectin từ rong Betaphycus gelatinus từ 400 gam
rong thô ........................................................................................... 53
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC của
lectin từ rong Betaphycus gelatinus ................................................ 57
Bảng 3.4 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt
tính NKHC của lectin từ rong Betaphycus gelatinus...................... 58


6

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 2.1 Rong B. gelatinus ............................................................................ 28
Hình 2.2 Qui trình nghiên cứu tổng qt dự kiến .......................................... 33
Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ ngun liệu/ dung mơi chiết thích

giống như kháng thể, lectin cho thấy sự đa dạng trong cấu trúc phân tử và đặc
tính liên kết carbohydrate của chúng, những đặc tính này phụ thuộc vào
nguồn gốc thu nhận lectin.
Nguồn lợi sinh vật biển bao gồm vi tảo, rong biển, động vật không xương
sống, cá, vi khuẩn, nấm và virus đã cung cấp một số lượng lớn các phân tử
hoạt tính sinh học tự nhiên đặc hiệu như thuốc kháng vi khuẩn, kháng virus
HIV, kháng virus cúm, kháng ung thư và thuốc chữa bệnh Alzheimer [1].
Trong số đó, lectin là một trong số nhóm hợp chất nổi bật nhất với nhiều đặc
tính quan trọng đang được quan tâm đặc biệt cho sử dụng trong y-sinh (kháng
virus, chống viêm, chống khối u, kháng ung thư kết tràng, kháng virus viêm
gan C, HIV..) và trong dược phẩm.
Gần đây, một số lectin liên kết N-glycan dạng high-mannose từ rong biển
đã hứa hẹn trở thành thuốc kháng các dòng virus, vi khuẩn và ung thư tiềm
năng, như các lectin từ loài Eucheuma serra (ESA-2) [2], [3], Kappaphycus
alvarezii (KAA-2) [4], [5], Kappaphycus striatum, Eucheuma denticulatum
[6], [7] và Solieria filiformis (SFL) [8]. Tất cả chúng đã cho thấy hoạt tính
mạnh kháng virus HIV, virus cúm, một số dòng tế bào ung thư như ung thư
ruột kết Colo201, Colon26, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, ung
thư tuyến và ung thư biểu mô và vi khuẩn vibrio, thông qua sự tương tác đặc
hiệu giữa lectin với các chuỗi đường dạng high-mannose trên bề mặt tế bào
ung thư hoặc trên lớp vỏ của virus [8], [9], [10], [11], [12]. Vì vậy, lectin liên
kết với N-glycan dạng high-mannose từ rong biển hứa hẹn thành mục tiêu
quan tâm cho sử dụng trong y sinh.
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển
khoảng 3.260 km, có một hệ thực vật tảo đa dạng với khoảng 1.000 mẫu được
đánh giá và 639 mẫu đã được xác định, bao gồm 269 mẫu rong đỏ, 143 mẫu
rong nâu, 151 mẫu rong lục và 76 mẫu rong xanh-lam.Đó là nguồn sinh vật


8

pháp điện di SDS-PAGE.


9

* Phân tích độ bền nhiệt, ảnh hưởng của pH, cation hóa trị 2 và EDTA
đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ Betaphycus
gelatinus.


10

Chương 1:

TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ LECTIN
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu
Cho đến những năm cuối của thế kỷ 19, có nhiều bằng chứng cho thấy sự
hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu trong tự nhiên.
Những protein như vậy được gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật
(phytoagglutinin) vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật.
Mô tả đầu tiên về hemagglutinin xuất phát từ Peter Hermann Stillmark khi
thực hiện luận án tiến sĩ vào năm 1888 tại trường đại học Dorpat (hiện nay là
ĐH Tartu, Estonia), một trong những trường đại học lâu đời nhất ở Nga. Chất
hemagglutinin được Stillmark chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis
và được đặt tên là ricin. Sau đó H. Hellin, cũng ở Đại Học Tartu cho thấy sự
hiện diện của một hemagglutinin độc, gọi là abrin ở mẫu chiết của cây đậu
Abrus precatorius. Một thời gian sau, Paul Erlich (Frankfurt) đã sử dụng ricin
và abrin làm mơ hình kháng ngun cho các nghiên cứu miễn dịch (tất cả đều

nấm, san hô, động vật không xương sống và động vật có xương sống [20]. Do
có khả năng liên kết đặc hiệu với các cấu trúc carbohydrate khác nhau trên bề
mặt tế bào ung thư hoặc trên lớp vỏ vi khuẩn và virus, lectin không chỉ được
dùng cũng như thuốc thử trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, mà còn đang hứa
hẹn sử dụng trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư và kháng virus [21].
1.1.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới
1.1.2.1 Sự phân bố lectin trong giới thực vật
Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu
khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt. Tác giả Allen và Brillantine
(1969), đã tiến hành điều tra ở 2.663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800
lồi chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 lồi [22].
Ngồi các cây họ Đậu có số lượng lồi lớn nhất có chứa lectin, một số thực
vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Thủy tiên
(Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [23].
Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu
đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các lồi có chứa lectin
[24]. Lectin từ họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay
(Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa
lectin có hoạt tính NKHC rất cao [25].
Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt
của lectin ở nhiều lồi của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi),
Địa y (Lichenes) và Rong (Algae). Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là


12

của Boyd và cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [26], từ
đó đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong
biển ở nhiều quốc gia khác nhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt
Nam…[27].


1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TỪ RONG BIỂN TRÊN THẾ
GIỚI
Trong vài thập niên qua, đã có nhiều công bố về kết quả sàng lọc lectin từ
rong biển ở các khu vực khác nhau trên thế giới như ở Anh [3], [32], [33],
[34], Nhật bản [35], Tây Ban Nha [36], Hoa Kỳ [37], [38], Brazil [39], [40],
[41], Pakistan [42], Trung Quốc [43], Việt Nam [13], [15], Ấn độ [44], Nam
cực [45] và hơn 800 mẫu rong biển đã được sàng lọc hoạt tính ngưng kết
hồng cầu, trong số đó khoảng 60 % mẫu được thơng báo có chứa lectin, tuy
nhiên số lượng lectin được tinh chế vẫn cịn ít so với lectin từ thực vật bậc
cao. Các nghiên cứu về đặc tính cho thấy rằng lectin từ rong biển khác với
lectin từ thực vật bậc cao trong các tính chất hóa-lý và hóa sinh. Hầu hết
lectin từ rong biển có một số đặc tính chung như tồn tại ở dạng monomer, có
khối lượng phân tử nhỏ hơn lectin từ các nguồn khác, bền nhiệt và hoạt tính
khơng bị ảnh hưởng bởi các kim loại hóa trị 2, có ái lực cao với các
glycoprotein nhưng không với các monosaccharide [46], [47]. Do có khối
lượng phân tử thấp, vì vậy khi sử dụng lectin từ rong biển trong y học ít tạo ra
kháng nguyên so với lectin từ các nguồn khác [48].
1.2.1 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển
1.2.1.1 Tính tan và kết tủa
Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong
biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch
muối lỗng. Lectin có bản chất là protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số
tác nhân hóa học như ethanol, acetone và một số muối trung tính ở nồng độ
cao.
1.2.1.2 Đặc tính liên kết cacbohydrat của lectin
Phụ thuộc vào nguồn gốc rong biển, hoạt tính ức chế sự ngưng kết
hồng cầu của lectin thì đa dạng (Bảng 1.1). Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của
lectin từ rong biển thường bị ức chế mạnh bởi các glycoprotein và
glycopeptide khác nhau. Do đó, dựa trên đặc tính liên kết của chúng với

kết với cả N-glycan dạng high-mannose và N-glycan dạng phức (Bảng 1.1).
d/ Lectin liên kết với đường đơn monosaccharide
Hầu hết các lectin từ rong biển đều có ái lực cao hướng đến các
glycoprotein. Tuy nhiên, cũng có một số lectin có ái lực với các
monosaccharide và các dẫn xuất của chúng. Lectin từ C. flabellata bị ức chế
bởi rhamnose [49]. Các lectin từ P. serrata, PSL [51], P. filicina PFL [57] và


15

V. obtusiloba [58] bị ức chế mạnh bởi đường galactose và các dẫn xuất của
chúng (Bảng 1).
1.2.1.3 Điểm đẳng điện và hàm lượng axit amin
Lectin từ rong biển có điểm đẳng điện thấp (pIs), thường nằm trong
phạm vi từ 4 đến 6 (Bảng 1.1). Lectin từ rong biển chiếm tỉ lệ cao của axit
amin dạng axit (axit aspartic và axit glutamic) và tỉ lệ thấp axit amin dạng
bazơ (arginine, histidine và lysine) [46], [51], [59].
1.2.1.4 Trọng lượng phân tử
Lectin từ rong biển thường có khối lượng phân tử thấp và tồn tại ở dạng
monomer như các lectin từ C. flabellata, S. robusta [ 46], B. seaforthii, B.
triquetrum [60], E. serra [61], P. capillacea [52], H. musciformis [62], G.
ornata [53], G. cornia [54], Griffithsia sp.[63], [64], [65], K. alvarezii [14], T.
crinitus [66], G. confluens [45], K. striatum [6], E. denticulatum [7] và S.
filiformis [8].Tuy nhiên, một lectin có cấu trúc dimer như lectin từ rong P.
palmata[67] và V. obtusiloba [58]; dạng trimer như lectin từ rongPtilota
filicina[57], P. serrata [51], P. plumosa và P. gunneri [68]; hoặc cấu trúc
tetramer như lectin từ rong G. verrucosa [69].
Dựa trên các tính chất hóa lý và hóa sinh, Rogers và Hori [47] đã phân
loại lectin thành ba loại:
(a) lectin có khối lượng phân tử thấp đặc hiệu cho glycoprotein và khơng địi

và V. obtusiloba [58] cần kim loại hóa trị hai cho hoạt tính sinh học, như Ca2+,
Mn2+ và Mg2+ (Bảng 1.1).
1.2.2.4 Hàm lượng carbohydrate
Hầu hết lectin từ rong biển ở dạng protein. Tuy nhiên cũng có một vài
lectin từ rong biển tồn tại ở dạng glycoprotein với hàm lượng carbohydrate
khác nhau, như lectin từ rong C. purpureum [72], G. bursa-pastoris 59], E.
duperreyi [50], G. ornata [53] và T. crinitus [66] (Bảng 1.1).
Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh của lectin từ rong biển [78]
Tên tảo/rong biển Tên
lectin

Đặc tính liên kết
Đường/Glycoprotein

Tính chất của lectin

Tảo lục lam
Microcystis
aeruginosa

MAL

N-acetyl-D-galactosamine

M. viridis

MVL

Yeast mannan,



Caulerpa
cupressoides

CCL

Ulva pertusa

UPL

Man9GlcNAc2
Man9GlcNAc2
High-mannose (HM)-type
N-glycans
Man8GlcNAc2/Man9Glc
NAc2, α(1–2), α (1–
6)Man
High-mannose N-glycans
N-acetyl galactosamine,
N-acetyl glucosamine,
bovine submaxillary
mucin
D-mannose, α-methyl-Dmannose, L-fucose Nacetyl-D-galactosamine,
N-acetyl-D-glucosamine
Raffinose, lactose,
galactose and fructose,
dẫn xuất của galactose,
porcine stomach mucin
N-acetyl-D-glucosamine,
bovine thyroglobulin

Rong đỏ
Amansia multifida

Bryothamnion
seaforthii

AML

Avidin

BSL

Feutin, avidin, mucin

lượng

Monomer, MW 26.9 kDa,
hàm lượng carbohydrate
2,9%
Monomeric, MW 4.5 kDa,
hoạt tính ngưng kết hồng cầu
khơng phụ thuộc cation hóa
trị 2, bền nhiệt đến 90o C


18

B. triquetrum

BTL

Porcine stomach mucin,
lactotransferrin,
asialofetuin, bovine &
porcine thyroglobulins

G. tikvahiae

GTL

G. verrucosa

GVL

N-acetylneuraminic acid,
glycoconjugates chứa Nacetylneuraminic acid
Hoạt tính không bị ức chế
bởi các đường đơn

trong 30 phút
Monomeric, MW 3.5 kDa, 91
gốc axit amin, hoạt tính
ngưng kết hồng cầu khơng
phụ thuộc cation hóa trị 2,
bền nhiệt đến 90o C trong 30
phút
Monomeric, MW 29 kDa,
bền
pH
từ
2.5–10.5, pI 4.95, bền nhiệt

không phụ thuộc cation hóa
trị 2, bền nhiệt đến 40o C
trong 30 phút


19

Griffithsia sp.

GRFT

Hypnea
cervicornis

HCL

H. japonica

Hypnin

H. musciformis

HMS

Kappaphycus
alvarezii

KAA

K. striatum

asialo-porcine
thyroglobulin, asialo
bovine thyroglobulin,
yeast mannan

Dimeric, MW 12.7 kDa, 121
gốc axit amin
MW 9.1 kDa

Đồng phân lectins MW 9.1
kDa
(hypnin-1 & hypnin-2)

MW 9.3 kDa

Monomeric, MW 28 kDa,
hoạt tính ngưng kết hồng cầu
không phụ thuộc cation hóa
trị 2, bền nhiệt đến 50o C
trong 30 phút, bền pH từ 3–
10.

Glycoproteins bearing
Monomeric, Mr 28 kDa, bền
high-mannose type NpH từ 3–10, bền nhiệt đến 60
o
glycans, porcine and
C trong 30 phút.
bovine thyroglobulins, dẫn
xuất asialo của chúng và

SFL

Tichocarpus
crinitus

TCL

trong 30 phút, bền pH từ 7–
10
Trimer đồng nhất, MW 56.9
kDa, hoạt tính ngưng kết
hồng cầu phụ thuộc cation
hóa trị 2, bền nhiệt đến 50o C
trong 30 phút

p-nitrophenyl-N-acetyl-αand-β-D-galactosaminide,
porcine stomach mucin,
bovine submaxillary gland
mucin, asialo bovine
mucin
Galactose, glucose and
Trimer đồng nhất, MW 52.5
their derivatives with pkDa
nitrophenyl-α-Dgalactoside
o-nitrophenyl-N-acetyl-α- Trimer đồng nhất, MW 55.4
D-galactoside, pkDa.
nitrophenyl-N-acetyl- β-Dgalactoside, lactose,
porcine stomach mucin,
asialo bovine mucin và
asialofetuin

[16]và SfL-1 và SfL-2 từ S. filiformis [8]. Cấu trúc của những lectin này bao
gồm 2 thùng β (β-barrel), mỗi thùng β chứa 10 dải β (β-strand) (Bảng 1.2).
Bảng 1.2 Cấu trúc của một số lectin từ rong biển
Tên mẫu rong

Tên lectin

Dạng cấu Tài liệu tham khảo
trúc

Griffithsia sp.

griffithsin
EAA-1

β-prism I
β-barrel

[63]

E. amakusaensis

EAA-2
EAA-3
ECA-1
ECA-1
EDA-1
EDA-2
ESA-1
ESA-2


[74]
[7]
[74]
[2]
[4]

[8]

1.2.4 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển
Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin là cơ sở cho các hoạt tính sinh
học đa dạng của chúng như kháng virus, kháng ung thư, chống viêm … và
khả năng chẩn đoán và điều trị chọn lọc các bệnh này (Bảng 1.3).