MỤC LỤC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ POLYAMINE
LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH CÂY SÂM
NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET
GRUSHV.) NUÔI CẤY IN VITRO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. DƯƠNG TẤN NHỰT
2. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ
Học viên thực hiện: VŨ THỊ THỦY
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình và đồ thị
Mở đầu 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH 3
1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật 3
1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng 4
1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính 8

1.4.3.3. Các thành phần khác 28
1.4.4. Các tác dụng của sâm Ngọc Linh 28
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 30
2.1.1. Nguồn mẫu 30
2.1.2. Môi trường nuôi cấy 30
2.1.3. Điều kiện thí nghiệm 30
2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP 31
2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh
quang 31
2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi điện tử
quét 31
2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh 32
2.2.4. Bố trí thí nghiệm 32
2.2.4.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp
từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh 32
2.2.4.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường
khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo xốp sâm
Ngọc Linh 33
2.2.4.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D
kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành
phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 33
2.2.4.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện
nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi
vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 34
2.2.4.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất
sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính
từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 35
2.2.4.6. Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hưởng của một số

3.6.1. Ảnh hưởng của Putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô
sẹo xốp sâm Ngọc Linh 52
3.6.2. Ảnh hưởng của Spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô
sẹo xốp sâm Ngọc Linh 55
3.6.3 Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 57
3.7. PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH 60
3.8. GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM
NGỌC LINH 63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN 65
KIẾN NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
½MS : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ
nguyên
½SH : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ
nguyên
2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
ABA : Absisic acid
ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid
ACD : Arginine decarboxylase
Arg : Arginine
ATP : Adenosine-5’-triphosphate
BAP : 6-benzylaminopurine
CH : Casein
EC : Các cụm phát triển phôi (Embryogenic cluster)
G- : Ginsenoside
GA

pkl : Gene pickle (Một dạng đột biến gene ở cây Arabidopsis)
Put : Putrescine
SAM : S-adenosylmethionine
SERK : Somatic embryogenesis receptor-like kinase
SH : Môi trường Schenk and Hildebrandt, 1972
SH½ : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½
Spd : Spermidine
Spm : Spermine
TDZ : Thidiazuron

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau
của sâm Ngọc Linh 36
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô
sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2
mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin lên sự hình
thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 42
Bảng 3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô
tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 45
Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô
tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 47
Bảng 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 44
Hình 3.4.1. Mô sẹo và phôi trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc, lỏng tĩnh và
đặc. 46
Hình 3.4.2. Mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và tối hoàn toàn 48
Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 50
Hình 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 52
Hình 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 54
Hình 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 56
Hình 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 58
Hình 3.6.4. Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường ĐC, Spd,
Put và Spm. 58
Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô
phôi ở sâm Ngọc Linh trên môi trường ĐC và môi trường bổ
sung Spd 61
Hình 3.7. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi
vô tính sâm Ngọc Linh 64 MỞ ĐẦU
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây dược liệu đặc hữu
quý hiếm của Việt Nam và thế giới, được biết đến bởi hàm lượng cao các hợp chất
Saponin triterpenoic tiêu biểu như MR2, G-Rb1 và G-Rg1 [Trần Công Luận, 2003].
Không chỉ có dược tính đặc trưng của chi nhân sâm mà loài cây này còn có tác dụng
điển hình như chống stress, chống trầm cảm, tác dụng chống oxi hóa in vitro và in
vivo… Hiện nay, do nhu cầu cao của thị trường kết hợp với việc khai thác ồ ạt, thiếu

“Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây
sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro”. Ảnh
hưởng nguồn mẫu, điều kiện khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy
và điều kiện chiếu sáng được đánh giá trước khi nghiên cứu vai trò của các
Polyamine cũng như tiền chất của chúng lên sự hình thành và tần suất phát sinh
phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh in vitro. Đồng thời, nồng độ Polyamine nội sinh
cũng được tiến thành phân tích để những kết luận trở nên thuyết phục, có giá trị hơn
và mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về Polyamine trên loài cây quý này.

Chương 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU

1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH

phát sinh phôi ở thực vật: (1) Các điểm nhấn kích hoạt sự thụ phấn có thể được thay
thế bằng những cơ chế nội sinh; (2) Ở một số loài thực vật bậc cao, ngoài tế bào
noãn được thụ phấn thì các loại tế bào khác cũng có thể duy trì và giữ lại khả năng
phát triển phôi. Mặc dù quá trình sinh sản vô phối chỉ hạn chế ở các tế bào phát sinh
đỉnh hoặc noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào sinh dưỡng thực vật có thể
trải qua quá trình phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp. Ví dụ, sự hình
thành phôi (có vai trò như lá mầm sinh dưỡng) cũng có thể xảy ra trên mép lá của
cây sống đời Kalanchoe, cây Malaxis paludosa [Taylor, 1967]. Có nhiều thí nghiệm
phát sinh phôi được bắt đầu từ nuôi cấy in vitro các tế bào sinh dưỡng hoặc tế bào
giao tử (ví dụ: tiểu bào tử). Các dạng thức phát sinh phôi ở thực vật được tóm lược
trên Hình 1.1.
1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng
Theo Moltrasio và cộng sự (2004) thì khả năng phát sinh phôi vô tính được
biểu hiện trước hết là ở mức kiểu gene và điều này có thể được chứng minh dễ dàng
bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gene có khả năng phát sinh phôi
sang kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu tính.
Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài,
nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài chưa thể tạo phôi vô tính. Thậm chí ngay
trong cùng một loài, có kiểu gene dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gene ngăn cản sự
tạo phôi. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có thể được giải
quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng cách chọn
lựa mẫu cấy thích hợp. Vì vậy, việc xác định các đặc tính di truyền có thể chỉ được
sử dụng để xác định vị trí và thời điểm biểu hiện khả năng phát sinh phôi. Do đó
khả năng phát sinh phôi chủ yếu được xác định thông qua chương trình phát triển
của thực vật cũng như những dấu hiệu của môi trường.
Phôi vô tính có thể phát triển trên tất cả các cơ quan của cây cà rốt hoặc cỏ linh
lăng mà có mang những kiểu gene nhất định quy định sự phát sinh phôi; từ đó, cho
thấy biên độ biểu hiện rộng của khả năng phát sinh phôi. Tuy nhiên, ở phần lớn các
loài thực vật, khả năng phát sinh phôi bị hạn chế ở những mô nhất định của kiểu
gene nói trên. Những thí nghiệm nuôi cấy mô cho thấy giữa các cơ quan khác nhau

nhau được ghi nhận; trong đó, những gene đáp ứng với auxin được kích thích hoặc
bị ức chế ở nồng độ auxin rất thấp để chống lại những kiểu gene ngăn cản sự phát
sinh phôi [Börge et al., 1990]. Ngoài ra, auxin còn có tác dụng ức chế sự ra rễ của
những mẫu cắt chồi sinh trưởng in vitro ở nồng độ thấp hơn nhiều [Börge et al.,
1990]. Mô sẹo của các kiểu gene không phát sinh phôi vẫn tiếp tục sinh trưởng
trong môi trường bổ sung 2,4-D có nồng độ tương đương với nồng độ ức chế sự
phân bào của những kiểu gene điều khiển sự phát sinh phôi. Các quan sát trên chỉ ra
những khác biệt đáng kể về tính nhạy cảm với auxin của hai kiểu gene này. Vai trò
quan trọng của các hormone biến dưỡng nội sinh (bị ảnh hưởng bởi tính di truyền,
các dấu hiệu sinh lý và môi trường) trong giai đoạn kích thích phát sinh phôi sinh
dưỡng đã được thừa nhận.
Những tế bào có khả năng phát sinh phôi có đặc điểm là nhân nằm ở vị trí
trung tâm, có những ống siêu nhỏ nổi bật ở gần nhân và những sợi nhỏ actin [Šamaj
et al., 2003]. Verdeil và cộng sự (2001), đã mô tả các tế bào phát sinh phôi ở cây
dừa có các đặc điểm rất rõ ràng: lõm sâu vào vỏ nhân, các thể lưới dictyosomes và
bộ máy golgi nhân lên có quan hệ trực tiếp với sự dày lên các vách tế bào. Ngoài ra,
chúng còn có một cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Các dạng tế bào này vừa có nguồn
gốc từ các mô phân sinh (hoặc mô phát sinh phôi) vừa có thể được tạo ra từ những
tế bào có khoảng không bào lớn trong một số điều kiện thích hợp; chẳng hạn như
sau khi xử lý với 2,4-D. Tuy nhiên, một số loại hormone (ABA, cytokinin) hoặc
stress khác cũng có thể kích thích sự hình thành những kiểu tế bào có khả năng phát
sinh phôi.

Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh phôi vô tính
[Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]
Hệ thống nuôi cấy tế bào trần của cỏ linh lăng cho phép tiến hành những
nghiên cứu chi tiết ở mức độ tế bào đơn và cả ở mức độ quần thể tế bào. Kết quả
cho thấy sự phát triển của những tế bào này phụ thuộc vào nồng độ 2,4-D: môi
trường có bổ sung 1 µM 2,4-D cho phép hình thành những tế bào có khoảng không
bào lớn (không có khả năng phát sinh phôi), trong khi môi trường có bổ sung 2,4-D

việc xác định trạng thái của tế bào xảy ra trong môi trường có 2,4-D, nhưng trong
cùng thời điểm đó thì sự phát triển lại bị ức chế. Việc 2,4-D chỉ là một điểm nút
chuyển đổi trạng thái của tế bào thì đã được nhấn mạnh bằng các thí nghiệm sử
dụng một hệ thống đặc biệt (nuôi cấy huyền phù các vi mô sẹo) nuôi cấy các tế bào
Medicago trong môi trường có bổ sung một loại auxin tổng hợp khác là NAA
[Dudits et al., 1991]. Nếu cấy chuyền những tế bào này sang môi trường không có
chất điều hòa sinh trưởng thì chúng sẽ tạo rễ với tần số cao. Nếu những tế bào này
được xử lý 2,4-D ở nồng độ cao (100 M) trong một khoảng thời gian ngắn
(khoảng vài phút) rồi cấy chuyền sang môi trường không có chất điều hòa tăng
trưởng thì chúng sẽ phát triển thành phôi vô tính. Tuy nhiên, phải 2-3 tuần sau khi
xử lý thì mới có thể quan sát được những khối phôi đầu tiên trên bề mặt của mô sẹo.
Dựa trên cơ sở những thí nghiệm này, hiệu quả phát sinh phôi cao đạt được khi nuôi
cấy các mảnh cấy lá mầm cây cà rốt trên môi trường bổ sung 450 M 2,4-D trong
thời gian 2 giờ [Kitamiya et al., 2000].
Thực ra, những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng 2,4-D rất cần thiết để khởi sự
chương trình phát sinh phôi. Việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường không có
2,4-D có vai trò quan trọng trong việc thiết lập tính phân cực của tế bào, đây được
xem là một trong những sự kiện đầu tiên của quá trình phát triển phôi [Fehér et al.,
2003].
1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính

Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi.
[Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007] Sự khởi đầu quá trình phát triển phát sinh phôi ở các tế bào đã biệt hóa đòi hỏi
một quá trình tái chương trình hóa tế bào hoàn chỉnh. Quá trình này đi kèm với
những thay đổi hoàn toàn về mặt hình thái và sinh lý; trong đó, việc tái chương trình
hóa kiểu biểu hiện tổng thể của các gene là hết sức quan trọng. Trong những năm
gần đây, việc kiểm soát nghiêm ngặt sự cải biến các nhiễm sắc thể phản ứng lại các

chức năng không ức chế sự phát sinh phôi trong những đột biến pickle.
Dựa vào những bằng chứng trên, chúng ta có thể đưa ra giả thiết rằng trong
suốt quá trình cảm ứng phát sinh phôi vô tính, sự tái tổ chức của nhiễm sắc thể đã
làm giảm chương trình phát sinh phôi, mặt khác bị ức chế bởi các cơ chế bất hoạt
nhiễm sắc thể trong các tế bào sinh dưỡng thực vật. Những protein có chứa vùng
nhiễm sắc thể có cấu trúc tương tự Polycomb đã được tìm thấy trong quá trình phát
sinh phôi hợp tử và phôi vô tính của cà rốt. Ngoài ra, sự biểu hiện của lec1 trong
suốt quá trình phát sinh phôi vô tính đã được chứng minh ở cà rốt và cỏ linh lăng
[Yazawa et al., 2004]. Cụ thể, với cà rốt, gene c-lec1 xuất hiện trong các mẫu cấy
phôi và gene này biểu hiện rõ chỉ 1 ngày sau khi cấy chuyền sang môi trường không
có 2,4-D ; trong khi đó, ở cỏ linh lăng, khi gây shock mẫu cấy bằng 2,4-D trong 1
giờ sau nhiều tuần nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng,
sự biểu hiện của ms-lec1 chỉ gia tăng vào giai đoạn biệt hóa phôi (3 tuần sau khi
cảm ứng) [Fehér et al., 2003]. Nghiên cứu này đã củng cố cho giả thuyết rằng ở hệ
thống nuôi cấy phát sinh phôi cây cà rốt thì quá trình phát sinh phôi diễn ra trước
khi mẫu cấy được cấy chuyền sang môi trường không có 2,4-D.
1.1.5. Sự phát sinh phôi vô tính
Sự phát sinh phôi vô tính được định nghĩa là một quá trình mà trong đó cấu
trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính phát triển từ một tế bào sinh dưỡng và không có
liên kết mao mạch với tế bào gốc ban đầu. Sự phát sinh phôi vô tính xảy ra thông
qua một số giai đoạn tương tự như phôi hữu tính. Phôi vô tính có thể biệt hóa trực
tiếp từ mẫu cấy không cần đi qua giai đoạn mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo trung gian. Mẫu cấy trong phát sinh phôi trực tiếp thường là các vi
bào tử, noãn bào, phôi hữu tính hoặc phôi vô tính và cây con.
Khác biệt giữa phát sinh phôi trực tiếp và gián tiếp vẫn chưa được hiểu rõ.
Theo những giả thuyết trước đây, phát sinh trực tiếp xảy ra từ các tế bào có nguồn
gốc từ phôi. Ngược lại, phát sinh gián tiếp lại xảy ra ở các tế bào chưa biệt hóa và
đầu tiên sẽ tạo thành các mô sẹo không biệt hóa. Tuy nhiên, trong thực tế mô sẹo

1.1.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính
Quá trình hình thành phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn quan
trọng và có tính chất thương mại rất lớn, đặc biệt là trong vi nhân giống in vitro.
Trên lý thuyết, từ một mẫu mô được nuôi cấy có thể sản xuất ra vô số tế bào phôi.
Tốc độ nhân giống từ phôi cao hơn nhiều so với nhân giống từ mô phân sinh. Ngoài
ra, số lượng lớn của phôi chính là một nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho
những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như sản xuất hạt nhân tạo, cải thiện chất
lượng cây trồng (là nguyên liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gene, lai soma, tạo
thành những cây đa bội), bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các chất biến
dưỡng in vitro và sự thành lập khuẩn căn in vitro.
1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH
1.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng
Nhằm khôi phục khả năng phát sinh phôi vô tính từ các tế bào đã suy giảm
hoặc mất đi khả năng này, các chất điều hòa sinh trưởng phải được sử dụng trong
hầu hết các hệ thống nuôi cấy phôi vô tính. Trong đó, 2,4-D là loại auxin tổng hợp
được sử dụng phổ biến nhất. Những auxin khác như IBA và picloram cũng được sử
dụng; thậm chí cả các auxin yếu như NAA và IAA cũng được dùng trong một vài
hệ thống nuôi cấy. Auxin được dùng cho cảm ứng hình thành tế bào phát triển phôi,
có lẽ do hoạt hóa phân hóa gene khởi đầu và cũng thúc đẩy tăng quần thể tế bào qua
phân bào liên tiếp; đồng thời ngăn cản sinh trưởng và biệt hóa tế bào thành các phôi. Trong trường hợp mẫu cấy có chứa các tế bào phát triển phôi thì môi trường
nuôi cấy có thể không cần đến auxin.
Ngoài auxin, các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh ở các loài
thực vật hai lá mầm. Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy
là BAP, nhưng các cytokinin khác như Kin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tùy
thuộc vào loại thực vật. Trong nuôi cấy phôi, nồng độ của các chất điều hòa sinh
trưởng là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy. Khi nồng
độ quá thấp sẽ không kích thích sinh trưởng, ngược lại hàm lượng quá cao có thể