1
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
“Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ
cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”.
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nitơ (N) là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay cả
đối với vi sinh vật. Nguồn dự trữ N trong tự nhiên rất lớn chỉ tính riêng trong không khí
N chiếm khoảng 78,16% thể tích. Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên
1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn N, lượng N này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây
trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng. Trong cơ thể các
loại vi sinh vật chứa khoảng 4,1015 tỷ tấn N. Cây trồng cũng như các loại động vật và
người không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn N
2
tự do từ không khí (Nester et
al.,2004). Nhưng tất cả nguồn N trên cây trồng đều không tự đồng hóa được mà phải
nhờ vi sinh vật. Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn N. Bằng cách bón
phân con người đã trả lại cho đất khoảng hơn 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản được
bổ xung bằng Nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật. Vì vậy việc nghiên cứu sử dụng
loại đạm sinh học này được xem là một giải pháp quan trọng trong nông nghiệp, đặc biệt
trong sự phát triển để hướng tới một nền nông nghiệp sinh thái bền vững Tuy nhiên tồn
tại một số vi sinh vật có khả năng biến N
2
trong khí quyển thành NH
3
cung cấp đạm cho
cây mà chỉ cần một lượng năng lượng rất ít (3-5kcal/M). Chúng được gọi chung là các vi
sinh vật cố định đạm.
Phân bón vi sinh (Nitragin) ra đời tại Đức năm 1896 do Noble Hiltner sản xuất là
công trình ứng dụng cơ chế cố định đạm sinh học đầu tiên và sau đó đã phát triển mạnh
mẽ ra các nước khác. Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây
ngô ở Đăk Lăk.
- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩncó hoạt tính cố định
đạm cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.
3. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
Xác định được một số chủng vi khuẩncó khả năng cố định đạm, sống nội sinh
trong rễ cây ngô.
Ý nghĩa thực tiễn
3
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh
trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng
cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần
phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
4
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây ngô
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại thực vật
Ngô có tên khoa học là !"# (Zea: Từ Hi Lạp để chỉ cây ngũ cốc và từ
Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ [9]. Cũng có thể Mays là từ
“Maya” tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây ngô) [17].
Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Poales
Chi : Zea
Loài : Mays
Bộ nhiễm sắc thể (2n=20).
Có nhiều cách để người ta phân loại ngô, một trong các cách đó là dựa vào cấu
trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài của hạt. Ngô được phân thành các loài phụ:
mỗi hoa cái có một râu. Hoa cái mọc từng đôi trên hoa tự. Mỗi chùm hoa có hai
hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một hoa hình thành hạt, một đôi chùm
hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên bắp luôn luôn chẵn.
Bắp ngô: Phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây
ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ thuộc vào
giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ cây 2-3 bắp, số hạt trên
bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có khác nhau.
Hạt ngô: Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây. Thuộc loại quả dĩnh, gồm các
bộ phận chính là vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần
6
dính liền hạt với lõi ngô. Hạt ngô được hình thành gồm các giai đoạn: từ thụ phấn đến
chín sữa là 10 – 15 ngày, từ chín sữa đến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp đến chín
hoàn toàn là 10 – 15 ngày.
1.1.3. Yêu cầu sinh thái của cây ngô [17],[21]
1.1.3.1. Yêu cầu nhiệt độ
Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 20
0
C - 28
0
C.
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây ngô. Trong cả chu kỳ
sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần một lượng
tích nhiệt nhất định. Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển bình thường. Tùy
vào từng giống khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau. Giống càng chín
muộn thì cần lượng tích nhiệt càng cao.
1.1.3.2. Yêu cầu về ánh sáng
Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt đới thuộc nhóm cây ngày ngắn. Ánh sáng là yếu
tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài của quá trình sinh trưởng. Trung
bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày.
loại đất vụ trước trồng các cây họ đậu, hoặc các cây phân xanh cải tạo đất.
1.1.3.5. Yêu cầu chế độ không khí trong đất
Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng còn
phải chú ý đến chế độ không khí ở trong đất. Chế độ không khí ảnh hưởng gián tiếp
thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến đổi hóa học trong đất.
Cây ngô đặc biệt là rễ ngô phát triển tốt trong điều kiện háo khí, nếu đất chặt bí thiếu tơi
xốp thì rễ ngô phát triển kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng
khoáng và nước kém. Dẫn đến tình trạng cây ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát
triển kém.
1.1.4. Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô [17],[21]
1.1.4.1. Vai trò của đạm
Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, đóng vai trò tạo năng suất và chất
lượng của ngô, 66% đạm được tích luỹ trong hạt. Cây ngô hút đạm tăng dần từ khi
cây có 3 – 4 lá tới trước trổ cờ. Ở nước ta, một số kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ
hút đạm mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ cờ, nếu các giai đoạn này mà thiếu
đạm thì năng suất giảm rõ rệt.
8
Triệu chứng thiếu đạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già có vệt
xém đỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp.
1.1.4.2. Vai trò của lân
Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai đoạn
cây non lại rất yếu. Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không được nhiều lân, đó là thời kỳ
khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai đoạn này sẽ làm giảm năng suất
nghiêm trọng. Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng lượng lân yêu cầu) ở
thời kỳ 6 – 12 lá sau đó giảm đi ở các thời kỳ sau.
Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá và gốc
cây, trái cong queo. Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết. Hiện tượng
này xảy ra ở lá già trước, sau đó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ đông trong
điều kiện thời tiết khắc nghiệt.
1.1.4.3.Vai trò của kali
phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp. Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó
sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao. Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được
dùng làm thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu. Ngô là
nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho
các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng
khác nhau cho các ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và
công nghiệp nhẹ. Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu. Hàng năm lượng ngô xuất khẩu
khoảng 70 triệu tấn. Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các nước
xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước nhập chính là
Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [9]. Ngô vừa là cây lương thực,
vừa là cây thức ăn cho gia súc. Chính vì vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không
ngừng. Năm 1979 diện tích trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là
475,4 triệu tấn, đến năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3
triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008). Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng
cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả
nước. ĐăkLak là vùng có sản lượng bắp cao nhất nước đạt 622 nghìn tấn, kế đến là Sơn
La, Đồng Nai với sản lượng lần lượt là 506 và 305,3 nghìn tấn mỗi năm.
10
%& www.asiacreative.vn
Biểu đồ: 1.1 Sản lượng bắp của Việt Nam 2013
Hàm lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các
giống ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của hạt ngô tốt
phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng.
1.2. Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N )
1.2.1. Nitơ và quá trình cố định nitơ
Nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng liên kết III
bền vững N ≡ N. Nitơ trong khí quyển tồn tại dưới dạng khí N
2
và chiếm khoảng 79%
thể tích không khí. Mặc dù sống trong "đại dương nitơ" nhưng thực vật nói chung không
2
có thể là hydro phân tử (H
2
). Trong trường hợp này thì
dưới tác dụng của enzyme hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống.
Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyền
điện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme
hydrogenase và nitrogenase để cố định N2.
Sự cố định N
2
của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn. Trong
các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi là
leghemoglobin. Nó dễ liên kết với O
2
để biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ
12
được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các
Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N
2
.
Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ cộng sinh có
thể biểu diễn bởi sơ đồ sau:
1.2.2. Vi khuẩn cố định N
Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N
2
và
cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà khoa học, các
nhóm vi sinh vật cố định đạm BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240
x 10
6
bao bọc bởi một lớp nhầy.
Khuẩn lạc của có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo. Các
nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng
Carbon. Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1g dinh dưỡng Carbon.
Trong đất, tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây. Ngoài khả năng
cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm, kích thích sinh
trưởng. Trong đất, thường phổ biến các nòi sau:
+ Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả năng di
động khi còn non. Khi già hình thành nang xác. Khuẩn lạc có màu nâu
hoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường.
+ (Có kích thước 2,4 x 4,6 micromet. Không có khả
năng di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không
khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy.
+ Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả năng
di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào
môi trường.
+ Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả năng di
động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch
tán vào môi trường [7].
1.2.2.3. Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium
' được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Vi khuẩn
'có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể đứng riêng rẽ hoặc kẹp
14
đôi thành chuỗi ngắn. Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô
hạn. 'có khả năng tích lũy được 10 - 15mg N phân tử khi đồng hóa hết 1g
đường Carbon [7].
1.2.3. Vi khuẩn cố định N cộng sinh
1.2.3.1. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu
Vi khuẩn cố định N cộng sinh với cây họ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần. Chúng
hình thành các nốt sần với rễ cây họ đậu như cây đậu tương, lạc, điền thanh, muồng, cốt
15
Là một giống mới được đề nghị với một loài là
chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của
- Sinorhizobium
Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được phân
lập từ Trung Quốc. Giống gồm có 2 loài là * và
$(.
1.2.3.2. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ đậu
- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay thanh
tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đến các thực vật hạt
kín [7].
- Azospirillum
Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đường kính
1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển động trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao dài ở đầu
( polan flagellum), trong môi trường đặc ở 30
0
C nhiều tiêm mao bên (lateral flagellum)
ngắn hơn cũng được thành lập.
Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này sống ở
trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậu như lúa, bắp, mía,
sorghum, và một số loại cỏ.
giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza và
ctv, 2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng
năng suất lúa được 10 - 30% [11].
tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện diện
hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu khí. Nhiệt độ
tối hảo từ 35 - 37
0
C. Một số dòng là những vi sinh vật tự dưỡng không bắt
buộc. Vi khuẩn phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ như malate,
thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn ( pellicle). Khi cấy chuyển lên môi trường đặc
Nfb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường
đặc BMS thu được khuẩn lạc màu trắng sữa.
- có khả năng cố định đạm cộng sinh trong mô của những cây thân
cỏ như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm. Ngoài ra chúng còn tạo ra những sản
phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho sự tăng trưởng của cây.
- Burkholderia [11].
17
Vi khuẩn thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que, đường
kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Jesús et al, 2004).
sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng trong
môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi
cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001). Trong môi trường nuôi cấy chúng tạo thành các
khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2 - 4mm, tròn, phẳng hoặc dài
(Jesús et al, 2004). sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định
đạm.Ví dụ như khi các vi khuẩn sống cộng sinh với cây luá sẽ cố định
đạm khoảng 19% tổng lượng đạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa. Năng suất của cây
lúa có chủng loài tương đương với năng suất của cây lúa
không chủng loài nhưng có bón phân đạm 25 - 30kg/ha
(Van et al, 2000).
Vi khuẩn và có dạng que
ngắn, một số có dạng que dài và tất cả đều có khả năng chuyển động nhờ chiêm mao
(Lương Thị Phương Thảo, 2010). Những đặc điểm trên cũng là những đặc điểm nổi bật
của hình dạng cố định đạm. Đa số các dòng Burkholderia có khuẩn lạc
màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên, một số khuẩn lạc có màu vàng, bìa
răng cưa, kích thước khuẩn lạc từ 0.5–1.5 mm. (Nguyển Thị Minh Thư, 2010)
được tìm thấy ở rễ bắp, lúa và cà phê (Estrada et al., 2001).
Loài được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng ở miền nam Việt
Nam, thí nghiệm ở cây lúa chủng sau 14 ngày chúng giúp
mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh vật cố định N
2
mà thành phần còn được
bổ sung phối hợp thêm một số chủng vi sinh vật có ích khác ví dụ như xạ khuẩn cố định
N sống tự do các vi khuẩn cố định N sống tự do '
()))
Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm cho đất và hạt giống, cây con
đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng. Theo nghiên cứu của Puneet
(1998) cho thấy việc nhiễm kích thích nẩy mầm của hạt, kích thích ra rễ
và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đối chứng [30].
Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho
thấy sử dụng chế phẩm có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg
N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt đến 240 triệu
19
tấn/năm. Vi khuẩn cố định N tự do còn có khả năng tổng hợp B1,
giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [33].
Fulchieri (1993) nghiên cứu sử dụng 3 chủng để xử lý hạt cho ngô.
Kết quả cho thấy đã làm tăng chiều cao cây, tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên
59% so với đối chứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng 60 kg N/ha [35].
Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp )
với các chủng phân giải P như sẽ làm tăng năng suất lúa mì tăng
17,7%, trong khi chỉ tăng 9% . Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối
hợp chủng với các chủng phân giải phosphat như
) Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 10-20% [35].
El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N và phân
giải lân xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm lượng N trong thân
lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-53%; hàm lượng P trong thân
tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với đối chứng không xử lý. Kết quả nghiên
cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn
chủng [34].
và và các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm khác
làm phân sinh học.
Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng của
Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh tổng
hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là 25-30
0
C,
pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [10].
Nguyễn Hữu Hiệp, Renato đã phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất
phân vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mía trồng tại tỉnh Sóc Trăng”. Cao
Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Mít cũng nghiên cứu hiệu quả phân vi khuẩn
," và vi khuẩn trên năng suất
và trữ lượng đường trên cây mía (**L.) trồng trên đất phù sa tỉnh
Hậu Giang”. Trần Thanh Phong (2012) cũng nghiên cứu đánh giá khả năng cố định
đạm của vi khuẩn nội sinh đến năng suất và chất lượng của trái khóm trồng tại Huyện
Tân Phước, Tỉnh Tiền Giang” [12].
Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng trên đất gò đồi
vùng Thừa Thiên - Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng có khả năng
21
kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8). Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây
giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và
hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [14].
Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố định N tự
do và chủng phân giải phosphate ,
. Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh trưởng chiều cao mạ 7,47
- 16,93% và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [3].
Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón đơn
chủng, đa chủng cho cây trồng. Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là
(""$)Thử nghiệm trên
khoai tây làm tăng năng suất từ 100 - 300% so với đối chứng [19].
2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
* Vật liệu:
- Các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh được phân lập từ rễ cây ngô trong
giai đoạn trổ cờ tại huyện Ea Súp, Buôn Ma Thuột, Krông Năng thuộc tỉnh Đăk Lăk.
- Giống ngô lai Giống DK-888 là một giống lai đơn do tập đoàn Charoen -
Pokphand của Thái Lan sản xuất.
* Hóa chất: Acid Malic, KH
2
PO
4
, Na
2
MoO
4
, CuSO
4
, ZnSO
4
, Saccarose, Agar,
Biotin, Pyridoxine
* Thiết bị nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette, que cấy, box cấy vô trùng, máy
quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản), máy ủ nhiệt, nồi hấp khử trùng, PCR
C1000 (Biorad, Mỹ); GelDoc (Biorad, Mỹ); Điện di Biorad (Mỹ).
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu.
- Địa điểm thu mẫu: Được thực hiện tại các huyện Ea Súp, Krông Năng, Krông
Păk thuộc tỉnh Đăk Lăk.
- Địa điểm thí nghiệm: Được thực hiện tại viện CNSH & MT, Trường Đại học
Tây Nguyên.
- Địa điểm thực nghiệm: Tại xã Ea Rôk – Huyện Ea Súp – Tỉnh Đăk Lăk.
0
C trong vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3
lần.
Quan sát những ống nghiệm có vòng đậm (vòng pellicle), cách bề mặt môi
trường 2 – 5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm nội sinh. Chuyển vi
khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc tiến hành làm thuần giống [20].
Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi
trường Nfb đặc để thu khuẩn lạc đơn. Quá trình làm thuần được tiến hành 2 - 3 lần.
Chọn khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống
[6],[7],[20].
* Môi trường Nfb không đạm: [6], [32].
25
- Acid Malic: 5g
- K
2
HPO
4
: 0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g
- NaCl: 0,1g
- CaCl
2
: 0,02g
- KOH: 4g
- 1 ml dung dịch stock vitamin (10 mg biotin và 20mg pyridoxine trong 100 ml
nước cất).
khuẩn cố định đạm nội sinh.
Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm
sinh học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994.
2.3.3.1. Phương pháp nhuộm gram.
Nhuộm gram bằng bộ kit nhuộm: Crystol Violet, Lugol, ethanol 95%, dung dịch
safanin 0,5%, nước cất.
2.3.3.2. Phương pháp đo kích thước tế bào vi khuẩn.
Kích thước vi khuẩn được đo trên kính hiển vi điện tử có thị kính ×10, vật
kính ×40.
Quan sát vào kính hiển vi ta thấy có 5 khoảng chia của thước đo vật kính
(tức 50 µm) nằm gọn vào 20 khoảng chia của thước đo thị kính, vậy mỗi khoảng
chia của thước đo thị kính với độ phóng đại đang dùng là 2,5 µm.
Tiến hành đo kích thước theo trình tự sau.
Copyright: Tài liệu đại học ©