ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*****
NGUYỄN HỒ THƯ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH, ỨNG DỤNG
VÀ BIỆN PHÁP KIỀM CHẾ TÁC HẠI CỦA
ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TỪ THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2012

vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

: Thí nghiệm
UI
: Đơn vị hoạt độ E
ΣUI
: Tổng đơn vị hoạt độ E
VddE
: Thể tích dung dịch enzymeVEthanol
: Thể tích ethanol
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau 18
Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản trong lá trà tươi 36
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng xác định hoạt độ của PPO 41
Bảng 2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn Bradford 42
Bảng 3.1. Độ ẩm của lá trà nguyên liệu 50
Bảng 3.2. Hoạt độ chung của PPO trong nguyên liệu 50
Bảng 3.3. Hàm lượng protein trong nguyên liệu 51
Bảng 3.4. Hoạt độ riêng của PPO từ nguyên liệu 51
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO 52
vii
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 53
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của
PPO
54
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của
PPO
56

PPO 88
Bảng 5.8. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của
PPO theo thời gian 89
Bảng 5.9. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ
chất đến hoạt độ của PPO
92
Bảng 5.10. Giá trị OD tương ứng khi xác định động học phản ứng của
PPO theo thời gian
93
Bảng 5.11. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid ascorbic đến hoạt
độ của PPO 94
Bảng 5.12. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid citric đến hoạt độ
của PPO 95
Bảng 5.13. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của NaCl đến
hoạt độ của PPO 96
Bảng 5.14. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen
(mẫu TN)
97
Bảng 5.15. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh
(mẫu TN)
97
Bảng 5.16. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ chế phẩm PPO thô
từ nguyên liệu 98
Bảng 5.17. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong
CPE – PPO thô 98
Bảng 5.18. Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của
benzoquinon ở bước sóng 420nm 98
Bảng 5.19. Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin 100
Bảng 5.20. Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch
ix

Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase 9
Hình 1.2. Cấu trúc của tyrosinase 10
x
Hình 1.3. Chu trình xúc tác hydroxyl hóa của monophenol và oxi hóa của o-diphenol
thành o-quinone bởi tyrosinase 12 Hình 1.4. Phản ứng
xúc tác của laccase 13
Hình 1.5. Trung tâm hoạt động với nguyên tử đồng của laccase 14
Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của laccase 15
Hình 1.7. (a) Chu trình xúc tác của laccase
(b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator 16
Hình 1.8. Cấu trúc của vài hợp chất polyphenol trong tự nhiên 33
Hình 1.9. Cây trà
35
Hình 3.1. Sản phẩm trà xanh 67
Hình 3.2. Sản phẩm trà đen 67
Hình 3.3. Nước trà đen và trà xanh 68
Hình 5.1. Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol 103
Hình 5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây 103
Hình 5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây 104
Hình 5.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây 104
Hình 5.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây 105
Hình 5.6. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây 105
Hình 5.7. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây 106
Hình 5.8. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây 106
Hình 5.9. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây 107
Hình 5.10. Chế phẩm PPO thô từ lá trà 107
ii
MỤC LỤC

Lời cảm ơn

1.2.6. Chức năng sinh học của PPO 22
1.2.7. Ứng dụng của PPO 23
1.2.7.1. Trong công nghiệp thực phẩm 24
1.2.7.2. Trong các ngành công nghiệp khác 25
1.2.7.3. Trong công nghệ môi trường 26
1.2.7.4. Trong y học và mỹ phẩm 26
1.2.7.5. Trong công nghệ sinh học nano 27
1.2.8. Sự ức chế PPO 27
1.2.8.1. Phương pháp vật lý 28
1.2.8.2. Phương pháp hóa học 29
1.2.8.3. Phương pháp enzyme
32
1.2.8.4. Phương pháp gen
32
1.2.9. Cơ chất của PPO: Phenol 33
1.3. Cây trà và các sản phẩm từ trà 34
1.3.1. Giới thiệu chung về cây trà 34
1.3.2. Các sản phẩm từ trà 36
CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
39
2.1. Vật liệu
39
2.1.1. Nguyên liệu
39
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 39
2.1.3. Hóa chất
39
iv
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
39

45
2.2.7. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà
trong công nghệ chế biến trà 46
2.2.7.1. Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa
hợp chất polyphenol thành quinon trong công nghệ chế
biến trà
46
2.2.7.2. Phương pháp chế biến trà đen 46
2.2.7.3. Phương pháp chế biến trà xanh 47
2.2.8. Phương pháp nghiên cứu một số biện pháp kiềm chế tác hại
của PPO gây sẫm màu rau củ, trái cây 48
2.2.9. Phương pháp thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 49
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 50
3.1. Khảo sát các đặc tính của lá trà nguyên liệu 50
3.1.1. Xác định độ ẩm của lá trà nguyên liệu 50
3.1.2. Xác định hoạt độ của PPO trong nguyên liệu 50
3.1.3. Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu 51
3.1.4. Xác định hoạt độ riêng của PPO trong nguyên liệu 51
3.2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho hoạt động của PPO trong lá
trà nguyên liệu 52
3.2.1. Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của PPO 52

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 53
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO 54

3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 56
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời
vi
gian
57

phenol thành quinon với sự tham gia của oxi nguyên tử. Hiện nay có rất nhiều công
trình nghiên cứu trong và ngoài nước về PPO, các kết quả nghiên cứu cho thấy PPO
thu nhận từ các nguồn khác nhau có nhiều tính chất khác nhau. PPO có nhiều ứng
dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy, công
nghiệp dệt may, công nghệ y học và môi trường.
Đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm PPO có hai tác dụng chính: tác dụng có
lợi của PPO là loại hợp chất phenolic trong bia, rượu và nước trái cây, tạo màu và
tăng hương vị cho các sản phẩm cà phê, trà, cacao và đánh giá chất lượng thực phẩm.
Tác dụng có hại là PPO xúc tác quá trình oxi hóa phenol thành quinon tạo màu nâu
trong mô bị tổn thương được xem là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng hóa nâu ở
nhiều loại trái cây và rau củ trong quá trình thu hoạch, bảo quản và chế biến, gây ảnh
hưởng đến chất lượng thực phẩm và giảm khả năng chấp nhận của người tiêu dùng
và do đó tác động đáng kể đến nền kinh tế, ảnh hưởng đến nhà sản xuất và ngành
công nghiệp chế biến thực phẩm. Ước tính hơn 50% rau quả bị thiệt hại do enzyme
gây hiện tượng hóa nâu, trong đó trái cây và rau củ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
dễ xảy ra hiện tượng này.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu các đặc
tính, ứng dụng và biện pháp kiềm chế tác hại của enzyme polyphenol oxidase
từ thực vật” với mục tiêu là khảo sát các đặc tính của PPO trên cơ sở đó để ứng dụng
tính chất có lợi của enzyme trong tạo màu cho thực phẩm và kiềm chế tác hại của
enzyme gây hiện tượng sẫm màu ở rau quả.

1
Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm :
- Khảo sát các đặc tính và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của
enzyme PPO như nhiệt độ, pH, cơ chất, các chất ức chế enzyme, ….
- Khảo sát ứng dụng của enzyme trong việc tạo màu cho sản phẩm thực

Quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa Trường đại học Khoa học tự nhiên TPHCM đã
luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành luận văn.
UBND tỉnh Bến Tre, Sở GD&ĐT tỉnh Bến Tre, Quý thầy cô và các bạn đồng
nghiệp Trường THPT Huỳnh Tấn Phát tỉnh Bến Tre đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ
em trong suốt thời gian học vừa qua.
Con xin khắc ghi sâu sắc công ơn sinh thành và dưỡng dục của Ba, Mẹ và
gia đình đã vất vả nuôi dưỡng cho con có được ngày hôm nay.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị làm ở phòng thí nghiệm của
Bộ môn Sinh hóa, các bạn cao học khóa 20 đã luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012
Nguyễn Hồ Thƣ

i
3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về enzyme oxi hóa khử
Quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ trong cơ thể sinh vật do hệ enzyme oxi hóa
khử xúc tác. Các enzyme này thuộc nhóm chính 1 trong hệ thống phân loại enzyme
và có tên gọi chung là oxidoreductase. Trong điều kiện sinh học oxi phân tử có khả
năng oxi hóa cơ chất khi được hoạt hóa bởi các enzyme đặc hiệu – các chất hoạt hóa
oxi (oxydase) hay các chất hoạt hóa hidro (dehydrogenase). Nhóm enzyme oxi hóa
khử rất phổ biến trong tế bào của mọi sinh vật vì phản ứng oxi hóa khử là một trong
những quá trình cơ bản nhất của sự sống. [10]
1.1.1.Các dehydrogenase [10]
Đa số các phản ứng oxi hóa sinh học là phản ứng tách hidro khỏi cơ chất. Enzyme
xúc tác quá trình này gọi là dehydrogenase. Cơ chế tác dụng của chúng được biểu
diễn theo sơ đồ phản ứng :

5

Sơ đồ phản ứng tổng quát

1.1.1.3. Dehydrogenase – ubiquinon (UQ)
Enzyme dehydrogenase – ubiquinon được tìm ra năm 1960 bởi D.E.Green, enzyme
có nhóm ngoại là ubiquinon và là enzyme quan trọng xếp thứ tự thứ 3 trong chuỗi hô
hấp sau NAD (hay NADP) và FAD (hay FMN) đến UQ, trước khi vào hệ chuyển
electron cytocrom trong chuỗi hô hấp
AH
2
→ NAD → FAD → UQ → hệ cytocrom → O
2
→ H
2
O + Q
(hay NADP) (hay FMN)

Nhóm hoạt động có chức năng chuyển và nhận H
+
là vòng quinon theo sơ đồ
sau
6

Phương trình tổng quát chuyển hydro của enzyme – ubiquinon

Enzyme trao đổi [H
+
] với cơ chất AH
2

* Peroxidase (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): là nhóm enzyme oxi
hóa tách oxi từ peroxit (H
2
O
2
) hoặc các peroxit hữu cơ khác. Cơ chất được oxi hóa
nhờ peroxidase ở cơ thể thường là polyphenol hoặc các axit amin mạch vòng
AH
2
+ H
2
O
2
→ A + 2H
2
O
* Catalase (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): Xúc tác phản ứng phân
hủy H
2
O
2
tạo O
2
theo phản ứng

* Polyphenol oxidase (có chứa Cu trong thành phần cấu tạo): là enzyme
xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon. Enzyme này khá phổ
biến trong thực vật và vi khuẩn. Polyphenol oxidase không có tính đặc hiệu cơ chất
cao.
Polyphenol oxidase và polyphenol có trong rau củ và trái cây nên khi rau quả

tôm hùm PPO được tách chiết từ lớp da nằm giữa cơ và bộ xương ngoài. [54]
1.2.3. Phân loại
PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của
enzyme bao gồm tyrosinase, catechol oxidase và laccase. [41]

9
1.2.3.1. Tyrosinase và catechol oxidase
a. Khái niệm
Tyrosinase (E.C.1.14.18.1, monophenol monooxydase) và catechol oxidase (E.C.
1.10.3.1, o-diphenol oxidase) là hai enzyme có cấu trúc tương tự thuộc nhóm
metalloprotein có chứa nguyên tử đồng dạng 3.
Tyrosinase xúc tác 2 phản ứng khác nhau : hydroxyl hóa monophenol thành o-
diphenol (hoạt tính cresolase hay monophenolase) và sau đó oxi hóa o-diphenol thành
o-quinone tương ứng (hoạt tính catecholase hay diphenolase) và đồng thời khử phân
tử oxi thành nước. Enzyme chỉ xúc tác oxi hóa ο-diphenol thành ο-quinon tương ứng
được gọi là catechol oxidase và thông qua hoạt tính xúc tác để phân biệt catechol
oxidase với tyrosinase. [14, 26, 41]

Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase [41]
b. Cấu trúc phân tử của tyrosinase và catechol oxidase
Tyrosinase và catechol oxidase có cấu trúc đặc trưng gồm 3 domain : một
domain đầu N, một domain trung tâm xúc tác chứa một cặp ion đồng (CuA và CuB)
và một domain đầu C nối với domain xúc tác bởi vùng liên kết phi cấu trúc. Mỗi ion
đồng ở trung tâm xúc tác gắn với ba gốc histidine (His) là nơi tương tác của tyrosinase
với cả phân tử oxi và cơ chất phenolic [33]. Tyrosinase được mô tả là enzyme
10
monomeric, trong khi phân tích cấu trúc của tyrosinase từ Bacillus megaterium phát

+ H
2
O
Khi o-diphenol hiện diện trong hệ thống phản ứng, sự oxi hóa xảy ra tạo ra o-
quinone tương ứng. Nhưng nếu monophenol được sử dụng là cơ chất, hoạt động của
enzyme xuất hiện khi có tác nhân khử. Phân tử oxi kết hợp với deoxy-
tyrosinase và oxi hóa nó thành oxy-tyrosinase.
E deoxy + O2 → E oxy
Bước tiếp theo của quá trình oxi hóa khử là sự cạnh tranh của monophenol và
o-diphenol. Khi cơ chất monophenol trội hơn trong hỗn hợp phản ứng, oxy-
tyrosinase kết hợp với monophenol và oxi hóa nó thành o-diphenol. Sản phẩm o-
diphenol trong chu trình này thì tiếp tục bị oxi hóa thành o-quinone.
E
oxy
+ monophenol → E
oxy
– M + H
+

E
oxy
– M → E
met
– D
E
met
– D + H
+
→ E
deoxy

Deoxy-tyrosinase bị oxi hóa thành dạng oxy với phân tử oxi
E
met
+ o-diphenol → E
met
–D
E
met
–D + H
+
→ E
deoxy
+ o-quinone + H
2
O
Chu trình này được coi như chu trình diphenolase (hay catecholase). [39]

Hình 1.3. Chu trình xúc tác hydroxyl hóa của monophenol và
oxi hóa của o-diphenol thành o-quinone bởi tyrosinase
(M=monophenol và D=diphenol) (Solomon et al. 1996) [39]
1.2.3.2. Laccase
a. Khái niệm

Trích đoạn Phƣơng pháp nghiên cứu Xác định hoạt độ riêng của PPO Thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu

---