LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH
HỌC

“Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc
chi Streptomyces sinh chất
kháng sinh chống nấm gây
bệnh trên cây chè ở Thái
Nguyên” BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN - 2008



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
  
BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công
bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008

Tác giả Bùi Thị Hà
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI 8
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 8
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 10
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 10
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11
1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12
1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh 12
1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15
1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16
1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA
CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18
1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 18
1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật 21
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và hóa chất 24
2.1.1. Nguyên liệu 24
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè 27
2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28
2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh 28
2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29

3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 52
3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 54
3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ 56
3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 57
3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57
3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58
Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận 60
4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo 61
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN XK : Xạ khuẩn
VSV : Vi sinh vật
CKS : Chất kháng sinh
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
KTKS : Khuẩn ty khí sinh
HTKS : Hoạt tính kháng sinh
HTKN : Hoạt tính kháng nấm
MT : Môi trƣờng
KHVQH : Kính hiển vi quang học
KHVĐT : Kính hiển vi điện tử
DNA : Deoxyribonucleic Acid

Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm
kiểm định 48
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis 50
Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52
Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng
lên men khác nhau 53
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS
của 2 chủng R2 và Đ1 55
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2
chủng R2 và Đ1 56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh 38
Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 40
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 42
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2 42

những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy
việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống
nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo
vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới
hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong
phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây
chè ở Thái Nguyên”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-2-
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có
hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng
dụng.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
* Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Thái Nguyên.
- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên.
* Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV
kiểm định.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.

năng sinh chất kháng sinh.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc
từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như
gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi.
Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá
nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-4-
amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể
gây bệnh cho người, động vật [7].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng
0,2 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một
trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm
mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ
quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ
vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…

khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ
khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF),
dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có
hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của
cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ,
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành
dạng lông [9].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-6-
Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu
protein với độ dày khoảng 300 400 A
0
chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào
tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ,
pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những
tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại
xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất
định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [13].
Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh
trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá
trình sinh bào tử thường bị kìm hãm. Trong nhiều trường hợp khi kích thích
sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn
bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng
sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic, arabinose và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so
với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom
và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm
sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).
Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote
ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong
khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [11].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có
thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế
bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-8-
chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển
gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng
là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau
là khác nhau.
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI

20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc
định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào.
- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt
xích của PG.
- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân
loại cơ bản cho các chi đó.
- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa
mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl
hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit
(axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [11].
- Photpholipit có 5 typ photpholipit (P
I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần
đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-10-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-11-

100
NNN
NN
S
d
SS
SS
SM
(AB)Trong đó:
(AB)
SM
S
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%)
N
S+
: Số các tính trạng giống nhau
N
d
: Số các tính trạng khác nhau
N
S-
:
Số các tính trạng đối lập nhau.
- Công thức của Jacard (S

1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và
Henrici đặt tên năm 1943 [43]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn
nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đường
kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường
kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-12-
mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi
khi có tính kỵ nước.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi
khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có
những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp
phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình
cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp
nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử
biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi
khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân
loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để
phân loại nhóm VSV này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là
25 - 30
0
C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn
hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc
phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng.
CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực
khác nhau trên thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh
chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông
nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các
CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-14-
Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn
chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của
chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh.
Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces
CDRLL - 312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng
loạt các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã
được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp
sắc kí cột. CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus
fumigalus và Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại
các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [15].
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces
sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã
kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [47].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ
trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng
CKS đạt được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ
tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng
nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột