LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN - 2008
BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH

THÁI NGUYÊN - 2008
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính
đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ

bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008

Tác giả Bùi Thị Hà

1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA
CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT..................................................18
1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm......................................................18
1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật.................................21
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và hóa chất.........................................................................24
2.1.1. Nguyên liệu................................................................................24
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.................. ...................................24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................27
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè...........................27
2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn..........................................................28
2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski........................................28
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh ................................................28
2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh............29
2.2.3. Bảo quản giống......................................................................................29
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn....................30
2.2.4.1. Đặc điểm hình thái...................................................................30
2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy....................................................................31
2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa......................................................31
2.2.5. Lên men tạo kháng sinh.........................................................................32
2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp .................................32
2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon..................................................33
2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ......................................................33
2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA....33
2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB.....................33
2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR...................34
2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose......................................35
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu.....................................................................36
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè......................37
XK : Xạ khuẩn
VSV : Vi sinh vật
CKS : Chất kháng sinh
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
KTKS : Khuẩn ty khí sinh
HTKS : Hoạt tính kháng sinh
HTKN : Hoạt tính kháng nấm
MT : Môi trƣờng
KHVQH : Kính hiển vi quang học
KHVĐT : Kính hiển vi điện tử
DNA : Deoxyribonucleic Acid
RNA : Ribonucleic Acid
ISP : International Streptomyces Project
TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid
SDS : Sodiumdodecyl sulfat
TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid
PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh.............................38
Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu.................39
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm.........................40
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn.....................42
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2................................42
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1...............................43
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng...........................44
Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn.......................................47
Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2....49
Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS ............54
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS.........55
Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS.............57
Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn.........................58
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.....59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-1-
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm.
Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây

số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng
dụng.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
* Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Thái Nguyên.
- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên.
* Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV
kiểm định.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng
tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-3-
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng
0,2 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một
trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm
mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ
quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ
vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…
Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn
lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit
hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được
tiết ra trong môi trường. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-5-
* Khuẩn ty
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một
loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề

tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ,
pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những
tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại
xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất
định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [13].
Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh
trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá
trình sinh bào tử thường bị kìm hãm. Trong nhiều trường hợp khi kích thích
sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn
bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng
sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác
dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 120A
0
, khi già có thể đạt tới 150
200A
0
, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A
0
, lớp trong dày khoảng 50A
0
. Các
lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl
glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit.
Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào
bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ
khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit

trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có
thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế
bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-8-
chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển
gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng
là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau
là khác nhau.
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh
học...nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh
chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu
chủng loại phát sinh...Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và
bề mặt bào tử.
Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm:
RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng. RA cho những cuống
sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn. S cho những cuống sinh bào tử phát triển

I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần
đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-10-
Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
người ta không thể nào không xác định thành tế bào.
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ,
nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau
nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng
chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm
sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất
kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất
đặc trưng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý - sinh
hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân
loại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những
nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn

SM
S
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%)
N
S+
: Số các tính trạng giống nhau
N
d
: Số các tính trạng khác nhau
N
S-
:
Số các tính trạng đối lập nhau.
- Công thức của Jacard (S
J
)

100
NN
N
S
dS
S
J
(AB)

Trong đó:
(AB)
J
S

cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp
nhăn...tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử
biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi
khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân
loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để
phân loại nhóm VSV này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là
25 - 30
0
C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn
hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức
chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật.
Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà
phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác
nhau [48],[49].
1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN
1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-13-
Theo định nghĩa của Outchinnikov [48]. Chất kháng sinh là chất có
nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường
hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào
ung thư ở ngay nồng độ thấp.
Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là
Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin

Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng
loạt các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã
được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp
sắc kí cột. CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus
fumigalus và Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại
các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [15].
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces
sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã
kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [47].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ
trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng
CKS đạt được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ
tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng
nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột
biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần
để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại
kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [7],[41].
Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN,
kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những
đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương
hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-15-
1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có
nguồn gốc từ xạ khuẩn [6].
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói