1
PHẦN MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn,
thối cổ rễ, mốc sương… chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng[173,174,175].
Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong
nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế
giới [49,152,187,189]. Vi
ệc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật nhằm tăng sản
lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ
thực vật rất đa dạng. Mỗi năm Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học
diệt sâu bệnh. Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với
1231 tên thương phẩm [61]. Song việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường rất
độc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức
khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái.
Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích đất canh tác 10,126 triệu ha với sản
phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Khí hậu
nhiệt
đới nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây tổn
thất nặng nề đến năng suất cây trồng. Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu
USD thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0%[61].
Những năm vừa qua, nông dân Việt Nam cũng đã sử dụng một số chế phẩm kháng
sinh chống nấm gây bệnh cho cây trồng như: validamyxin, jingangmixin, polioxin,
blastixidin S, kasugamyxin…nhưng đây đều là các chế phẩm nhập ngoại.
Xuất phát từ những yêu cầu đó, xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay,
cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước
ta, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ”Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất
kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam. Đề tài t
ập trung nghiên
cứu các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, tiến hành lên men, chiết

mốc trắng do Sclerotium rolfsii, khô vằn do Rhizoctonia solani gây ra có
được những kết quả rất khả quan.
4. Bố cục luận án
Luận án gồm 149 trang, 23 bảng số liệ
u, 25 hình vẽ, 189 tài liệu tham khảo
tiếng Việt và tiếng Anh. Bố cục luận án gồm: mở đầu (2 trang), tổng quan (46
trang), phương pháp nghiên cứu (24 trang), kết quả và thảo luận (56 trang), kết
luận (2 trang), tài liệu tham khảo (19 trang).

3
PHẦN NỘI DUNG CHÍNH
Chương 1. Tổng quan
1.1.Giới thiệu về chất kháng sinh
Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26
tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm 2002-2008. Con số này cho
thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân.
Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các
nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đ
ang phải đối mặt với “kỷ nguyên hậu
kháng sinh” (post antibiotic era). Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra của ngành công
nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ để tránh tình trạng
kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển (R&D) để tìm ra các
chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn. Công nghiệp CKS đã
thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau
trên thế giớ
i.[113].
Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn
đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về tác nhân kháng
khuẩn và hoá trị liệu). Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn đã trình bày các
phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129]. Như vậy, sau hơn 70 năm kể

đổi ion, lọc gel, tách phân lớp hay phương pháp hấp phụ. Nồng độ của phân tử cần
xác định có trong dịch lên men thường rất ít, đối với một chủng hoang dại khi lên
men thì nồng độ CKS thường từ 0,1-10
μg/ml. Còn đối với một quá trình lên men
chuẩn thì nồng độ là 300-600μg/ml. Tùy theo khả năng sinh kháng sinh của từng
chủng sản, nhưng khoảng 5-10 L dịch lên men là có thể đủ cho việc xác định phổ
hấp phụ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC), phổ
cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và các dữ liệu về cấu trúc phân tử trong
database.[46,48]
1.5. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh
Tinh sạch các chất trao đổi t
ừ vi sinh vật là một quá trình phức tạp, đòi hỏi
rất nhiều kỹ thuật, do các chất này rất đa dạng về cấu trúc hoá học nên trọng lượng
phân tử rất khác nhau. Chúng có thể tan trong nước hay tan trong các dung môi
hữu cơ tuỳ theo đặc tính của từng chất. Thường những chất tan trong dung môi
hữu cơ dễ tinh sạch hơn tan trong nước. Những chất khó tinh sạch nhất là những
chất dễ tan trong nước, trung tính ho
ặc lưỡng tính. Phương pháp trao đổi ion rất
hiệu quả đối với những chất tan trong axit hoặc kiềm và không hiệu quả đối với

5
những chất tan trong dung môi hữu cơ. Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp rất hữu
dụng trong việc tách chiết các chất trao đổi từ vi sinh vật.
1.6.Các bệnh thực vật do vi nấm gây ra và các chất kháng sinh được sử dụng
trong nông nghiệp
Hàng năm thế giới thiệt hại do bệnh cây khoảng 537,3 triệu tấn các loại nông
sản chủ yếu (chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp của thế giới), trong đó
b
ệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83% [15,105, 111,116,121,180].
Vi nấm là vi sinh vật có nhân điển hình, phát triển nhanh chóng do quá trình

 Phương pháp phân tích trình tự ADNr 16S theo Sanger
 Lên men, tách chiết CKS theo Donald B. Borders
 Xác định cấu trúc hoá học của CKS. Phân tích bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR) và khối phổ (MS).
Chương 3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn
3.1.1. Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn
Từ 71 mẫu đất lấy ở nhiều vùng khác nhau trong cả nước, chúng tôi đã phân
lập và thuần khiết được 508 chủng xạ khuẩn. Số lượng và sự phân b
ố xạ khuẩn
trong đất được trình bày ở bảng 3.1. Mặc dù ở đây chúng tôi không đi sâu vào
nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn trong đất, tuy nhiên có thể thấy số lượng xạ
khuẩn trong các mẫu đất là khá phong phú. Tuỳ thuộc vào tính chất đất và ở các
địa điểm khác nhau, số lượng xạ khuẩn (Streptomyces) có thể dao động từ 1,5.104
đến 5,6.108 CFU/ g đất.
Tỷ lệ các chủng xạ khuẩ
n thuộc chi Streptomyces phân chia theo nhóm màu
của Shirling và Gottlieb (hình 3.1). Số lượng xạ khuẩn nhiều nhất vẫn là nhóm
xám chiếm 39% tổng số các chủng phân lập, sau đó là đến nhóm trắng chiếm
22,8% và nhóm hồng 20,2%, nhóm xanh da trời 5,3% cuối cùng ít nhất vẫn là
nhóm xanh lục chiếm 2,9%. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây

7
Tỷ lệ xạ khuẩn phân theo nhóm màu
0
10
20
30
40
50

tớnh chng nm mnh nht ó c la chn v c ký hiu l TC-54, C-5, TC-
37, BC-54, BC-87, T-41, D-42. Cỏc ch
ng ny thuc 5 nhúm mu khỏc nhau.
Chng ký hiu TC-54, T-41 v D-42 u thuc nhúm xỏm, chng C-5 thuc nhúm
hng, chng TC-37 thuc nhúm xanh da tri, chng BC-86 thuc nhúm trng v
Tỷ lệ phân trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh
0
5
10
15
20
25
30
Nhóm các vi sinh vật kiểm dịnh
Tỷ lệ phân trăm (%)
B.subtilis E. coli P. solanacearum T.utilis F.oxysporum A.niger

8
chng BC-87 thuc nhúm vng. Da trờn hot tớnh khỏng nm ca cỏc chng, 3
chng x khun c chn tip tc nghiờn cu l chng cú ký hiu TC-54, D-
41 v D-42. Chỳng tụi tin hnh nghiờn cu cỏc c im phõn loi ca 3 chng
ny.
Hình 3.7. Cuống sinh bào tử chủng
TC-54 ( SEMx5000)
♦ Chủng TC-54: có bề mặt bào tử dạng xù xì (W) và cuống sinh bào tử
dạng xoắn kép (S). Số lượng bào tử trên một chuỗi 10-50.
3.2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hoá
♦ Chủng T-41
Chủng T-41 có thể sinh trưởng ở 37
0
C, dải pH cho sinh trưởng có hể từ 5-9,
không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt. T-41 có
khả năng tạo thành một số enzym ngoại bào như amylaza, proteaza và xenlulaza,
có khả năng chịu muối đến 5%. Thành tế bào chứa LL-DAP nên thuộc typ I.
Chủng T-41 không có khả năng sử dụng lactoza, các nguồn đường khác đều có thể
sử dụng được tuy nhiên, mức độ sử dụng mỗi loại đường không giống nhau, trong
đó sử
dụng tốt nhất là fructoza và mantoza.
♦ Chủng D-42: sinh trưởng tốt ở được ở dải pH từ 6,5 đến 8. Tuy nhiên pH
tối ưu cho sự sản sinh CKS là: 7,0 ÷7,5 và không có khả năng hình thành sắc tố
melanin trên môi trường thạch hữu cơ chứa sắt. D-42 có khả năng hình thành một số
enzim ngoại bào như amylaza, xenluloza, kitinaza và proteaza, có khả năng sinh
trưởng được ở nồng độ muối 8%. Chủng này cũng có thành tế bào thuộ
c typ I.

10
♦ Chủng TC-54: sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 - 30
0
và không sinh
trưởng ở 45
0
C. Thành tế bào chứa LL-DAP thuộc typ I. pH thích hợp cho sinh

Để có thể phân loại chính xác đến loài, chúng tôi đã tiến hành xác định trình
tự ADNr 16S của 3 chủng nghiên cứu.
Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP4 thạch nghiêng, lấy hai
vòng que cấy và tách chiết qua nhiều bước (theo phương pháp tách chiết ADN
tổng số như đã nêu). Kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agaroza 1% cho thấy trên
bản gel thu được băng ADN duy nhất không bị lẫn ARN.
Trong ADN tổ
ng số được tách chiết có gen mã hoá ARNr 16S của các
chủng nghiên cứu. ADN này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để nhân
gen ARNr 16S lên nhiều lần bằng các cặp mồi đã thiết kế. Với cặp mồi được thiết
kế dựa trên trình tự bảo thủ của gen ARNr 16S của E. coli thì theo lý thuyết sản
phẩm PCR thu được phải có độ dài xấp xỉ 1500bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR
cho thấy các băng có kích thướ
c khoảng 1500bp đúng như lý thuyết. Băng ADN
rất rõ, không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng
tiếp theo. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit vivapure theo hướng dẫn của
nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra hàm lượng ADN và độ tinh sạch. Sau
đó sản phẩm này được khuếch đại tiếp với các mồi và các hóa chất của bộ kit
Cycle sequencing để chuẩn b
ị xác định trình tự. Sau đó mẫu được đưa vào máy
đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant .


1.5 kb

ngược trở lại giữa chủng D-42 và S.diastatochromogenes cho thấy có các đặc
điểm giống và khác nhau như sau: [ 36,113].
Giống nhau: cả 2 chủng này đều thuộc nhóm xám (Gr), bề mặt bào tử nhẵn
(sm), cuống sinh bào tử dạng xoắn, đều có khả năng sử dụng các lo
ại đường giống
nhau và đều có khả năng chống nấm tốt.
Khác nhau: chủng D-42 có hình thành sắc tố hòa tan, còn chủng
S.diastatochromogenes thì không hình thành, chủng D-42 không hình thành sắc tố

13
melanin khi nuôi cấy trên môi trường ISP 6 còn chủng S.diastatochromogenes lại
hình thành melanin. Sự khác nhau về khả năng hình thành sắc tố và sự tạo melanin có
thể do tác động của nhiều yếu tố khác nhau, tuy nhiên ở đây chúng tôi chưa thể khẳng
định được là do nguyên nhân cụ thể nào, nhưng nằm trong phạm vi biến dị loài.
Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình
tự ADNr 16S, thể hiện mối quan hệ giữa 3 chủng xạ khuẩn T-41, D-42, TC-
54 và các
đại diện có quan hệ gần gũi thuộc chi Streptomyces.
Các nghiên cứu trên thế giới về loài Streptomyces diastatochromogenes cho
thấy chủng này có khả năng sinh CKS oligomyxin. Oligomyxin là CKS thuộc
PHYLIP_1
0.01
Streptomyces thermovulgaris Z68098
Streptomyces griseus AB045867
Streptomyces violascens AY999737
100
Streptomyces sannurensis AY331685
Streptomyces kasugaensis AY99920
Streptomyces morookaensis AJ781349
Streptomyces kashimirensis AJ781337

84
62
48
Streptomyces yatensis AF336800
Streptomyces rutgersensis AY508511
Streptomyces viridogennes
100
92
TC54
Streptomyces hygroscopicus AB217603
100
Streptomyces violaceusniger AJ391823
Streptomyces sporocinereus AJ781368
Streptomyces endus AY999
Streptomyces antimycoticus AY999831
100
T41
88
100
87
94
75
79
87
Streptomyces diastatochromogenes D63867

14
nhóm macrolit có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng rất tốt. Chất này đã
được một số hãng sản xuất lớn trên thế rất quan tâm. Chủng xạ khuẩn này lần đầu
tiên đã được Krainsky phát hiện từ những năm 1914, sau đó đến năm 1948 được


15
3.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ tới khả năng hình thành CKS
của chủng T-41, D-42 và TC-54.
Cả ba chủng đều có khả năng sinh trưởng và cho hoạt tính kháng sinh mạnh
nhất ở nhiệt độ khoảng 30
0
C, pH trung tính hoặc hơi kiềm.
3.3.2.2. Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất lên quá trình sinh tổng hợp CKS
của các chủng T-41, D-42, và TC-54.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Chủng T-41, D-42 và TC-54 có khả năng sử
dụng nhiều loại đường khác nhau. Lượng sinh khối được tạo thành trong môi
trường có nguồn cacbon là tinh bột tan hoặc maltoza là cao nhất nhưng lại không
cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong khi đó, trên môi trường có nguồn cacbon là
lactoza, rỉ đường, lượng sinh khối thu được ít h
ơn so với các nguồn cacbon khác
nhưng lại cho hoạt tính kháng sinh cao hơn. Điều này chứng tỏ rằng trong rỉ
đường, ngoài đường còn có một số thành phần chất hữu cơ khác cũng có khả năng
ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp CKS của chủng này.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh tổng hợp
CKS của các chủng nghiên cứu đã khẳng định ư
u thế của bột đậu tương lên khả
năng sinh tổng hợp CKS của chủng T-41 và TC-54. Khả năng sinh tổng hợp CKS
cao khi dùng bột đậu tương không những do bột đậu tương có chứa 40% protein
mà còn có thể do nó có chứa cả các chất khác cần cho sinh tổng hợp CKS. Đối với
chủng D-42, hoạt tính kháng sinh đạt mạnh nhất trên nguồn nitơ là cao nấm men,
tiếp đó là bột đậu tương. Lượng bột đậ
u tương thích hợp cho lên men của các
chủng này là 1%.
Hình 3.13. Hoạt tính kháng sinh của 3 chủng nghiên cứu
chiết ở các pH khác nhau
Chiết CKS từ sinh khối bằng metanol cho hoạt lực mạnh nhất. Tuy nhiên, do
etanol cho kết quả chỉ sau metanol nên để thuận lợ
i và kinh tế, chúng tôi dùng
etanol.
3.4.5. Tách chiết bằng trao đổi ion ( CKS TC-54)
Quy trình phân lập CKS TC-54-1 được mô tả như sau:
Dịch nuôi cấy chủng S. hygroscopicus TC-54 sau 5 ngày lên men được axit hóa
bằng cách bổ sung axit oxalic tới pH=3, sau đó ly tâm loại bỏ sinh khối và thu
dịch lọc.
Dịch lọc được chạy qua cột trao đổi ion Amberlit IR-120 (dạng H) và IR-45
(OH) để loại bỏ các cation và anion. Sau đó lại được nhồi vào cột Dowex-50 X-2,
lúc này CKS được hấp thụ trong nhựa và được rửa giải bằng NH
4
OH 0,5N trong
đệm pyridin- axit axetic pH 7,5. Chất hấp thụ trong cột và được rửa giải gọi là
CKS TC-54-1 ở dạng tinh khiết hơn. Còn chất qua cột được gọi là CKS TC-54-2.

17
Kiểm tra độ tinh khiết của TC-54-1: Bằng sắc ký lớp mỏng, triển khai
với 3 hệ dung môi khác nhau:
1. n-butanol-axit axetic-nước ( 4:1:5) có Rf= 0,55
2. n-propanol: axit axetic: H
2

4
OH 0,5N
- thu hồi, cô đặc.

Dịch nuôi cấ
y
TC-54
(
10L, 1210 đv/ml
)
D
ị
ch l
ọ
c
Dịch lọc đã loại bỏ các cation và anion
TC-54-1 (610 μg/ml)

18
trúc hóa học của valydamyxin thuộc nhóm giả đường, có nhiều nhóm hydroxyl
nên chất này dễ tan trong nước và có nhóm amin), do vậy chúng tôi nghĩ đến chất
TC-54-1 có thể là CKS thuộc nhóm validamyxin.
Đối chiếu với kháng sinh chuẩn validamyxin A do Viện Bảo vệ Thực vật
cung cấp, chúng tôi đã tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng, phân tích dữ liệu
các phổ UV, IR và
1
HNMR để nhận dạng chất TC-54-1.
3.4.6. Nhận dạng CKS TC-54
Cảm quan: Đây là dạng bột không màu, tan trong nước, tan trong metanol,
DMF và DMSO, tan vừa trong etanol và axeton, ít tan trong etylaxetat .

19
y = 67,024x - 710,8
R
2
= 0,9869
0
500
1000
1500
2000
2500
10 15 20 25 30 35 40 45
Đương kinh vòng vô khuân (D-d,mm)
Nông đô CKS (mcg/ml) Hình 3. 17. Công thức cấu tạo củavalidamyxin
3.4.7. Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn
Thí nghiệm tiếp theo, phân tích mối tương quan giữa nồng độ CKS (đv/ml) và
đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm) theo phương pháp của Dmitrieva, kết quả
được minh họa ở hình 3.18.

CKS này ức chế hoàn toàn quá trình nảy mầm. Ở nồng độ 1mg/ml tỷ l
ệ nảy mầm
đã giảm so với đối chứng. Ở nồng độ 0,001mg/ml CKS không những không ảnh
hưởng đến tỷ lệ nảy mầm mà còn kích thích quá trình nảy mầm của hạt. Tỷ lệ này
tương đương với nồng độ 1% dịch nuôi cấy. Những kết quả nghiên cứu này rất
quan trọng trong việc sử dụng CKS ở các nồng độ khác nhau ứng dụng trong thực
tiễn theo từ
ng mục đích và đối tượng khác nhau. Nhìn chung, nồng độ đủ ức chế
nấm gây bệnh F.oxysporum không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây.
3.6. Sản xuất chế phẩm
3.6.3. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng
3.6.3.1. Chế phẩm T-41 và D-42
Trong các thí nghiệm này, chúng tôi có sử dụng 2 loại thuốc hoá học có tên
thương phẩm là: mexyl (metalaxyl 18% và mancozeb 64%), rovral (iprodione
96%), đã được phép sử dụng tại Việt Nam và validacin 3DD. Đ
ây là các chất
chống nấm gây bệnh thực vật rất tốt và thường được sử dụng nhiều ở Việt Nam.
Có thể thấy rằng với 2 loại thuốc hoá học dùng để diệt nấm rất phổ biến hiện
nay thì khi dùng mexyl, rovral tỷ lệ cây bị bệnh sau 31 ngày thí nghiệm tương ứng
là 28,57% và 31,43 %. Trong khi đó chế phẩm T-41 có tỷ lệ bệnh là 28,57% tương

21
đương với khi dùng mexyl và hiệu lực còn cao hơn cả rovral. Còn chế phẩm D-42
thì tỷ lệ cây bị bệnh chiếm 39,05%.
Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm trên cà chua
( nấm gây bệnh: Sclerotium rolfsii)
1 2 3 4 5 6
Đối chứng
Mexyl
MZ72

3DD
Rovral
50WP
Mexyl
MZ72
D42 T41
Công thức Ngày
Tỷ lệ cây bị bệnh tại các thời điểm thí nghiệm(%)
Ngày thứ
15
73,3±5,51
10±1
18,66±4,52 18±1,15
16,3±3,58
26,6±4,16
Ngày thứ
30
100±5,67
10±1,15
18±5,36 20±2,67
17,3±3,33
33,3±4,04

22
Bệnh gây hại nặng trên cây cải bắp với triệu chứng lở và thắt cổ rễ cây con và
triệu chứng thối bắp cây trưởng thành. Tỉ lệ bệnh do nấm bệnh gây ra trên cây cải
bắp ở vụ xuân vào giai đoạn chuẩn bị thu hoạch dao động từ 9 - 99% ở các vùng


23
Bảng 3.23. Tổng hợp số liệu khảo nghiệm sau 20 ngày
Sau phun thuốc ( ngày)
Côn
g

thức
Chỉ
tiêu
(%)
0 5 10 15 20
Tỷ lệ
bệnh
18,67±6,11 21,33
±4,62 22,67±4,04 24,0±3,46 25,33±7,57
1
Chỉ
số
bệnh
6,67±1,89 8,83
±2,47 10,33±1,53 12,5±3,97 14,5±6,14
Tỷ lệ
bệnh
19,33±3,06 19,33±3,06 20,67±8,08 20,33±6,66 20,0±6,11
2
Chỉ
số
bệnh
6,67±1,89 7,0±1,32 8,5±3,61 11,0±6,61 12,8±6,11

KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra được những kết luận sau:
1. Từ 71 mẫu đất, đã phân lập được 508 chủng xạ khuẩn và chọn được 3 chủng có
hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cao nhất được ký hiệu là: T-41, D-42,
TC-54 để nghiên cứu sâu hơn.
2. Đã tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích
trình tự gen ADNr 16S để khẳng định:
- Chủ
ng T41 là Streptomyces antimycoticus Waksman, 1957.
- Chủng D-42 là Streptomyces diastatochromogenes (Krainsky 1914) Waksman và
Henrici, 1948.
- Chủng TC-54 là Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman và
Henrici, 1948.
3. Đã xác định được điều kiện lên men thích hợp cho 3 chủng xạ khuẩn:
- Môi trường A-12 thích hợp cho các chủng T-41 và D-42 sinh tổng hợp
kháng sinh, trong đó khả năng sinh kháng sinh của T-41 trên môi trường
xốp mạnh hơn trên môi trường dịch thể. Môi trường A-4 thích hợp nhất cho
chủng TC-54 sinh kháng sinh.
- T-41 và D-42 đều cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất ở nhiệ
t độ khoảng
30
0
C, pH trung tính hoặc hơi kiềm. Nguồn cacbon thích hợp nhất cho để
tổng hợp chất kháng sinh của chủng T-41 là tinh bột tan (1%) và D-42 là rỉ
đường. Bột đậu tương (1%) là nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho lên men của
các chủng này. Ở cả hai chủng, lượng sinh khối tích luỹ và hoạt tính kháng
sinh đạt cực đại sau khoảng 96-120 giờ nuôi.
- Trên môi trường lên men xốp, hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 đạt cao
nhất vào ngày thứ 12.
4. Dự