BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
 TRẦN VĂN THỌ
NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG
SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG
XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRONG MỘT SỐ CÂY
DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC
HÀ NỘI - 2014

HÀ NỘI - 2014
i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi tới TS. Dương Minh Lam lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm
ơn chân thành, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn các Thầy/Cô giáo Phòng Sau Đại học, các
Thầy/Cô Khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt quá trình thực hiện luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô giáo trong tổ Bộ môn phòng
CNSH – Vi sinh, Khoa Sinh học trường ĐHSP Hà Nội đã giúp tôi rất nhiều
trong việc thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị làm việc tại phòng thí nghiệm
Hiển vi điện tử, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW – Bộ Y tế đã giúp đỡ tôi thực hiện
những thao tác lấy mẫu và chụp ảnh hiển vi quang học và điện tử quét.
Đồng thời tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia
đình, đồng nghiệp và các bạn của tôi đã có những khích lệ tinh thần và những
quan tâm sâu sắc trong thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2014
Tác giả luận văn Trần Văn Thọ

1.2. Đa dạng và vai trò của xạ khuẩn nội cộng sinh 8
1.3. Xạ khuẩn sinh kháng sinh 15
1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh 15
1.3.2. Định nghĩa và phân loại chất kháng sinh 18
1.3.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh 22
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Vật liệu 26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 26
2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định 27
2.1.3. Hóa chất 27
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị 27
2.2. Các loại môi trường sử dụng 28
2.2.1 Môi trường phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh 28
2.2.2. Môi trường giữ giống xạ khuẩn 28
iv

2.2.3. Môi trường nghiên cứu hình thái xạ khuẩn 29
2.2.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 30
2.3. Các phương pháp nghiên cứu 31
2.3.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập dòng xạ khuẩn
nội công sinh trong cây dược liệu 31
2.3.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 33
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 36
2.4. Phương pháp sử lý số liệu 36
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37
3.1. Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây dược liệu tự
nhiên ở Việt Nam 37


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Một số loài xạ khuẩn nội cộng sinh mới được phát hiện 13
Bảng 2.2. Một số chất kháng sinh từ xạ khuẩn và hoạt tính của chúng 16
Bảng 2.3. Phân loại chất kháng sinh 19
Bảng 2.4. Một số chất kháng sinh mới công bố từ xạ khuẩn nội cộng sinh 23
Bảng 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh ở một số loài dược liệu 37
Bảng 3.2. Các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu và hoạt tính kháng
sinh của chúng 39
Bảng 3.3. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xa khuẩn nội cộng sinh 41
Bảng 3.4. Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn ức chế VSVKĐ 42
Bảng 3.5. Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn được tuyển chọn 43
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của các chủng xạ
khuẩn nội cộng sinh 55 vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh Streptomyces sp. EN27 trong hạt lúa mì 9
Hình 1.2. Kháng sinh được phát hiện qua các năm 15
Hình 3.1. Hoạt tính kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn được tuyển chọn 43
Hình 3.2. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces 45

0
C đến 27
0
C và tăng dần từ Bắc vào Nam. Lượng mưa trung bình
hàng năm 1500 – 2000 mm, độ ẩm không khí trên dưới 80%, lượng bức xạ
mặt trời rất lớn với số giờ nắng từ 1400 – 3000 giờ/năm [72]. Chính những
yếu tố vô cùng thuận lợi này đã giúp Việt Nam được đánh giá là một trong
những trung tâm giàu về đa dạng sinh học nhất thế giới [12]. Hiện nay, ở Việt
Nam đã có 300 loài thú, 830 loài chim, 260 loài bò sát, 158 loài lưỡng cư,
khoảng 5.300 loài côn trùng 547 loài cá nước ngọt, 2.038 loài cá biển được
thống kê. Với thực vật có 481 loài Rêu (Bryophyta), 691 loài Dương xỉ
(Polypodiophyta), 69 loài Hạt trần (Gymnospermae), với 10.386 loài thực vật
có mạch, đặc biệt có 3.830 loài thực vật có giá trị về mặt y học (cây thuốc) đã
được định danh [14].
Xạ khuẩn là đối tượng nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên
thế giới về đa dạng và các hoạt chất của chúng, đặc biệt là các chất kháng
sinh. Cho đến nay, ở Việt Nam đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu
về xạ khuẩn phân lập ở đất canh tác, đất rừng, đất mặn…[1]. Một vài
nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh (xạ khuẩn trong cơ thể thực vật) trong
cây rừng ngập mặn đã được nghiên cứu [9], [13], tuy nhiên, chưa có công
trình nào nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên đối tượng cây dược liệu
tự nhiên.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy mức độ đa dạng cao của xạ
khuẩn nội cộng sinh trong các cây thuốc và có những tác động tích cực tới
2

thực vật chủ như kích thích sự sinh trưởng và bảo vệ cơ thể thực vật khỏi sự

- Lần đầu tiên nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên các loài cây
nghiên cứu.
- Xác định được độ đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trong một số cây
dược liệu tự nhiên ở Việt Nam.
- Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh.
4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn
1.1.1. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
Xạ khuẩn (Actinobacteria) là một ngành vi khuẩn Gram dương, bao
gồm một lớp duy nhất là Actinobacteria trong đó có 5 bộ lớn là:
Actinomycetales, Bifidobacteriales, Coriobacteriales, Sphaerobacterales và
Rubrobacterales [11], [74]. Thành phần và số lượng của xạ khuẩn phân bố
không đều trong các bộ trên. Actinomycetales là bộ chiếm hơn 90% về số
lượng loài, với 40 họ, có nhiều họ xạ khuẩn với nhiều chi và loài sinh kháng
sinh quí được ứng dụng nhiều trong y học.
Những nghiên cứu đa dạng và phân loại học góp phần làm tăng nhanh
số lượng các loài xạ khuẩn được ghi nhận trên thế giới. Năm 2009, Xiao –
Yang Zhi đã bổ sung thêm những thông tin trong hệ thống phân loại xạ khuẩn
bằng việc sử dụng phương pháp phân tích 16S rDNA và bổ sung thêm 2 họ
trong bộ Actinomycetales là Kineosporiineae và Actinopolysporineae [69].
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn
1.1.2.1. Sơ lược về lịch sử phân loại xạ khuẩn
Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt
các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Ông

Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy, xạ khuẩn được chia
thành 4 nhóm chính [53]:
- Nhóm 1: Xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt. Đặc trưng của nhóm này là
sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành HSKS và HSCC. Đại diện các chi:
Streptomyces, Streptoverticillium, Actinopolyspora…
- Nhóm 2: Xạ khuẩn có bào tử nang. Đặc trưng của nhóm này là hệ sợi
phân chia theo hướng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tương tự như nang
bào tử. Đại diện các chi: Actinoplanes, Spirillospora, Streptosporangium…
- Nhóm 3: Xạ khuẩn dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt hệ
sợi. Đại diện chi: Nocardia, Sacchorothix…
- Nhóm 4: Xạ khuẩn có dạng tương tự Corynebacter và dạng cầu, tế
bào có hình chữ V, T và thường không có hệ sợi.
6

Trong những năm gần đây, dựa vào nghiên cứu xạ khuẩn trên các môi
trường khác nhau, ISP đã chia hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu:
- Kiểu S – type “Spira” chuỗi bào tử xoắn.
- Kiểu R – type “Rectus” chuỗi bào tử thẳng.
- Kiểu F – type “Flexuous” chuỗi bào tử dạng cong queo.
- Kiểu RA – type “Retinaculum - Apertum” chuỗi bào tử dạng móc câu
hay xoắn không hoàn toàn.
- Kiểu MV – type “Monoverticillus” chuỗi bào tử một tầng chồi.
- Kiểu MV-S – type “Monoverticillus – Spira” chuỗi bào tử một tầng
chồi xoắn.
- Kiểu BIV – type “Biverticillus” chuỗi bào tử hai tầng chồi
- Kiểu BIV – S – type “Biverticillus – Spira” chuỗi bào tử hai tầng chồi
Hầu hết các chi xạ khuẩn được mô tả hiện nay được phân chia tùy

1.1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
Khi phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý – sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và
nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác
nhau nhờ hệ thống enzim. Các chỉ tiêu khác cũng được xác định như mối
quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi
trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển, tính chất đối
kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh
và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
1.1.2.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các
vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái,
sinh lý – sinh hóa.
Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath và Jaccard đề nghị
hệ số giống nhau S (Similarity) theo công thức sau:
8

%
100
Nsx
S
Ns Nd



Ns: Tổng số các đặc điểm giống nhau mà hai chủng so sánh
Nd: Tổng số các đặc điểm khác nhau

nông nghiệp như: lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua, cây chuối, ngô và
cây chanh [17],[18], [23], [27], [28], [55], [60], [61], cây gỗ [58],[64], [66],
[67], [69]], dương xỉ và rêu [38], cây thuốc [33]. Streptomyces và
Microbispora là hai chi được tìm thấy nhiều nhất ở trong mô của thực vật
[44], [56]. Micromonospora, Nocardioides, Nacardia và Streptosporangium
là những chi cũng được tìm thấy.

Hình 1. 1. Hình ảnh Streptomyces sp. EN27 trong hạt lúa mì [28]
Những thông tin về đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh không chỉ có ý
nghĩa quan trọng trong việc sàng lọc những chủng tốt mà còn giúp cho chúng
ta hiểu về vai trò sinh thái học của chúng.
Tan (2006) [57] phân lập được 619 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ
cây cà chua và tất cả chúng đều thuộc chi Streptomyces. Inderiati và Muliani
(2008) [30] cho rằng đa số xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ cây thuốc lá đã
được phân loại thuộc chi Streptomyces. Lee (2008) [41] đã phân lập được 81
chủng xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc vào tám chi từ rễ của cây bắp cải Trung
10

Quốc. Microbispora là chi được phân lập phổ biến nhất, sau đó Streptomyces
và Micromonospora. Streptomyces chiếm khoảng 50% của 55 chủng xạ
khuẩn nội cộng sinh phân lập được từ cây đinh hương Ấn Độ [62]. Kajur và
Khan (2011) [39] phân lập được 50 chủng xạ khuẩn từ lá của Mentha arvensis
thu được 60% số lượng chủng thuộc thuộc chi Streptomyces, 25% số lượng
chủng thuộc Micromonospora, 7.5% số lượng chủng thuộc Actinopolyspora
và 7.5% số lượng chủng thuộc Saccharopolyspora. 40 chủng xạ khuẩn nội
cộng sinh phân lập từ rễ, thân và lá của ba loài cây thuốc Ấn Độ hầu hết đều
thuộc chi Streptomyces [33]. Điều thú vị là chi Streptomyces là chi thường

gốc từ lá. Gangwar (2012) [32], cũng thu được 60% số lượng chủng xạ khuẩn
có nguồn gốc từ rễ khi phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh từ cây lúa mì. Năm
2014, Gangwar [33] phân lập được 40 chủng xạ khuẩn nội cộng từ rễ, thân và
lá của 3 cây thuốc ở Ấn Độ, trong đó 70% số lượng chủng có nguồn gốc từ rễ,
17.5% chủng có nguồn gốc từ thân và 12.5% chủng có nguồn gốc từ lá.
El – Tarabily (2009) [30] đã ước lượng được xạ khuẩn nội cộng sinh
trong rễ cây dưa chuột và đậu lupin khoảng 10
5
cfu/g rễ tươi. Ở rễ, xạ khuẩn
nội cộng sinh đa dạng hơn ở các phần khác. Tian (2007) [60] khi phân tích 16S
rADN của 45 và 33 chủng xạ khuẩn phân lập được từ thân và rễ, đã thấy rằng
những chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ rễ thuộc vào 9 chi xạ khuẩn, trong khi
đó xạ khuẩn có nguồn gốc thân chỉ thuộc vào 4 chi của xạ khuẩn. Kết quả này
đã chứng tỏ sự đa dạng của xạ khuẩn ở trong rễ cao hơn ở thân. Sự đa dạng xạ
khuẩn trong đất là một trong những nguyên nhân giải thích sự đa dạng của xạ
khuẩn nội cộng sinh ở trong rễ. Xạ khuẩn trong môi trường đất có thể dễ dàng
di chuyển vào trong rễ [30]. Rễ vừa có vai trò hút nước, chất dinh dưỡng, đồng
thời là nguồn cơ chất lý tưởng cho xạ khuẩn nội cộng sinh.
Strobel và Daisy (2003) cho rằng sự đa dạng của xạ khuẩn nội cộng
sinh có thể tìm thấy trong vùng nhiệt đới và vùng ôn đới [54]. Janso và Carter
(2010) [38] đã phân lập được 123 xạ khuẩn nội cộng sinh từ cây trong vùng
nhiệt đới ở các vị trí khác nhau thuộc Papu New Guinea và đảo Mborokua,
12

đảo Solomon. Khi phân tích 16S – rADN 123 chủng xạ khuẩn thuộc 17 chi đã
được miêu tả, trong đó có một vài chi hiếm như Sphaerisporangium và
Planotetraspora, là những chi mà trước đó chưa có tác giả nào công bố. Rừng

Tên của xạ khuẩn nội
cộng sinh
Cây chủ
Hệ số giống nhau
S%(Similarity)
AJ784008 Micromonospora
coriariae
Coriaria myrtifolia M. endolithica
(98.94%)
AJ783996 Micromonospora lupini Lupinus angustifolius M. microbrigensis
(98.5%)
AJ783993 Micromonospora
saelieesensis
Lupinus angustifolius M.
purpureochromogenes
(98.7%)
AM944497 Micromonospora pisi Pisum sativum M. pattaloongensis
(98.7%)
DQ343154 Pseudonocardia oroxyli Oroxylum indicum P. halophobica
(97.8%)
EU921261 Pseudonocardia acaciae
Acacia auriculiformis
A. Cunn. Ex Benth.
P. spinosispora
(96.2%)
DQ887489 Pseudonocardia
endophytica
Lobelia clavata P. kongjuensis (98.5%)

GQ906587 Pseudonocardia tropica Maytenus
14

DQ460470 Streptomyces alni Alnus nepalensis
D.
Don
S. hebeiensis (97.6%)
EU200685 Streptomyces artemisiae Artemisia annua L. S. armeniacus (99.9%)

EU925562 Streptomyces sedi Sedum sp. S. specialis (97.5%)
EU200683 Streptomyces mayteni Maytenus
autroyunnanensis
S. phaeopurpureus
(99.5%)
GU367158 Nonomuraea endophytica Artemisia annua L. N. candida (98.8%)
FJ157184 Nonomuraea
antimicrobica
Maytenus
austroyunnanensis
N. candida (98.2%)
EU814512 Saccharopolyspora
endophytica
Maytenus
austroyunnanensis
S. flava (97.7%)
EU005371 Saccharopolyspora
gloriosae
Gloriosa superba L. S. gregorii (991%)
FJ214364 Saccharopolyspora

RD6
Kibdelosporangium
aridum (95.5%)
FJ214343 Plantactinospora mayteni Maytenus
austroyunnanensis
M. endolithica (98.1%)

AB490769 Phytohabitans suffuscus Orchid M. pattaloongensis
(97.7%)
FJ157186 Jiangella alba Maytenus
autroyunnanensis
J. alkaliphila (98.8%)
EU560726 Jishengella endophytica Acanthus illicifolius M. olivasterospora
15

(98.7%)
FJ214356 Herbidospora osyris Osyric wightiana
Wall.
ex Wight
H. cretacea (99.9%)
FJ214362 Kineosporia mesophila Tripterygium wilfordii K. mikuniensis
(98.2%)
DQ473536 Leifsonia ginsengi Ginseng L. poae (97.6%)
EU325542 Rhodococcus cercidiphylli

Cercidiphyllum
japonicum

Nguồn gốc Ứng dụng
Quốc gia
phát hiện
Cơ quan
phát hiện
Actinomycin S. antibioticus Kháng ung thư Mỹ Nghiên cứu
Adriamycin S. peucetius Kháng ung thư Ý Thương mại
Amphotericin S. nataensis Kháng nấm Mỹ Nghiên cứ
/
Thương mại
Avermectin S. avermitilis Kháng kí sinh trùng

Nhật/Mỹ Nghiên cứ
/
Thương mại
Bacitracin Bacillus species Kháng khuẩn Mỹ Nghiên cứu
Bialaphos S. hygroscopicus Kháng ung thư Nhật Thương mại
Bleomycin S. verticillus Kháng ung thư Nhật Nghiên cứu
Candicidin S. griseus Kháng nấm Mỹ Nghiên cứu
Chloramphenicol

S. venezuelae Kháng khuẩn Mỹ Nghiên cứ
/
Thương mại
Chlortetracycline

S. aureofaciens Kháng khuẩn Mỹ Thương mại
Epothilone Sorangium
cellulosum
Kháng ung thư Đức Nghiên cứu