VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------------------

QUÁCH NGỌC TÙNG

PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG
SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG
SINH TRÊN CÂY QUẾ TẠI TỈNH HÒA BÌNH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội - 2014


Quách Ngọc Tùng - K16

MỞ ĐẦU
Vi khuẩn gây bệnh cókhả năng kháng thuốc kháng sinh làvấn đề nghiêm
trọng vàthu hút mối quan tâm rất lớn của cộng đồng. Vìvậy, việc nghiên cứu,
lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên hàng đầu của các
nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới. Cho đến nay, các nhà
khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để
phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại thuốc khác nhằm chăm
sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của người
bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra [3].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh thực vật làmột nguồn tự nhiên quan
trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật vàcác bệnh khác. Chẳng hạn,
cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dược chất trong tinh dầu của lá, vỏ cây và
quả với 90% là cinnamaldehyde có hoạt tí

nh”.
Đề tài đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i phòng Công nghê ̣ lên men, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh
học, Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam, gồm 4 nội dung chiń h:
- Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên các mẫu cây
quế thu thập tại tỉnh Hòa Bình.
- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn nội
cộng sinh và xác định sự có mặt của ba gen mãhóa các enzyme tham gia
vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases (PKS-I,
PKS-II) vànonribosomal peptide synthetase (NRPS).
- Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao.
- Nghiên cứu tách dòng và phân tích trình tự gen mã hóa PKS-I, PKS-II
của chủng xạ khuẩn được tuyển chọn.

2
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu
1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh
Hiện nay, nhiều công trì
nh nghiên cứu trên thế giới công bố về tương tác
giữa thực vật vàvi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân ức
chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, phân giải
phospho khó hoàtan, cố định nitơ tự do, tăng độ phìcủa đất... [17, 51]. Phần
lớn các VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc vàxạ khuẩn được phân lập từ đất,
vùng rễ, bề mặt hoặc trong các môthực vật.

hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của
đời sống. Các hợp chất có hoạt tí
nh sinh học từ xạ khuẩn nội cộng sinh được
chứng minh làrất đa dạng về mặt số lượng vàhoạt tính sinh học như: các chất
kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt
rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng... [10, 49]. Vìvậy, nghiên cứu sàng
lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung vàhoạt tí
nh kháng sinh nói
riêng từ xạ khuẩn cộng sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên
cứu triển vọng của các nhàkhoa học trên thế giới.
1.1.2. Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh
Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi
trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng
mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí,nhiệt độ... Thêm vào đó, mật độ xạ
khuẩn nội cộng sinh nhì
n chung thấp vàphụ thuộc vào loại mô khác nhau trên
thực vật [49].
Theo các công trì
nh công bố, quátrì
nh phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh
cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Do đó,
phải khử trùng bề mặt mẫu vàcắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử
trùng trước khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) làmột trong những tác
nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật được
ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20
phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vôtrùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn
dư. Ngoài ra, hydro peroxide vàclorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất
khử trùng bề mặt hiệu quả [42]. Năm 1992, Sardi vàcộng sự công bố sử dụng
hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vìhóa chất khử trùng dạng lỏng
[60]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lýbề mặt chỉ với ethanol

trưởng thực vật, ức chế vàkiểm soát bệnh thực vật...
1.1.3.1. Kháng ung thư, kháng viêm
Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất cóhoạt tính kháng, ức
chế tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội cộng sinh đang là hướng nghiên cứu mới của
các nhàkhoa học trên thế giới. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội cộng
sinh cómối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ. Một số giả thuyết nhận định
rằng gen liên quan tới tổng hợp các hợp chất có hoạt tí
nh sinh học được tiếp
nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV vàthực vật thông qua hệ thống chuyển
gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhàVSV học đã mở ra
triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá
trì
nh nuôi cấy VSV, vídụ như chất kháng tế bào ung thư paclitaxel phổ biến
trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatospora sp. và
một số nấm cộng sinh khác [38].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh
mới trên xạ khuẩn nội cộng sinh cótỷ lệ khácao so với xạ khuẩn phân lập từ đất
hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng sinh mới có tên naphthomycin K (dẫn
xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phát
5
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội cộng sinh trong cây mỹ đăng mộc
(Maytenus hookeri) - loại cây thuốc có tác dụng điều trị ung thư, hoạt huyết...
Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây
độc ức chế dòng tế bào P388 vàA-549 ở nồng độ ức chế lần lượt là0,07 và3,17
µM, nhưng không có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và vi khuẩn lao

nh cộng sinh vàtổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Nhiều
nghiên cứu chứng minh đặc tí
nh bảo vệ cây chủ của xạ khuẩn nội cộng sinh
chống lại các VSV gây bệnh từ đất như Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae,
Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, F.

6
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

oxysporum, Pythium aphanidermatum vàColletotrichum orbiculare [12, 18, 22,
23].
Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi
chất như chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone... Ngoài ra, các
chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kí
ch
thích các thụ thể tế bào. Vídụ như chủng S. galbus R-5 không chỉ sinh
cellulase, pectinase màcòn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp tăng
cường sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cường sản sinh jasmonate kích
thích hệ thống miễn dịch [55].
Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm
Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây
Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia
carotovora vàF. oxysporum; kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid jasmonic,
acid salicilic vàetylen [16]. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội cộng sinh với các
cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tí
nh sinh học được sinh ra bởi xạ
khuẩn nội cộng sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu cótiềm năng ứng dụng

dây ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata),
nghệ xanh (Curcuma aeruginosa), rau má (Centela asiatica)... Trong đó, các
chủng thể hiện hoạt tính alpha glucosidase ức chế quátrì
nh thủy phân tinh bột
thành glucose thẩm thấu vào ruột non. Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn
được chủng BWA65 có hoạt tính ức chế alpha glucosidase gấp hơn hai lần so
với chất cóhoạt tính tương tự thu được từ dịch chiết cây dây kýninh [58].
Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với sự
sinh trưởng vàcạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên còn chưa rõ
ràng nhưng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực y dược, dược phẩm,
nông nghiệp đã được chứng minh. Chính vìlý do này, các nhàkhoa học hiện
nay rất quan tâm tới việc sàng lọc các hợp chất cóhoạt tí
nh sinh học cao từ xạ
khuẩn nói chung vàxạ khuẩn nội cộng sinh nói riêng.
1.1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh
1.1.4.1. Tì
nh hì
nh nghiên cứu trên thế giới
Trong vài thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều thành tựu trong tìm kiếm các
loài xạ khuẩn vàcác hợp chất mới cóhoạt tí
nh sinh học từ xạ khuẩn trong môtế
bào thực vật. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội cộng sinh nên đối
tượng VSV này đang được quan tâm vànghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới
như: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản… Sơ lược về tì
nh
hì
nh nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây
được thể hiện trong bảng 1.1 [49].

8


[9]

Cơm cháy
(Sambucus adnata)
Riềng nếp
(Alpinia galangal)

Glycomyces

[49]

Streptomyces, Nocardia, Microbispora,
Micromonospora

[62]

Mộc lan (Kennedia
nigricans)
Sầu đâu

Streptomyces

[14]

Streptomyces, Streptosporangium,
Microbispora, Streptoverticillium,
Saccharomonospora, Nocardia

[30]

khuẩn trên các môi trường khác nhau từ 90 loại cây dược liệu tại rừng nhiệt đới
Xishuangbanna và xác định được có19 loài xạ khuẩn mới [15].
Cũng từ những chủng xạ khuẩn được phân lập trên các cây dược liệu tại
vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã được phát hiện
như: 9-hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D,
bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin
C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine … [11].
1.1.4.2. Tì
nh hì
nh nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về VSV nội cộng sinh nói chung
và xạ khuẩn nói riêng. Một số nghiên cứu khác về vi khuẩn, nấm nội sinh có thể
được tóm tắt như sau:
Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Mai Hương tại Viện Hóa hợp chất
thiên nhiên đã thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ (Taxus sp.) ở
Việt Nam và tách chiết một chất gần giống 10-deacetil baceatin III (10-DAB)chất chuyển hóa thành taxol. Từ lõi cây, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6
chủng nấm, trong đó một chủng thuộc loài Mucor circinolloides var. tieghem.
Chất tách chiết từ dịch lên men của chủng nấm nội cộng sinh có đặc điểm gần
giống với 10-DAB từ cây thông đỏ. Từ kết quả đó, có thể khẳng định những sản
phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học không chỉ được tạo ra từ cây chủ mà
còn có thể tạo ra bởi VSV nội cộng sinh [3].
Từ 54 mẫu cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy
Hòa, PhúYên, nhóm nghiên cứu của TS. Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng
vi khuẩn nội cộng sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia,
10
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16


49, 50]. Cũng như xạ khuẩn phân lập từ đất, tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc

11
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

chi Streptomyces chiếm hơn 50%, tiếp theo là các chi Microbispora,
Micromonospora, Nocardioide, Nocardia vàStreptosporangium [49].
Các nghiên cứu về đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh được công bố bởi các
nhóm nghiên cứu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ... Tan vàcộng sự
(2006) đã phân lập được 619 chủng xạ khuẩn từ các loại cây càchua khác nhau
vàtất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces [64]. Từ 36 cây dược liệu ở
Thái Lan, nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập được 330 chủng xạ
khuẩn thuộc 4 chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia,
Micromonospora) [63]. Inderiati và Muliani (2008) đã phân lập được các chủng
xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces từ cây thuốc lá[59]. Hơn nữa, Verma vàcộng
sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. chiếm khoảng 50% trong tổng số 55 chủng
thu nhận từ cây sầu đâu (Azadirachta indica A. Juss) tại Ấn Độ [30]. Tổng hợp
các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. cókhả năng thích ứng, phát triển
mạnh hơn so với các xạ khuẩn thuộc chi khác.
Trái với kết quả trên, nhóm nghiên cứu của giáo sư Li thuộc Viện VSV
học Vân Nam, Trung Quốc đã kết luận Microbispora chiếm 67% trên tổng số 81
chủng xạ khuẩn từ rễ cây bắp cải Trung Quốc (Brassica rapa), tiếp theo là
Streptomyces ssp. (12,0%) và Micromonospora ssp. (11,0%). Takahashi và
Omura (2003) phân lập 33 chủng Microbispora, 32 chủng Streptomyces và10
xạ khuẩn hiếm khác từ lárụng thuộc chín chi của thực vật bậc cao [49]. Theo
Kizuka vàcộng sự (1998), tỷ lệ phân lập Microbispora từ thực vật cao hơn đất
nhiều lần [33]. Như vậy, chi Streptomyces và Microbispora dường như sinh

AJ784008
DQ343154
GU227146
DQ460469
EU200682
EU814511
EU429322
FJ805428
DQ473536

Micromonospora
coriariae
Pseudonocardia
oroxyli
Pseudonocardia
artemisiae
Glycomyces
sambucus
Glycomyces
scopariae
Streptomyces
mayteni
Actinoallomurus
acaciae
Nocardia
callitridis
Leifsonia
ginsengi

Cây dƣợc liệu

Auriculiformis)
(99,3%)
Thông đỏ (Callitris
N. nova
preissii)
(97,4%)
Nhân sâm (Ginseng)
L. poae
(97.6%)

Những hiểu biết về đa dạng của xạ khuẩn nội cộng sinh không chỉ giúp
sàng lọc những chủng có lợi mà còn giúp các nhà khoa học hiểu rõ vai trò
chúng trong hệ sinh thái. Strobel vàDaisy (2003) cho rằng sự đa dạng lớn nhất
của xạ khuẩn nội cộng sinh diễn ra ở khu vực nhiệt đới vàkhu vực cónhiệt độ
13
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

ấm [59]. Janso và Carter (2010) công bố kết quả phân lập 123 xạ khuẩn nội
cộng sinh từ các loài cây nhiệt đới thu từ một số địa điểm ở Papua New Guinea
và Đảo Mborokua, quần đảo Solomon. Nhóm nghiên cứu đã tìm thấy 17 chi xạ
khuẩn khác nhau khi phân tích trì
nh tự gen 16S rDNA vàphát hiện chi mới như
Sphaerisporangium vàPlanotetraspora. Phân tích cây phát sinh loài cho thấy,
nhiều

chủng


dƣợc liệu
1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh
Chất kháng sinh đã được phát hiện vàứng dụng để chữa bệnh cho con
người. Nhờ kháng sinh mà chúng ta đã đẩy lùi được nhiều bệnh vàdịch bệnh
nguy hiểm như: tả, đậu mùa, thương hàn… Phần lớn các chất kháng sinh được
sử dụng trong y học cónguồn gốc từ xạ khuẩn. Trong số 8.000 chất kháng sinh
đã được biết đến trên thế giới thìtrên 80% làdo xạ khuẩn sinh ra.
14
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt lànhững loài được phân lập
từ cây dược liệu cókhả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như
vi khuẩn, nấm và virus. Như vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh cótiềm năng để phát
triển các loại thuốc kháng sinh mới (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh
Xạ khuẩn

Cây dƣợc liệu

Kháng sinh

Hoạt tính

Streptomyces sp.
NRRL 30562
Streptomyces sp.
NRRL 30566

Munumbicins A-D

Kháng sinh

Kakadumycins

Kháng sinh

24-demethylbafilomycin A2
Antimycin A18

Kháng sinh,
Kháng ung thư
Kháng nấm

Demethylnovobioci
n
6-Prenylindole

Kháng VSV

Lupinacidins A, B

Kháng ung thư

Cedarmycins A, B

Kháng nấm

Kháng nấm

Polyketides là nhóm đại diện cho các sản phẩm tự nhiên (sản phẩm trao
đổi chất bậc hai) được sản xuất bởi như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn vàthực vật
[52]. Các kháng sinh dạng polyketide được sử dụng nhiều trong sản xuất thuốc
điều trị các bệnh lâm sàng như tetracycline, daunorubicin, erythromycin,
rapamycin vàlovastatin... Nhóm polyketide được tổng hợp nhờ quá trình ngưng
kết lặp lại nhiều lần các carbon mạch ngắn hoặc các nhóm acetate hay acyl
propionate đặc trưng là dẫn xuất từ malonyl hay methylmalonyl coenzyme A
thioester. Mặt khác, polyketide có thể định nghĩa là các liên kết dạng polyme
được cấu thành từ các đơn vị ketide, các hợp chất này được chia thành 2 loại
gồm: polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS)
[41].
1.3.2.1. Gen chức năng pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa vòng thơm
Các polyketide đa vòng thơm được hì
nh thành chủ yếu từ quá trình ngưng
kết acyl acetate và nhóm β−carbonyl. Sau khi tổng hợp, chuỗi polyketide được
sắp xếp lại thành các hợp chất đa vòng thơm. Oxytetracycline, actinorhodin và
anthracycline làcác nhóm hợp chất kháng sinh, kháng ung thư đa vòng thơm
được tạo thành từ quátrình trên [27]. Gen mãhóa enzyme chịu trách nhiệm sinh
tổng hợp polyketide đa vòng thơm chủ yếu làpolyketide synthase II (PKS-II).
Hỗn hợp polyketide được hì
nh thành dựa trên quá trình ngưng kết từ các đơn vị
16
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

acetate, propionate, acyl butyrate và khử nhóm β−carbonyl. Trong tổng hợp
polyketide, các polyketide khác nhau được hình thành từ một hoặc nhiều quá
trình ngưng tụ. Các chuỗi polyketide tiếp tục phát triển, kéo dài và đóng vòng



Quách Ngọc Tùng - K16

Nhằm đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp của các nhóm xạ khuẩn khác
nhau, oligonucleotide primer được thiết kế, khuếch đại vùng KS và A nhằm
sàng lọc gen kháng sinh về mặt di truyền vànghiên cứu đa dạng của gen pks-I,
pks-II, nrps. Sacido vàGenilloud (2003) đã nghiên cứu đa dạng của gen pks-I,
pks-II, nrps trong 210 chủng đại diện thuộc 33 chi xạ khuẩn (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn
khác nhau
Phân nhóm

Tổng số
chủng

Actinomycetales
Streptomycetaceae
Micromonosporaceae
Nocardiaceae
Pseudonocardiaceae
Nocardiopsaceae
Actinosynnemataceae
Thermomonosporaceae
Streptosporangiaceae
Glycomycetaceae
Geothermatophilaceae

210
33

29
4
13
5
13
2
0

79,5
97,0
76,9
90,9
76,3
66,7
100
62,5
65,0
66,7
0

119
26
31
13
20
3
8
3
4
0


gen pks-I, pks-II, nrps được phát hiện trong họ Pseudonocardiaceae (chiếm
76,3% và 52,6%) với tỷ lệ cao trong các chi như: Amycolatopsis,
Saccharopolyspora vàSaccharomonospora. Ngoài ra, pks-I vànrps ít xuất hiện
trong chi Pseudonocardia mặc dùtỷ lệ các chủng được phân tích cao [53].
Trong các chủng thuộc họ Actinosynnemataceae, tỷ lệ pks-I, nrps được
phát hiện lần lượt đạt 100% và61,5% trên tổng số các chủng được kiểm tra,
mặc dù chỉ có một số đại diện là các chi Actinokineospora, Lechevalieria,
Saccharothrix, Lentzea, vàActinosynnema. Đặc biệt, pks-I vànrps phân bố với
tỷ lệ thấp trong các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae (khoảng 65% và
20%) và không xuất hiện ở các họ Nocardiopsaceae, Thermomonosporaceae,
Glycomycetaceae, vàGeodermatophilaceae.
Cả hai trì
nh tự này xuất hiện chủ yếu trong những chủng thuộc các chi
như Streptomyces hoặc các họ Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae và
Actinosynnemataceae. Các chi trên cógen mãhóa NRPS cókhả năng sinh tổng
hợp vancomycin hoặc các hợp chất polyketide như erythromycin hoặc spinosin.
Tuy nhiên, những trì
nh tự này cũng được phát hiện trong một số chủng không
sản xuất kháng sinh cũng như các chủng xạ khuẩn hiếm.
1.3.3. Chất kháng sinh và kháng ung thƣ nhóm anthracycline
Hiện nay, anthracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong
điều trị ung thư. Vào những năm 1960, anthracycline được phát hiện từ chất
màu của chủng xạ khuẩn S. peucetius, gồm 2 phân nhóm doxorubicin (DOX1)
vàdaunorubicin (DNR) [26].

19
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật



hóa tại vị tríC-4 hydroxyl trên phân tử đường. EPI được sử dụng trong điều trị
ung thư dạ dày, ung thư vú, nội mạc tử cung, phổi, buồng trứng và ung thư
tuyến tiền liệt…
IDA làdẫn xuất của daunorubicin, bị khuyết thiếu nhóm methoxy tại vị
tríC-4 dẫn đến làm tăng khả năng hòa tan trong chất béo, dung môi cũng như
hoạt tính ức chế tế bào ung thư. So với DNR, IDA cónhiều ưu điểm hơn DNR
trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào tủy cấp tí
nh. Hiện tại, cơ chế mànhóm
anthracycline ức chế tế bào ung thư vẫn chưa được làm sáng tỏ [26].
1.4. Cây quế vàtiềm năng khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế
Quế làtên gọi của nhiều loài trong chi Cinnamomum sp. thuộc lớp hai lá
mầm, ngành hạt kí
n, với đặc trưng là vỏ có dầu thơm, cay nồng, dùng làm
thuốc, hương liệu hay gia vị. Quế ưa khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sự
sinh trưởng, phát triển của quế là20-25oC. Hiện nay, nước ta có 4 vùng trồng
quế, mỗi vùng có những sắc thái riêng về tự nhiên về dân tộc vànguồn lợi thu
được từ quế, đó là: Vùng quế Yên Bái, vùng quế Quế Phong–Thường Xuân,
vùng quế TràMi–TràBồng, vùng quế Quảng Ninh.
Đông y coi quế làmột vị thuốc bổ, có nhiều công dụng, có khi chữa cả
đau mắt, hoi hen, bồi bổ cho phụ nữ sau sinh nở, bệnh đau bụng đi tả nguy hiểm
đến tí
nh mạng, bổ mệnh môn tướng hỏa, trị cố lãnh trầm hàn, dùng chữa chân
tay co quắp, lưng gối têmỏi, bụng quặn đau, kinh nguyệt bế, tiểu tiện bất lợi,
trên nóng dưới lạnh, chống ung thư, u khối. Ngoài ra, tinh dầu cây cótác dụng
khử nấm, đặc biệt nấm da. Dầu cây quế ở Pakistan, ngoài tác dụng ức chế nấm
Aspergillus niger, A. flavus, Candida albicans, còn rất hiệu nghiệm phòng bệnh
gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum, Microsporum canis, Pseudallescheria
boydii, Trichophyton mantagrophytes, T. simii. Ở Ghana, dầu quế đã được dùng
để ức chế một số độc tố aflatoxin trên những bao chứa đậu phụng do các loài
nấm như Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. niger, A. candidus, A. tamarii, A.

Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC
11778, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas auroginosa CNLM, Candida
albicans ATCC 10231, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của Phòng Công nghệ
lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt
Nam.
Chủng Escherichia coli XL1-blue [∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMRmrr)173 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac] (Stratagene, Mỹ) vàvector tách
dòng pJET1.2/blunt (Thermo scientific, Mỹ) được sử dụng để nhân dòng gen.
2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu
Hóa chất: Cao malt (Himedia-Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia-Ấn Độ);
Raffinose (Trung Quốc); Trehalose (Trung Quốc); Sodium dodecyl sulfate
(SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol,
Methanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol, Chloroform, Ampicillin,
Acrylamide, (Merck, Đức); Agar (Fluka, Đức); d-NTP (Fermentas, Mỹ), bộ kit
tinh sạch DNA từ gel agarose và kit tinh sạch plasmid của Thermo scientific
(Mỹ)...
Enzyme: T4 DNA ligase; BglII; RNAase; Taq DNA polymerase (Thermo
scientific, Mỹ).

23
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Applied
Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Biofuge fresco, Kendro, Đức); máy điện di
DNA (Nhật), máy UV (PowerPac Basic, Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (BSI25R CPT, Mỹ) và một số thiết bị nghiên cứu khác.
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Các môi trường được sử dụng trong lưu giữ giống, phân lập và xác định