VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
“PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA
XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI
TỈNH YÊN BÁI”

Giảng viên hướng dẫn: TS. Phí Quyết Tiến
NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Hồng Nhung

Lớp

: 11-03

Hà Nội -2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cộng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả thí nghiệm trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng có ai công
bố trong bất kì công trình nào khác. Một số thông tin trích dẫn đã được ghi rõ
nguồn gốc.

Hà Nội, ngày , tháng 05, năm 2015


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT

Từ viết tắt

Tên đầy đủ

1

ACP

Acyl carier protein

2

AT

Acyl transferase

3

ATP

Adenosine triphosphate

4

CA


Epirubicin

10

IDA

Idarumycin

11

HV

Humic acid-agar

12

KS

Ketosynthase

13

LPS

Lipopolysaccharide

14

NO


Polyketide synthases II

19

RA

Raffinose-histidine agar

20

RNA

Acid ribonucleic

21

SPA

Sodium propionate-asparagine-salt agar

22

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng


3.2

Thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 105 chủng xạ
khuẩn nội cộng sinh

29


DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Minh họa quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của
Streptomyces galbus MBR-5 trên lá đỗ quyên sau 60 ngày
quan sát

6

1.2

Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm
anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA

17


Hoạt tính kháng Proteus vulgaris (A), Staphylococus
epdermidis ATTC 12228 (B) của các chủng xạ khuẩn nội cộng
sinh

30

3.6

Các chủng xạ khuẩn trước (A, C) và sau (B, D) thử phản ứng
màu

31

3.7

Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I của một số
chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện.

32

3.8

Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II của một số
chủng xạ khuẩn nội cộng sinh đại diện.

33

3.9

Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số

2.1.2. Hóa chất ................................................................................................ 19


2.1.3. Thiết bị.................................................................................................. 19
2.1.4. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 21
2.2.1. Lấy mẫu ................................................................................................ 21
2.2.2. Xử lý bề mặt mẫu .................................................................................. 21
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ..................................... 21
2.2.4. Đánh giá khả năng sinh anthracycline ................................................... 22
2.2.5. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn nội cộng
sinh ................................................................................................................. 22
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23
3.1. Phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại tỉnh Yên Bái .................... 23
3.2. Một số đặc tính sinh học của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế ............... 26
3.2.1. Phân bố xạ khuẩn nội cộng sinh theo bộ phận cây quế.......................... 26
3.2.2. Xạ khuẩn nội cộng sinh theo môi trường phân lập ................................. 27
3.2.3. Phân nhóm xạ khuẩn nội cộng sinh theo nhóm màu .............................. 28
3.3. Đánh giá khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn........................ 29
3.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ............................. 29
3.3.2. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline ........................ 31
3.3.3. Khuếch đại một số gen chức năng tham gia sinh tổng hợp kháng sinh ... 32
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 35
4.1. Kết luận ....................................................................................................... 35
4.2. Kiến nghị..................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 36


MỞ ĐẦU
Ngày nay, con người đang đối mặt với nhiều dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn,

1


Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam gồm 3 nội dung chính như sau:
- Phân lập và đánh giá đặc trưng xạ khuẩn nội cộng sinh trên các mẫu quế thu
thập tại tỉnh Yên Bái.
- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân
lập.
- Đánh giá sự có mặt của một số gen chức năng tham gia tổng hợp chất kháng
sinh.

Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

2


PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu
1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu
Năm 1957, Smith đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora
sp. ở mô tế bào từ 4/20 giống cà chua khỏe mạnh và chủng xạ khuẩn này có khả
năng ức chế mạnh nấm Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici [47]. Từ đó, có rất
nhiều định nghĩa về vi sinh vật nội cộng sinh. Trong đó, Bacon và White đã định
nghĩa: “vi sinh vật (VSV) nội cộng sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào
thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ” [10]. Đồng thời, có rất
nhiều nghiên cứu cho thấy VSV nội cộng sinh tăng cường khả năng trao đổi chất,
kích thích tăng trưởng, tăng khả năng miễn dịch cho vật chủ bằng cách sản sinh ra
những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp [20].

trình phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh, ta cần xử lý bề mặt thực vật thật kỹ, tránh bị
nhiễm VSV cũng như tăng độ thuần chủng của loài xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập
được. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu cũng như thử nghiệm về việc phân lập
xạ khuẩn nội cộng sinh cũng như việc khử trùng bề mặt mẫu. Từ các tài liệu cho
thấy, để tránh khả năng nhiễm vi khuẩn cũng như vi nấm trên bề mặt, ta phải khử
trùng bề mặt mẫu. Ta rửa mẫu dưới vòi nước chảy liên tục để rửa trôi vi khuẩn và
vi nấm bề mặt, để khô, rồi cắt nhỏ mẫu bằng dụng cụ đã được khử trùng trước khi
phân lập. Một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến để khử trùng bề mặt là
Sodium hypochlorite (NaClO). Mẫu thực vật được ngâm trong 70-90% ethanol từ
1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước
vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư [37]. Ngoài ra, hydro peroxide và thủy
ngân clorid cũng là chất khử trùng vô cùng hiệu quả [41]. Năm 1992, Sardi và cộng
sự đã công bố sử dụng hơi của propylene ocid để khử trùng bề mặt thay vì dùng hóa
chất khử trùng dạng lỏng [51]. Tuy nhiên chỉ khử trùng bề mặt với ethanol không
hiệu quả với VSV nội cộng sinh. Nếu ta tăng gấp 2-3 lần các bước khử trùng bề mặt
bằng hỗn hợp ethanol và một số chất khử trùng bề mặt khác thì có thể loại bỏ hoàn
toàn VSV nội cộng sinh. Bên cạnh đó, ta có thể dùng Tween 20 và Tween 80, làm
tăng ái lực giữa thuốc khử trùng với bề mặt thực vật, làm tăng hiệu quả khử trùng
bề mặt cũng như loại bỏ VSV nội sinh [12]. Qua thực nghiệm cho thấy do bề mặt lá
có nhiều nấm và vi khuẩn bề mặt hơn nên ta cần xử lý bề mặt lá kỹ hơn bằng cách
để thời gian ngâm lá trong NaClO lâu hơn.
Sau khi đã khử trùng xong, phần mẫu đó được đặt vào trên môi trường thạch
thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30oC. Tuy nhiên, trong quá trình
Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

4


phân lập, trong hai tuần đầu tiên, vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực
vật thường phát triển mạnh. Để ngăn chặn sự sinh trưởng, phát triển của chúng cũng

5


vào cây chủ nhưng cũng khẳng định được xạ khuẩn nội cộng sinh xâm nhập vào
cây chủ từ rất sớm, và có thể xâm nhập qua phôi của vỏ hạt giống rồi mở rộng ra
các nội nhũ của hạt. Năm 2007, Franco tiếp tục quan sát khuẩn lạc của chủng EN27
tại các vết nứt xung quanh rễ và quá trình hình thành bào tử trong 3-4 tuần [22]. Kết
quả cho thấy sự lây nhiễm chủng vào rễ thông qua các vết nứt để xâm nhập và nhân
lên trong các mô tế bào.
Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá
và thân cây đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 bằng cách quan sát qua kính hiển
vi điện tử, cho hệ sợi của chủng S. galbus MBR-5 vào lá thông qua các lỗ khí
nhưng không thông qua lớp biểu bì, vì lớp biểu bì còn nguyên vẹn (Hình 1.1).
Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme ngoại
bào thủy phân như xylanase, cellulase và pectinase [51] .

Hình 1.1: Minh họa quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của
Streptomyces galbus MBR-5 trên lá đỗ quyên sau 60 ngày quan sát
Ghi chú: (a) quá trình xâm nhập vào lỗ khí. Khuẩn ty được gắn trên vật liệu
electron (G: tế bào bảo vệ). (b) các tế bào hệ sợi (mũi tên) trong khoang gian bào
bên dưới lớp biểu bì (E: tế bào biểu bì; IS : khoang gian bào; M: tế bào mesophyll).

Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

6


1.1.4. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh
Trong suốt thời gian cùng tiến hóa với cây chủ, các loài xạ khuẩn nội cộng
sinh đã thích nghi và hình thành khả năng cộng sinh hoàn toàn với cây chủ [58].


Kích thích tăng trưởng thực vật
Các loài nội cộng sinh sinh trưởng bên trong cây chủ để lấy chất dinh dưỡng
và sự bảo vệ từ cây chủ. Đổi lại, chúng tăng cường khả năng miễn dich cho các nhà
máy chủ bằng cách sản xuất một loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học.
Thông qua VSV nội cộng sinh kích thích sự tăng trưởng của cây trồng bằng các loài
nội cộng sinh có thể cố định nitơ hoặc sản xuất phytohormone, kiểm soát sinh học
của phytopathogen thông qua sản xuất thuốc kháng sinh hoặc siderophore, cạnh
tranh dinh dưỡng và cảm ứng của hệ thống kháng bệnh. Meguro và cộng sự (2006)
đã tìm thấy chủng Streptomyces sp. MBR-52 trong rễ, có tác dụng kích thích sự
mọc rễ [40]. Khi ông thực hiện cấy loài xạ khuẩn này vào rễ cây non, ông quan sát
thấy khả năng mọc rễ của cây nhanh hơn bình thường. Điều này có ý nghĩa vô cùng
quan trọng trong thực tế để rút ngắn thời gian thử nghiệm các cây giống nuôi cấy
mô trong môi trường ấm áp và ẩm ướt, qua đó làm giảm nguy cơ mắc bệnh nhiễm
khuẩn của cây con.
Enzyme thủy phân
Ngoài ra, xạ khuẩn nội cộng sinh còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao.
Một số chủng thuộc chi Streptomyces có khả năng sinh một số enzyme thủy phân
như xenlulase, hemicellulase, chitinase, amylase và glucanase. Streptosporangium
spp. được phân lập từ lá của cây ngô đã được đưa ra để sản xuất glucoamylase.
Fatema và cộng sự (2013) đã chứng minh rằng, hệ sợi nấm Streptomyces trên bề
mặt lá cây đỗ quyên đã tiết ra enzyme thủy phân bề măt lá để xâm nhập vào các mô
tế bào [21].
Kiểm soát sinh học
Không chỉ được chú ý bởi khả năng sinh chất kháng sinh, xạ khuẩn nội cộng
sinh còn được chú ý bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với các mầm bệnh do khả
năng cộng sinh và tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Năm
2004, Cao và cộng sự đã báo cáo hoạt động kiểm soát sinh học của chủng
Streptomyces sp. chống lại bệnh thối nhũn ở cây cà chua non do R. solani gây ra.
Nhiều nghiên cứu khác đã chứng minh khả năng bảo vệ cây chủ khỏi các tác nhân

thể hiện trong bảng 1.1.

Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

9


Bảng 1.1. Một số nghiên cứu trên thế giới về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây
dược liệu
Cây dược liệu

Phân loại xạ khuẩn

Cơm cháy
( Sambucus adnata)

Glycomyces

Riềng nếp
( Alpinia galangal)

Streptomyces,
Nocardia, Microbispora,
Micromonospora

Mộc lan

[28]
[54]


Streptomyces aureofaciens

[54]

[32]

(Zingiber offcinale)
Trong thời gian ngắn đã có rất nhiều loại xạ khuẩn nội cộng sinh được phân
lập từ cây dược liệu. Trong giai đoạn từ 2005 đến 2012 đã có hơn 70 loài xạ khuẩn
mới phân lập được từ mô sống của cây dược liệu được công bố trên các tạp chí
International Journal of Systematic and Evolutionery Microbiology and Antonie
van Leeuwenhoek [11]. Năm 2008, Li và cộng sự áp dụng phương pháp xử lý nhiệt
khô và xử lý mẫu thực vật với nitơ đông khô trước khi phân lập đã phân lập được từ
cây thanh hao hoa vàng 228 chủng xạ khuẩn, trong đó 31 chủng có hoạt tính phổ
rộng kháng khuẩn, 7 chủng có hoạt tính amylase mạnh, 10 chủng có hoạt tính
protease mạnh, 1 chủng có hoạt tính lipase mạnh và 19 chủng có hoạt tính ức chế sự
phát triển của cỏ dại. Cũng trên đối tượng này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các
phương pháp xử lý bề mặt mẫu khác nhau cũng như sử dụng các loại môi trường
khác nhau để phân lập được 312 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh tại Vân Nam, Trung
Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

10


Quốc. Trong đó, 48 chủng thể hiện hoạt tính kháng đối với các vi khuẩn kiểm định.
Đến nay, nhiều công trình trên thế giới đã công bố hoạt chất cinnamaldehyde trong
cây quế có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn
Gram (-) (Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Enterobacter...) nhờ ức chế quá
trình tổng hợp ATP và gây ra sự giảm việc sản xuất ATP nội bào. Tuy nhiên, chưa
có công trình nghiên cứu về xạ khuẩn liên quan đến cơ chế nội cộng sinh trên cây

phosphate vô cơ [1].
Theo thống kê của viện dược liệu, Việt Nam đã phát hiện hơn 4000 loài cây
thuốc, trong đó có nhiều loại dược liệu quý được thế giới công nhận như cây hồi,
quế, atiso… Cho đến nay, trên thế giới và Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu
xạ khuẩn nội cộng sinh, cũng như đánh giá đa dạng xạ khuẩn trên cây quế.
1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược
liệu
1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh
Chất kháng sinh đã được phát hiện và ứng dụng trong việc đẩy lùi bệnh tật do
vi khuẩn hay nấm gây ra như thương hàn, tả, đậu mùa. Theo Berdy (2005) khoảng
70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng hiện
nay được sinh bởi xạ khuẩn [11]. Nhiều loại xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là
những loài từ cây dược liệu có khả năng ức chế, tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh
như vi khuẩn, nấm, virus. Bảng dưới đây cho thấy tiềm năng sinh chất kháng sinh
của xạ khuẩn nội công sinh phân lập từ cây dược liệu ( Bảng 1.2).

Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

12


Bảng 1.2. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu
Xạ khuẩn
Streptomyces sp.
NRRL 30562

Cây dược liệu

Chất kháng sinh



Streptomyces
albidoflavus

Vẹt dù (Bruguiera
Gymnorrhiza)

Antimycin A18

Kháng nấm

Streptomyces sp.
TP-A0556

Thanh mộc (Aucuba
japonica)

Demethylnovobioc
in

Kháng VSV

Streptomyces sp.
TP-A0595

Hẹ
(Allium tuberosum)

6- Prenylindole



Kháng nấm

Cho đến nay, rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu các chất kháng sinh
từ thực vật, đặc biệt là kháng sinh sinh ra từ VSV nội cộng sinh trên cây dược
liệu ngày càng được chú ý. Công tác nghiên cứu về chất kháng sinh từ thực
vật, đặc biệt là từ cây dược liệu ngày càng được chú ý. Trong bảng 1.1 cho
thấy đã có rất nhiều chất kháng sinh được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau,
kháng được nhiều loài VSV khác nhau như lansai A-D,
Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

munumbicin,
13


celastramycin AB [9]. Năm 2002, Castillo và cộng sự đã phân lập được
Streptomyces sp. NRRL 30562 từ hoa mộc lan để sản xuất bốn loại kháng
sinh mới, munumbicins A, B, C và D với khối lượng tương ứng 1269,6;
1298,5; 1312,5 và 1326,5 Da. Các chất kháng sinh này có khả năng chống
nấm gây bệnh và vi khuẩn. Chất Kadumycin được tách chiết từ dịch lên men
chủng Streptomyces sp. NRRL 30566 phân lập từ cây cơm vàng sinh kháng
sinh có hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, với
nồng độ ức chế tối thiểu là 0,2-0,3 µg. mL-19 [14]. Gần đây, hợp chất chống
nấm rất mạnh saadamycin được tìm thấy trong Streptomyces sp. Hedaya48 và
thể hiện hoạt tính kháng nấm gây bệnh hắc lào và một số nấm gây bệnh khác
[19]. Alpha- glucosidase được sinh ra từ xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ
các cây thuốc chữa bệnh tiểu đường như: lô hội, cây nghệ đen (Curcuma
aeruginosa), cây rau má (Centela asiatica), cây xuyên tâm liên (Andrographis
paniculata), cây tô mộc (Caesalpinia sappan), cây nghệ (Curcuma
xanthoriza), cây kim thất (Gynura procumbens), cây atiso (Hibiscus

(ACP). Các gen chịu trách nhiệm tổng hợp sản phẩm cuối cùng là polyketide
synthase I (PKS-I) [39]. Gen pks-I là enzyme và xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp
hầu hết các polyketide phi vòng thơm như erythromycin, rifamycin, epothilone, và
myxothiazol [55].
Ngoài gen pks, gen chức năng nrps cũng tham gia vào quá trình hình thành
polyketide. NRPS là nhóm enzyme có khối lượng phân tử lớn, bao gồm vùng A
(adenyl hóa), vùng ngưng tụ hoặc kéo dài (C), vùng E (epime hóa) và TE
(thioesterase). NRPS tham gia tổng hợp polyketide không thông qua ribosome, bào
gồm: kháng sinh, chất ức chế miến dịch, kháng viêm [26]. Trong quá trình tổng
hợp, NRPS chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các acid amin có những sai khác nhờ
sự tương tác với vùng epime hóa dưới tác động của methyltransferase và oxydase
[39].
Để khuếch đại các gen trên, mồi suy biến đã được thiết kế, khuếch đại vùng A
và KS nhằm sàng lọc gen tham gia vào quá trình tổng hợp chất kháng sinh, kháng
viêm hay nghiên cứu đa dạng của gen pks-I, pks-II, nrps.

Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

15


1.3.3. Khả năng sinh các chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline
Trong quá trình cộng sinh với cây chủ, thực vật nội cộng sinh không chỉ sinh
ra các chất chuyển hóa sinh học có khả năng kháng khuẩn mà còn sản xuất ra các
hợp chất chống ung thư. Gần đây, các nhà khoa học đã chú ý hơn đến việc nghiên
cứu các hợp chất sinh học mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh có khả năng chống ung
thư và đã thu hoạch được kết quả rất tốt. Các chất chuyển hóa thứ cấp mang hoạt
tính kháng ung thư sản xuất từ xạ khuẩn nội cộng sinh cản trở sự nhân lên, làm
giảm hoặc phát triển tế bào ung thư.
Theo một số nghiên cứu cho thấy có rất nhiều nhóm kháng sinh có khả năng

thư vú,... IDA là dẫn xuất của daunorubicin, bị khuyết thiếu nhóm methoxyl tại vị
trí C-4 dẫn đến làm tăng khả năng hòa tan trong chất béo, dung môi cũng như ức
chế tế bào ung thư.
1.4. Cây quế và tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh
Cây quế (Cinnamo) tên khoa học là Cinnamomum loureirii, thuộc giống:
Cinnamomum, họ: Lauraceae, lớp hạt mầm, ngành hạt kín. Quế có đặc trưng là vỏ
có tinh dầu thơm, cay, là một vị thuốc trong đông y, làm hương liệu hay gia vị. Quế
là loài cây thích hợp khí hậu nhiệt đới ẩm, mưa nhiều, nắng nhiều, vì vậy các vùng
Nguyễn Thị Hồng Nhung, lớp 11-03

17