BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 TRẦN THÙY DUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG
SINH CELLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN
Ở XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO


Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đinh Thị
Kim Nhung và các thầy cô phòng Vi sinh, phòng sau đại học, khoa Sinh -
KTNN đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh -
KTNN, các thầy cô giáo giảng dạy và hướng dẫn đã tạo điều kiện cho em
thực hiện và hoàn thành luận văn. Cảm ơn tất cả các bạn học viên đã giúp đỡ
tôi để hoàn thành khóa luận một cách tốt đẹp.
Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã giúp đỡ, động viên để em
vững tin hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Học viên Trần Thùy Duyên LỜI CAM ĐOAN


Lời cam đoan
Mục lục
Ký hiệu viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
MỞ ĐẦU 1

1. Lý do chọn đề tài 1

2. Mục đích nghiên cứu 2

3. Nội dung nghiên cứu 2

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5. Phương pháp nghiên cứu 2

6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

7. Đóng góp mới của đề tài 3

Chương 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4

1.1.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 4

1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn 13


2.2. Môi trường 24

2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn 24

2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giống 25

2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme 25

2.3. Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 26

2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu 27

2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống 27

2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 27

2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính Cellulase của xạ khuẩn 28

2.3.6. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 29

Chương 3 31

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn trong cỏ khô ủ đốt tại khu vực
Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 31


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BG : Bột giấy
C
1
: Exoglucanse
C
x
: Endoglucanse

Bảng 3.5. Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 42
Bảng 3.6 . Khả năng đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn X
3
47
Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn X
3
47
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase
của chủng xạ khuẩn X
3
50
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt
tính cellulase của chủng xạ khuẩn X
3
50
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase của chủng xạ
khuẩn X
3
52
Hình 3.11. Môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên 49

1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh
học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng ở
hầu hết trong các lĩnh vực công nghiệp chế biến như: công nghiệp chế biến
thực phẩm, công nghiệp sản xuất phân bón, chăn nuôi, y tế

Cellulase là một trong những enzyme được sử dụng phổ biến trong
nhiều nghành chế biến, đặc biệt là các chế phẩm được ứng dụng trong xử lý
rác thải nhằm rút ngắn thời gian phân hủy, khép kín vòng tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên, đồng thời góp phần cải tảo đất và bảo vệ môi trường. [29], [30].
Cellulase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài khác nhau như: các loài xạ
khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh. Trong số các
nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuẩn phân giải cellulose là một trong những
đối tượng đã và đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm.
Xạ khuẩn trong đất là một trong các nhóm sinh vật đất có số lượng lớn.
Chúng chiếm tới 10 - 70 % số tế bào vi sinh vật trong đất. Ở môi trường trung

3
.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose có trong cỏ khô
ủ đốt.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
5. Phương pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp lấy mẫu
5.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn
5.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
3
5.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
5.5. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý hóa sinh của xạ khuẩn
5.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
5.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
Việc nghiên cứu các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy giúp tìm
ra môi trường thích hợp nhất cho xạ khuẩn phát triển.
Xác định được mức độ đa dạng sinh học của nhóm xạ khuẩn, vai trò
của chúng với hệ sinh thái khu vực, Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có
hoạt tính enzyme cellulase cao. Kết quả nghiên cứu này là cơ đưa ra biện
pháp giảm thiểu và khắc phục ô nhiễm môi trường.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự nhiên
của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Tạo cơ sở cho phương thức
canh tác (cày xới, cải tạo đất, bón phân, luân canh, xen canh…) theo hướng
lợi dụng vi sinh vật phân giải cellulose, tăng cường phân giải các hợp chất

tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của những vòng tròn
đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng. Khi sợi mọc qua
vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng cơ chất ức chế chúng lại
sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh
trưởng sát với nó khiến khuẩn ty phát triển yếu đi. Cứ như thế tạo thành các
vòng tròn đồng tâm[7].
5
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng
sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất
kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ… có thể được tích lũy trong
sinh khối tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường.
*Hệ sợi
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một
loại phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ
khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử gọi là HSKS (khuẩn ty khí sinh - aerial
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố
thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu sắc khác với màu sắc của
HSKS. Đây cũng là đăc điểm phân loại xạ khuẩn quan trọng.
Một số xạ khuẩn không có HSKS mà chỉ có HSCC, loại sợi này cho bề
mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khỏi môi trường khi cấy truyền. Loại chỉ có
sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường.
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng, hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trường hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy
lắc hoặc nồi lên men khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông
hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những
quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1 đến 2 - 3mm.
1.1.1.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic, đường arbinose và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid và protein. Chúng có vai trò
đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành
bào tử của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với
tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom
7
và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc
nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).
Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở
chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 50%, trong khi
đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45% [10].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong
nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự
nhân lên và được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào
nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất,
chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản
xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [16].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng
là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amôn… Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác
nhau là khác nhau.
1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu,
acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon.

+ Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa.
+ Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi
bào tử có móc hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng đến lượn sóng.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, như ta đã
biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự
sắp xếp lại trong trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện
9
khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt
hình thái. Vì vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta cần nghiên
cứu thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch
học hay sinh học phân tử [28].
1.1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (chemotaxonomy)
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
+ Typ thành tế bào chủ yếu dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong
thành phần peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào
thành tế bào.
+ Typ Peptidoglucan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và
cấu trúc của mạch tetrapeptid của PG, cầu nối peptid và các liên kết giữa
các mắt xích của PG. Năm 1974 Steiner đã chia các PG thành hai nhóm cơ
bản là A và B.
+ Menaquinon: XK giống vi khuẩn Gram dương ở chỗ tổng hợp
menquinon và dimetylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon. Phần lớn các
chi của XK có thành phần menaquinon xác định.
+ Phospholipid: Năm 1997, Lechevalier đã sử dụng đặc điểm của
phospholipid để phân XK có 5 typ phospholipid: (PI, PII, PIII, PIV, PV) có
thành phần đặc trưng và có ý nghĩa cho phân loại XK [25].
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Khi phân loại XK đến loài người ta sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh

: Mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%).
N
S
: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh.
N
d
: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương
tính của chủng này và âm tính của chủng kia
).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu
rễ cây) của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất sẽ
được xếp vào một nhóm [27].
1.1.2.5. Phân loại xạ khuẩn
Một số chi trường gặp trong phân loại xạ khuẩn:
Chi Actinopolyspora:
Hệ sợi phân nhánh, hình thành rất nhiều sợi khí sinh có đường kính
khoảng 1 μm. Sợi cơ chất hầu hết không đứt đoạn. Cuống sinh bào tử chứa 20
hoặc hơn bào tử dạng que ngắn hoặc dạng cầu với vỏ nhẵn hình thành trên sợi
khí sinh theo chiều hướng gốc. Sợi cơ chất không sinh bào tử. Gram dương.
Nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP, arabinose và galactose.
Không chứa acid mycolic. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC
trong ADN là 64,2%.
11
Loài chuẩn: Actinopolyspora halophila [8].
làm nguồn cacbon. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69 - 74%.
Chi Frankia:
Không sinh sợi khí sinh. Túi bào tử thường sinh trên cuống sinh bào tử.
Bào tử không có khả năng di động với hình dạng không cố định, từ không màu
đến màu đen. Gram dương - hoặc Gram không cố định (variable). Hiếu khí
hoặc vi hiếu khí. Catalase dương tính. Ưa ấm. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Thường

), MK-9(H
8
). Thành phần phospholipid chính là
diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol
và phosphatidylinositol mannoside. Có nhiều trong đất, phân compôt. Một số
loài gây bệnh cho người và động vật, một số loài gây bệnh ở thực vật. Tỷ lệ mol
GC trong ADN là 69 - 78%.
Loài chuẩn: Streptomyces albus [8].
Chi Actinomadura:
Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh, rất phát triển. Khuẩn ty cơ chất không
đứt đoạn, có hoặc không có khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn
trưởng thành sẽ hình thành chuỗi ngắn, đôi khi dài của các bào tử đốt
(arthrospore). Chuỗi bào tử có thể ở dạng thẳng, uốn cong hoặc xoắn không
đều (1 - 4 vòng). Bề mặt bào tử nhẵn hoặc có các nốt. Khuẩn ty khí sinh khi
đã hình thành bào tử có màu trắng, xám hay nâu, vàng, đỏ, xanh lục, xanh lam
hay tím. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhiệt độ sinh trưởng từ 20 đến 45
o
C.
Một số loài . Gram dương. Thành tế bào chứa meso-DAP, không chứa acid
mycolic. Tế bào chứa madurose. Thành phần menaquinone chính là MK-9
(H
4
) và MK-9 (H
6
). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 65 - 69%.
Loài chuẩn: Actinomadura madurae [8].
Chi Microbispora:
Khuẩn ty khí sinh phân nhánh, hình thành từng cặp hai bao tử gắn với
nhau. Bào tử mọc trực tiếp hoặc trên cuống sinh bào tử ngắn, hình cầu hoặc
oval, đường kính trung bình 1,2 - 1,6μm và không có khả năng di động.

, B
6,

B
12
), một số acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [15].
Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong ngành công
nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này
vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào
như protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành chất
kích thích sinh trưởng cho thực vật.
14
1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của xạ khuẩn
Theo Nguyễn Thành Đạt trong quá trình tiến hóa của các VSV có quan
hệ mật thiết đối với các yếu tố của điều kiện sống. VSV cần ở tự nhiên hay
môi trường nuôi cấy nhân tạo chất dinh dưỡng để xây dựng nên các hợp chất
của tế bào và những hợp chất dùng để trao đổi năng lượng [10].
Nhu cầu dinh dưỡng của các VSV rất khác nhau. Ngay trong cùng một
loài VSV nhu cầu này cũng không có sự thống nhất. Giống như các loài VSV
khác nhu cầu dinh dưỡng ở các loài xạ khuẩn cũng khác nhau. Trong công
nghiệp tùy thuộc vào mục đích mà người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng
thích hợp nhằm thu được năng suất cao nhất, ví dụ nuôi cấy thu enzyme
cellulase người ta quan tâm đến nguồn cacbon; nếu mục đích sản xuất là thu
được một lượng lớn chất kháng sinh thì người ta lại quan tâm đến nguồn nitơ.
1.2.1. Nhu cầu cacbon
Cacbon chiếm 50% vật chất khô của VSV, là yếu tố quan trọng trong
tất cả các hợp chất hữu cơ có mặt trong tế bào. Các hợp chất cacbon là
nguyên liệu cho các hoạt động sống [10]. Trong tự nhiên có 2 dạng hợp chất
cacbon cơ bản là cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ, mỗi sinh vật khác nhau sử
dụng các nguồn cacbon khác nhau. Dựa vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà

+
. Các ion này đều làm kiềm hóa môi trường [8]. Nguồn nitơ
khó hấp thụ hơn cả là nguồn nitơ khí trời. Một số loài VSV có thể sử dụng
nguồn này nhờ khả năng cố định nitơ (chuyển hóa N
2
NH
3
).
Phần lớn xạ khuẩn đều có đời sống dị dưỡng nitơ. Chỉ có một số loài
thuộc chi Frankraceae có khả năng cố định nitơ nhờ sống cộng sinh với rễ
cây họ đậu.
1.3. Cellulose và Cellulase
1.3.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C
6
H
10
O
5
)
n
và là
thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết
với nhau, 4-O-(β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose
cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng
hợp được khoảng 10
11
tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và
trong bông chiếm khoảng 90%).
Hình 1.1. Công thức hóa học của cellulose