ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Ngọc NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC,
ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG
CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Thị Hồng Ngọc
luận án.
Tôi gửi lời cảm ơn tới các cô chú, bạn bè đồng nghiệp trong khoa Sinh
học Phân tử, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, những người
đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lòng
biết ơn sâu sắc tới dự án hợp tác Song phương Việt – Bỉ, Quỹ toàn cầu phòng
chống sốt rét Việt Nam và trường đại học Nagasaki Nhật Bản đã hỗ trợ tôi
các phương tiện, công cụ, máy móc, hoá chất để hoàn thành các thí nghiệm
trong luận án. Cảm ơn bạn bè thân thiết luôn là nguồn cổ vũ động viên tôi
phấn đấu.
Với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho gia đình, bố mẹ
những người đã dắt dìu, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc.
Tác giả
Nguyễn Thị Hồng Ngọc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số
liệu, kết quả trong luận án này là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong
bất kỳ công trình hoặc tài liệu nào.
Tác giả Nguyễn Thị Hồng Ngọc
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 35
2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 35
2.2.1. Thời gian nghiên cứu 35
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu 36
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 36
2.3.2. Mẫu nghiên cứu 36
2.3.3. Phƣơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa 37
2.3.4. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 38
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53
3.1.1. Phân bố, đặc điểm sinh học và vai trò truyền bệnh của nhóm loài
Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 53
3.1.2. Đa hình di truyền isozyme của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở
Việt Nam 69
3.1.3. Đa hình di truyền của nhóm loài Anopheles leucosphyrus dựa vào
các chỉ thị phân tử 76
3.1.4. Kết quả tạo chủng muỗi An. dirus kháng với permethrin chủng phòng
thí nghiệm 82
3.1.5. Kết quả thử nghiệm sinh học đối với hai quần thể muỗi thu thập tại
thực địa 84
3.1.6. Kết quả xác định gen kháng ngã gục muỗi An. dirus bằng PCR-RFLP 86
3.1.7. Kết quả xác định sự biểu hiện quá mức của gen P450 88
3.2.BÀN LUẬN 89
3.2.1. Phân bố của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 89
3.2.2. Đặc điểm sinh học, vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles
leucosphyrus ở Việt Nam 92
3.2.3. Tính đa hình của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 94
3.2.4. Tính kháng hóa chất của An. dirus 97
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dNTP: deoxynucleoside triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
(E.C): Enzyme code (Mã số enzyme )
EC: European commission (Cộng đồng Châu Âu )
EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
(Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme )
EST: Esterase
et al: và những ngƣời khác
EtBr: Ethidium bromide
FUM: Fumerate hydratase
HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase
HK: Hexokinase
GABA: Gama aminobutyric acid
GPI: Glucosephosphate isomerase
GPDH: Glycerophosphate dehydrogenase
GOT: Glutamate oxaloacetate transminase
GST: Glutathion S transferase
HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase
IGS: Intergenic spacer (Vùng đệm nội gen)
ITS: Internal transcripbed spacer (Vùng đệm nội phiên mã)
IDH: Isocitrate dehydrogenase
I
N
: Genetic Identity (Hệ số tƣơng đồng di truyền )
KST: Ký sinh trùng
(Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn)
Rf: Tốc độ chuyển dịch tƣơng đối của cấu tử điện di
r
ARN: Acid ribonucleic Ribosome
SSCP: Single Strand Conformational polymorphism
(Đa hình cấu tạo sợi đơn)
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TBE: Tris-Borate-EDTA
TE: Tris-EDTA
Viện SR-KST-CTTƢ: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ƣơng
WHO: World Health organization
(Tổ chức y tế thế giới ) DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi để xác định KST trong muỗi 41
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR lần 1 nhân bản đoạn gen chung của
giống Plasmodium 42
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi phát hiện 4 loài KST SR 43
Bảng 2.4. Trình tự mồi nhân bản đoạn COI và ND6 44
Bảng 2.5. Trình tự mồi nhân bản đoạn CYP6P4, CYP6P9 và RSP7 50
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng qRT-PCR 52
Bảng 3.1. Các điểm điều tra có muỗi thuộc nhóm loài Anopheles
leucosphyrus 54
Bảng 3.2. Tần số alen của các quần thể nghiên cứu 71
Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền và hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các
quần thể nghiên cứu 75
Bảng 3.4. Giá trị LC
50
Hình 1.6. Cấu trúc của GABA 31
Hình 3.1. Địa điểm thu thập mẫu muỗi trong nhóm loài Anopheles
leucosphyrus 55
Hình 3.2. Sinh cảnh của muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus 56
Hình 3.3. Hình ảnh ổ bọ gậy muỗi thu thập tại Bắc Kạn 58
Hình 3.4. Sơ đồ mô tả hình thái cánh điển hình An. dirus (theo Sallum,
2005) 59
Hình 3.5. Hình thái cánh của An. dirus Phú Yên 59
Hình 3.6. Hình thái cánh của muỗi thu thập tại Bắc Kạn 60
Hình 3.7. Một số đặc điểm của bọ gậy Anopheles dirus 60
Hình 3.8. Sơ đồ mô tả hình thái bọ gậy Anopheles dirus (theo Sallum, 2005) 61
Hình 3.9. Một số đặc điểm của bọ gậy thu thập tại Bắc Kạn 62
Hình 3.10. Sơ đồ mô tả hình thái điển hình bọ gậy Anopheles takasagoensis
(theo Sallum, 2005) 63
Hình 3.11. Một số đặc điểm của quăng Anopheles dirus 64
Hình 3.12. Sơ đồ mô tả hình thái quăng Anopheles dirus (theo Sallum,
2005) 65
Hình 3.13. Một số đặc điểm của quăng thu thập tại Bắc Kạn 66
Hình 3.14. Sơ đồ mô tả hình thái điển hình quăng Anopheles takasagoensis
(theo Sallum, 2005) 67 Hình 3.15. Kết quả thử nghiệm ELISA phát hiện KST trong muỗi thu thập
tại Phú Yên và Quảng Trị 68
Hình 3.16. Kết quả xác định ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR 69
Hình 3.17. Hình ảnh điện di của hệ isozyme IDH của các quần thể An. dirus 70
Hình 3.18. Hình ảnh điện di của hệ isozyme 6-PGD (A), αPGD (B), GPI (C)
của các quần thể An. dirus 72
Hình 3.19. Hình ảnh điện di của hệ isozyme GOT của các quần thể An.
dirus 74
ngƣời/100 quốc gia sống trong vùng sốt rét lƣu hành. Ở Việt Nam, tình hình
sốt rét những năm gần đây có cải thiện nhƣng nguy cơ sốt rét quay trở lại vẫn
còn là điều lo ngại của ngành Y tế và các cấp chính quyền. Việc giám sát
vector truyền bệnh có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến lƣợc phòng
chống và tiêu diệt bệnh sốt rét. Tuy nhiên, công việc này còn gặp nhiều khó
khăn do các vector truyền bệnh rất đa dạng về tập tính, sinh lý, sinh thái, di
truyền cũng nhƣ khả năng kháng hóa chất diệt côn trùng. Do đó việc xác định
chính xác và nắm rõ bản chất sinh học của các vector là hết sức cần thiết.
Nhóm loài Anopheles leucosphyrus thuộc series Neomyzomya, giống
Anopheles (Cellia). Nhiều loài trong nhóm loài này đóng vai trò là vector
chính truyền bệnh sốt rét cho ngƣời tại vùng Đông Nam Á: Anopheles
balabacensis, Anopheles latens, Anopheles leucosphyrus [94], Anopheles
baimaii, Anopheles dirus. Ở Việt Nam, Toumanoff (1936) đã phát hiện thấy
muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus và đặt tên là An.leucosphyrus,
về sau loài muỗi này đƣợc chuyển tên thành An. balabacensis[19]. Những
nghiên cứu sau này cho rằng ở Việt Nam có An. dirus và An. takasagoensis
thuộc nhóm loài này [16]. Ngoài 2 loài trên, theo Peyton còn có dạng Côn
Sơn và một mẫu muỗi cái ở Quảng Ninh chƣa đƣợc phân loại đến loài [84].
Tuy nhiên, những nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử của Manguin và cs
2
(2002) lại kết luận rằng ở Việt Nam chỉ có một loài là An. dirus A (An. dirus
s.s)? Nhƣ vậy thành phần loài của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt
Nam là chƣa rõ ràng. Các nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào loài
An. dirus. Hàng loạt công trình nghiên cứu từ năm 1962 đến nay đã khẳng
định An. dirus là loài muỗi hoang dại truyền sốt rét nguy hiểm, tuổi thọ dài,
có vùng phân bố trùng với vùng phân bố của ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
P. falciparum, gây ra các vụ dịch dai dẳng từ Thanh Hóa trở vào Nam, đặc
biệt vào mùa mƣa là mùa truyền bệnh sốt rét mạnh nhất của khu vực miền
Anopheles leucosphyrus cho kết quả chính xác, sâu sắc và toàn diện
hơn so với các nghiên cứu trƣớc. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc
số loài, số dạng của nhóm loài này ở Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn: Xác định đúng đƣợc thành phần loài, tỷ lệ nhiễm
KST sốt rét, tính đa hình di truyền của một nhóm loài truyền bệnh sốt
rét chính nhƣ nhóm loài Anopheles leucosphyrus tại Việt Nam rất quan
trọng. Điều này giúp cho các nhà dịch tễ học đánh giá đúng tình hình
vector truyền bệnh tại điểm nghiên cứu từ đó đề xuất những chính sách,
chiến lƣợc phòng chống bệnh hiệu quả và làm giảm gánh nặng sốt rét
cho xã hội. 4
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Lần đầu tiên phối hợp nhiều kiểu dấu hiệu từ hình thái đến điện di
enzyme và phân tích phân tử ADN để nghiên cứu một nhóm loài đồng
hình có vai trò truyền sốt rét ở Việt Nam và đã xác định đƣợc mối quan
hệ di truyền giữa các thành viên trong nhóm loài Anopheles
leucosphyrus
2. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tồn tại của một dạng mới có cấu trúc di
truyền khác biệt so với các loài muỗi khác trong nhóm loài Anopheles
leucosphyrus. Dạng muỗi này ở miền Bắc Việt Nam (tỉnh Bắc Kạn ) và
tạm gọi là dạng Anopheles Bắc Kạn.
viên là An. dirus (= An. dirus A) phân bố rộng rãi ở vùng Đông Á- có mặt ở
Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và đảo Hải Nam (Trung
Quốc). An. cracens (= An. dirus B) có ở miền nam (bán đảo) Thái Lan, bán
đảo Malaysia và Sumatra (Indonesia). An. scanloni (= An. dirus C) có mặt ở
một vùng tƣơng đối hẹp dọc theo biên giới Nam Myanmar, phía Tây và Nam
Thái Lan, có liên kết mật thiết với môi trƣờng đá vôi. An. baimaii (= An. dirus
D) có mặt từ các vùng Tây Nam Trung Quốc (tỉnh Vân Nam), Tây Thái Lan,
Myanmar, Bangladesh đến đông bắc Ấn Độ và đảo Andaman (Ấn Độ) [92].
An. elegans (= An. dirus E) giới hạn ở vùng rừng có nhiều đồi núi (hilly
forests) của Tây Nam Ấn Độ. An. nemophilous (= An. dirus F) phân bố rải rác
dọc theo bán đảo Thái-Malay, vùng biên giới Thái Lan với Myanmar và
Campuchia. Cuối cùng là An. takasagoensis chỉ có ở Đài Loan. Sự phân bố
6
của các thành viên trong phức hợp Dirus nói riêng và trong nhóm loài
Anopheles leucosphyrus đƣợc chỉ rõ trên hình 1.1. và 1.2. Hình 1.1. Phân bố của 7 thành viên thuộc phức hợp Dirus (An. cracens ở Sumatra
không có trong hình) (theo Manguin và cs., 2008)[71]
7 Hình 1.2. Bản đồ phân bố các thành viên nhóm loài Anopheles leucosphyrus (theo
Valerie Obsomer, 2007)[80] 8
đã đƣợc áp dụng tại Thái Lan để phân biệt 3 loài An. dirus, An. cracens
Sallum & Peyton, An. scanloni Sallum & Peyton và loài An. baimaii Sallum
& Peyton thuộc phức hợp loài Dirus [67]. Tƣơng tự nhƣ vậy, Xu và cs. 1998
đã sử dụng kỹ thuật PCR dựa trên sự khác biệt về trình tự đoạn ITS2 của
ADN ribosome để nghiên cứu quần thể An. dirus A và An. dirus D của Trung
Quốc [115]. Walton và cs (1999) chỉ ra rằng trình tự ITS2 của loài An. dirus
D ở Trung Quốc theo nghiên cứu của Xu (1998) là khác với mẫu ở Thái Lan
và đó có thể là một loài chƣa đƣợc công nhận trong phức hợp loài Dirus
[104].
Walton và cs (2000, 2001) cũng đã đƣa ra những bằng chứng di truyền
chứng minh An. dirus và An. scracens là loài chị em, có quan hệ gần hơn so
với giữa An. dirus và An. scanloni [103,104]. Năm 2002, Manguin và cs đã
dùng kỹ thuật PCR đa mồi để phân biệt An. dirus, An. cracens, An. scanloni
và An. baimaii ở Đông Nam Á [72]. Nghiên cứu xem xét lại nhóm loài
Anopheles leucosphyrus của Sallum và cs. (2005) cho thấy các đặc điểm hình
thái xuất hiện ở các giai đoạn trong chu kỳ sống của muỗi có thể dùng để
phân biệt các loài [92]. Tuy nhiên tác giả cũng nhấn mạnh “do sự biến thiên
thay đổi phức tạp về hình thái của chúng, nên việc tách biệt nhiều loài trong
nhóm này (nhóm Anopheles leucosphyrus) bằng các đặc điểm hình thái sẽ
luôn luôn là một sự thách thức”.
Tóm lại, lịch sử tiến hóa cũng nhƣ mối quan hệ di truyền và chủng loại
phát sinh của các loài trong phức hợp loài Dirus nói riêng và nhóm loài
Anopheles leucosphyrus nói chung vẫn chƣa có những kết luận chính xác và
cần phải có những nghiên cứu sâu hơn.
10
1.2. TỔNG QUAN NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở
VIỆT NAM
Trƣớc năm 1962, ở Việt Nam đã phát hiện ra loài muỗi thuộc nhóm
Mùa phát triển của An. dirus ngoài tự nhiên: An. dirus phát triển chủ
yếu trong mùa mƣa, đỉnh cao vào các tháng 10, 11 hàng năm ở Khánh Hoà,
Phú Yên. Vào các tháng mùa khô (từ tháng 2- 6) mật độ muỗi giảm rất thấp
29,31. Tuy nhiên loài muỗi này có mặt hầu nhƣ quanh năm tại khu vực dân
cƣ ở Vân Canh, Bình Định 30,32 còn ở Sê - Đăng, Quảng Nam lại có đỉnh
vào tháng 6,7 24,25
Tính ƣa thích vật chủ: An. dirus đốt ngƣời cả trong nhà và ngoài nhà
song mật độ đốt ngƣời ngoài nhà bao giờ cũng cao hơn trong nhà (ngƣời ngồi
ngoài nhà cách thôn bản 200-300m, gần rừng hơn) đặc biệt nhà rẫy sát rừng
mùa khô có mật độ muỗi đốt ngƣời đạt tới 1,3 con/ngƣời/ đêm cao hơn mồi
ngƣời trong nhà trong làng khoảng 0,4 con/ngƣời/đêm [31.
Muỗi An. dirus vào nhà đốt ngƣời suốt đêm từ 18 giờ tối đến 6 giờ
sáng, đỉnh cao vào 22 giờ đến 23 giờ. Tính chung trong đêm số lƣợng An.
dirus vào nhà đốt ngƣời tập trung từ chập tối đến nửa đêm. Số lƣợng muỗi hút
máu nhiều hơn vào những đêm trăng sáng 31. Tại Khánh Phú, Khánh Hoà
thu thập muỗi bằng phƣơng pháp soi trong nhà ban ngày chỉ bắt đƣợc muỗi
trong màn hoặc trong bẫy muỗi. Trong đó 97% muỗi vừa hút máu vào đêm
hôm trƣớc (Sella II), chỉ có 3% muỗi đói. Điều này khẳng định đây là loài
muỗi hoang dại có tập tính trú đậu tiêu máu ngoài nhà 31. Ở các địa
phƣơng từ Nghệ An tới Quảng Trị, An. dirus có mặt ở 30 điểm điều tra. Tuy
vậy không nơi nào trong số các điểm này bắt đƣợc muỗi trú đậu trong nhà
mặc dù tiến hành bắt muỗi ngay khi trời vừa sáng. Ở Vân Canh, Bình Định đã
tiến hành thu thập muỗi trong nhà liên tục 12 tháng trƣớc khi sử dụng DDT
12
nhƣng chỉ bắt đƣợc 11 muỗi cái bụng còn máu tƣơi bị kẹt lại do trời mƣa to
trƣớc khi sáng 23,32.
Vai trò truyền bệnh của An. dirus: mổ soi tuyến nƣớc bọt thấy tỷ lệ
nhiễm thoa trùng của loài muỗi này rất cao 3,98%. Bằng kỹ thuật ELISA thì
một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Đây là sự đa dạng về thành phần
kiểu gen của các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau. Tính
đa dạng về gen có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần
thể.
Đa hình di truyền biểu hiện sự biến đổi của vật chất di truyền, biến đổi
về các cặp bazơ nitơ và sự tổ hợp trình tự của các cặp bazơ nitơ trong phân tử
ADN.
Tính đa hình di truyền có thể đƣợc xác định ở nhiều mức độ tổ chức bao
gồm từ số lƣợng, cấu trúc của ADN trong mỗi tế bào cũng nhƣ số lƣợng, cấu
trúc của nhiễm sắc thể, protein hay hình thái của mỗi loài trong các điều kiện
tự nhiên khác nhau
1.3.1. Đa hình enzyme và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở
muỗi
Tính đa hình thực chất là hiện tƣợng biến dị của một kiểu gen. Đa hình
enzyme cũng chính là một trong các hình thức biểu hiện của đa hình di
truyền. Thuật ngữ “isozyme” xuất hiện để biểu thị các enzyme có cùng chức
năng nhƣng do các locus khác nhau quy định. Các biến thể tƣơng ứng của
isozyme là allozyme. Allozyme là các sản phẩm của những alen khác nhau
của cùng một locus. Hiện tƣợng đa hình isozyme trong tự nhiên là kết quả của
đột biến gen cấu trúc của các locus kiểm soát việc tổng hợp các sản phẩm
trên, đột biến có thể xảy ra ở nhiều mức độ khác nhau. Một số axit amin có
Copyright: Tài liệu đại học ©