ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*****
NGUYỄN HỒ THƯ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH, ỨNG DỤNG
VÀ BIỆN PHÁP KIỀM CHẾ TÁC HẠI CỦA
ENZYME POLYPHENOL OXIDASE TỪ THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2012
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tính chất của PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau 18
Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản trong lá trà tươi 36
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng xác định hoạt độ của PPO 41
Bảng 2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn Bradford 42
Bảng 3.1. Độ ẩm của lá trà nguyên liệu 50
Bảng 3.2. Hoạt độ chung của PPO trong nguyên liệu 50
Bảng 3.3. Hàm lượng protein trong nguyên liệu 51
Bảng 3.4. Hoạt độ riêng của PPO từ nguyên liệu 51
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của PPO 52
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 53
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của
PPO 54
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của
PPO 56
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của
PPO theo thời gian 57
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ
của PPO 59
Bảng 3.11 . Kết quả khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian 61
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của
PPO 62
Bảng 3.13. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà đen (mẫu TN) 64
Bảng 3.14. Sự thay đổi OD trong quá trình chế biến trà xanh (mẫu TN) 65
Bảng 3.15. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của rau quả 69
Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của rau quả 69
Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của rau quả 70
Bảng 5.14. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà đen
(mẫu TN) 97
Bảng 5.15. Sự thay đổi OD theo thời gian trong chế biến trà xanh
(mẫu TN) 97
ix
Bảng 5.16. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ chế phẩm PPO thô
từ nguyên liệu 98
Bảng 5.17. Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong
CPE – PPO thô 98
Bảng 5.18. Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của
benzoquinon ở bước sóng 420nm 98
Bảng 5.19. Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin 100
Bảng 5.20. Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch
nghiên cứu 100
Bảng 5.21. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ tyrosin 101
Bảng 5.22. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ của enzyme
bromelin và ficin 102
Bảng 5.23. Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và
enzyme ficin 102
x
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH MINH HỌA
Trang
Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của laccase 15
Hình 1.7. (a) Chu trình xúc tác của laccase
(b) Chu trình xúc tác của hệ thống laccase mediator 16
Hình 1.8. Cấu trúc của vài hợp chất polyphenol trong tự nhiên 33
Hình 1.9. Cây trà 35
Hình 3.1. Sản phẩm trà xanh 67
Hình 3.2. Sản phẩm trà đen 67
Hình 3.3. Nước trà đen và trà xanh 68
Hình 5.1. Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol 103
Hình 5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây 103
Hình 5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây 104
Hình 5.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây 104
Hình 5.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây 105
Hình 5.6. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây 105
Hình 5.7. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây 106
Hình 5.8. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây 106
Hình 5.9. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây 107
Hình 5.10. Chế phẩm PPO thô từ lá trà 107
ii
MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ, đồ thị và hình minh họa
Trang
Mở đầu 1
1.2.8.4. Phương pháp gen 32
1.2.9. Cơ chất của PPO: Phenol 33
1.3. Cây trà và các sản phẩm từ trà 34
1.3.1. Giới thiệu chung về cây trà 34
1.3.2. Các sản phẩm từ trà 36
CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 39
2.1. Vật liệu 39
2.1.1. Nguyên liệu 39
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 39
2.1.3. Hóa chất 39
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 39
2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm của lá trà 39
2.2.2. Phương pháp thu nhận PPO từ nguyên liệu 40
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ của PPO 40
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích 41
2.2.5. Xác định hoạt độ riêng của PPO 42
2.2.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của
PPO 43
2.2.6.1. Phương pháp xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO 43
2.2.6.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của
PPO 43
2.2.6.3. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của
PPO 43
iv
2.2.6.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền
của PPO 44
2.2.6.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của PPO 53
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PPO 54
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO 56
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của PPO theo thời
gian 57
3.2.6. Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của PPO 59
3.2.7. Khảo sát động học phản ứng của PPO theo thời gian 60
3.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt độ của PPO 62
3.3. Ứng dụng PPO trong tạo màu cho trà trong công nghệ chế biến
trà 63
3.3.1. Sự thay đổi màu dung dịch do sự oxi hóa hợp chất polyphenol
thành quinon trong công nghệ chế biến trà 63
3.3.2. Sản phẩm trà xanh 66
3.3.3. Sản phẩm trà đen 67
3.4. Một số biện pháp kiềm chế tác hại của PPO trong sẫm màu rau
quả 68
3.4. 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 69
3.4.2. Ảnh hưởng của pH 69
3.4. 3. Sử dụng hóa chất 70
3.4. 4. Sử dụng enzyme 70
3.5. Thu nhận chế phẩm PPO thô từ nguyên liệu 71
CHƢƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73
Tài liệu tham khảo 75
CHƢƠNG 5 : PHỤ LỤC 82
1
MỞ ĐẦU
2
Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm :
- Khảo sát các đặc tính và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme
PPO như nhiệt độ, pH, cơ chất, các chất ức chế enzyme, ….
- Khảo sát ứng dụng của enzyme trong việc tạo màu cho sản phẩm thực
phẩm.
- Khảo sát một số tác nhân kiềm chế tác hại của enzyme như nhiệt độ, pH,
hóa chất, enzyme, ….
i
enzyme và có tên gọi chung là oxidoreductase. Trong điều kiện sinh học oxi phân tử
có khả năng oxi hóa cơ chất khi được hoạt hóa bởi các enzyme đặc hiệu – các chất
hoạt hóa oxi (oxydase) hay các chất hoạt hóa hidro (dehydrogenase). Nhóm enzyme
oxi hóa khử rất phổ biến trong tế bào của mọi sinh vật vì phản ứng oxi hóa khử là
một trong những quá trình cơ bản nhất của sự sống. [10]
1.1.1.Các dehydrogenase [10]
Đa số các phản ứng oxi hóa sinh học là phản ứng tách hidro khỏi cơ chất.
Enzyme xúc tác quá trình này gọi là dehydrogenase. Cơ chế tác dụng của chúng
được biểu diễn theo sơ đồ phản ứng :
Cơ chất bị oxi hóa (khử) mất đi nguyên tử hidro còn chất B nhận hidro (oxi
hóa) được hoàn nguyên. Tất cả dehydrogenase đều là enzyme có cấu tạo gồm 2 cấu
tử (protein + phi protein), tính đặc hiệu của dehydrogenase do phần protein của
enzyme quyết định.
Theo bản chất của chất nhận hydro, dehydrogenase được chia thành 2 nhóm
chính : dehydrogenase hiếu khí (enzyme xúc tác chuyển hidro trực tiếp cho oxi
không khí) và dehydrogenase yếm khí (enzyme xúc tác chuyển hidro cho một chất
trung gian không phải là oxi)
Dựa vào bản chất của nhóm ngoại, dehydrogenase được chia thành
dehydrogenase – piridin, dehydrogenase – flavin, dehydrogenase – ubiquinon
1.1.1.1. Dehydrogenase – piridin
Dehydrogenase – piridin là enzyme có nhóm ngoại là dẫn xuất piridin, trong
quá trình oxi hóa sinh học codehydrogenase piridin là chất tiếp nhận hydro đầu tiên,
có gần khoảng 200 enzyme loại này.
4
Nhóm ngoại của dehydrogenase – piridin có cấu trúc phức tạp chứa vitamin
PP gọi tắt là NAD (nicotinamit – adenin – dinucleotit) và NADP (nicotinamit –
O + Q
Nhóm hoạt động có chức năng chuyển và nhận H
+
là vòng quinon theo sơ đồ
sau
(hay NADP)
(hay FMN)
6
Phương trình tổng quát chuyển hydro của enzyme – ubiquinon
Enzyme trao đổi [H
+
] với cơ chất AH
2
theo sơ đồ sau
1.1.2. Các oxydase [10]
Đây là nhóm enzyme oxi hóa cơ chất, xúc tác phản ứng chuyển hidro (hay
electron) trực tiếp từ cơ chất sang oxi phân tử tạo thành H
2
O hay H
2
O
2
+ H
2
O
2
→ A + 2H
2
O
* Catalase (có chứa Fe trong thành phần cấu tạo): Xúc tác phản ứng phân
hủy H
2
O
2
tạo O
2
theo phản ứng
* Polyphenol oxidase (có chứa Cu trong thành phần cấu tạo): là enzyme xúc
tác phản ứng oxi hóa hợp chất polyphenol thành quinon. Enzyme này khá phổ biến
trong thực vật và vi khuẩn. Polyphenol oxidase không có tính đặc hiệu cơ chất cao.
Polyphenol oxidase và polyphenol có trong rau củ và trái cây nên khi rau quả
bị dập, cắt, thái, thì sự phối hợp giữa các giai đoạn oxi hóa và khử của sự hô hấp
bị phá vỡ, các o-quinon được tạo thành do sự oxi hóa các polyphenol có thể trùng
hợp với axitamin, amin để hình thành các sản phẩm có màu, đây là nguyên nhân
gây hiện tượng thâm đen khi cắt táo, khoai tây, vò lá chè, thuốc lá,
* Ascorbat – oxydase (có chứa Cu trong thành phần cấu tạo): là enzyme
oxi hóa vitamin C (acid ascorbic), có chứa trong hầu hết các mô xanh của thực vật
và trong tảo, cơ chế tác dụng có thể biểu diễn theo phản ứng
9
1.2.3.1. Tyrosinase và catechol oxidase
a. Khái niệm
Tyrosinase (E.C.1.14.18.1, monophenol monooxydase) và catechol oxidase
(E.C. 1.10.3.1, o-diphenol oxidase) là hai enzyme có cấu trúc tương tự thuộc nhóm
metalloprotein có chứa nguyên tử đồng dạng 3.
Tyrosinase xúc tác 2 phản ứng khác nhau : hydroxyl hóa monophenol thành
o-diphenol (hoạt tính cresolase hay monophenolase) và sau đó oxi hóa o-diphenol
thành o-quinone tương ứng (hoạt tính catecholase hay diphenolase) và đồng thời
khử phân tử oxi thành nước. Enzyme chỉ xúc tác oxi hóa ο-diphenol thành ο-quinon
tương ứng được gọi là catechol oxidase và thông qua hoạt tính xúc tác để phân biệt
catechol oxidase với tyrosinase. [14, 26, 41]
Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của tyrosinase và catechol oxidase [41]
b. Cấu trúc phân tử của tyrosinase và catechol oxidase
Tyrosinase và catechol oxidase có cấu trúc đặc trưng gồm 3 domain : một
domain đầu N, một domain trung tâm xúc tác chứa một cặp ion đồng (CuA và CuB)
và một domain đầu C nối với domain xúc tác bởi vùng liên kết phi cấu trúc. Mỗi ion
đồng ở trung tâm xúc tác gắn với ba gốc histidine (His) là nơi tương tác của
tyrosinase với cả phân tử oxi và cơ chất phenolic [33]. Tyrosinase được mô tả là
enzyme monomeric, trong khi phân tích cấu trúc của tyrosinase từ Bacillus
megaterium phát hiện cấu trúc dimeric. [33]
Những phân tích về trình tự và cấu trúc của protein đồng dạng 3 cho phép
nhận ra các đặc trưng về cấu trúc và sự hoạt động của tyrosinase. Cầu nối thioether
deoxy
+ H
2
O
11
Khi o-diphenol hiện diện trong hệ thống phản ứng, sự oxi hóa xảy ra tạo ra
o-quinone tương ứng. Nhưng nếu monophenol được sử dụng là cơ chất, hoạt động
của enzyme xuất hiện khi có tác nhân khử. Phân tử oxi kết hợp với
deoxy-tyrosinase và oxi hóa nó thành oxy-tyrosinase.
E
deoxy
+ O
2
→ E
oxy
Bước tiếp theo của quá trình oxi hóa khử là sự cạnh tranh của monophenol
và o-diphenol. Khi cơ chất monophenol trội hơn trong hỗn hợp phản ứng,
oxy-tyrosinase kết hợp với monophenol và oxi hóa nó thành o-diphenol. Sản phẩm
o-diphenol trong chu trình này thì tiếp tục bị oxi hóa thành o-quinone.
E
oxy
+ monophenol → E
oxy
– M + H
+
E
– D + 3H
+
→ E
met
+ o-quinone + H
2
O
Met-tyrosinase bị khử thành dạng deoxy và o-diphenol khác được sử dụng
như là chất khử tại thời điểm này và được phóng thích như là o-quinone thứ hai.
Deoxy-tyrosinase bị oxi hóa thành dạng oxy với phân tử oxi
E
met
+ o-diphenol → E
met
–D
E
met
–D + H
+
→ E
deoxy
+ o-quinone + H
2
O
Chu trình này được coi như chu trình diphenolase (hay catecholase). [39]
12
đoạn peptid gồm hai gốc histidine và một gốc cystein hấp thụ mạnh bước sóng
610nm nên có màu xanh. Vùng nguyên tử đồng T
2
liên kết với hai gốc histidin và
không có màu xanh. Vùng nguyên tử đồng T
3
gồm hai nguyên tử đồng nối với nhau
bằng cầu nối hydroxyl nằm gần nhau hấp thụ tia cực tím yếu ở bước sóng 330nm.
[24]
Vùng nguyên tử đồng T
1
tham gia chủ yếu trong việc nhận điện tử và truyền
đến các vị trí khác. Vùng nguyên tử đồng T
2
, T
3
hình thành trung tâm gồm 3 nguyên
tử đồng làm nhiệm vụ kích hoạt liên kết và chuyển điện tử tới O
2
tạo thành nước.
[24]
Copyright: Tài liệu đại học ©