ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN

2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG 15
2.2. NGUYÊN LIỆU 15
2.2.1. Chủng vi sinh vật 15
2.2.2. Môi trƣờng 15
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.3.1. Nuôi cấy giống khởi động 16
2.3.2. Phân tích trình tự đa gen 16
2.3.3. Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu 18
2.3.4. Lựa chọn môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng
sinh enzyme ngoại bào cao 20 2.3.5. Phƣơng pháp xác định protein 21
2.3.6. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào 21
2.3.7. Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào 25
2.3.8. Xác định đặc tính enzyme ngoại bào 27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU 28
3.1.1. Tuyển chọn chủng 28
3.1.2. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA 28
3.1.3. Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen 29
3.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901 30
3.2.1. Đặc điểm hình thái 30
3.2.2. Đặc điểm sinh học của chủng SP 1901 31
3.3. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO 38
3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp 38
3.3.2. Tinh sạch enzyme ngoại bào bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 41
3.3.3. Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel 43
3.3.4. Xác định trọng lƣợng phân tử xylanase bằng điện di SDS-PAGE 44
3.3.5. Hiệu quả tinh sạch xylanase từ chủng SP 1901 45
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống
enzyme xylanolytic………………………………….…………………………
8
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin…………………….
11
Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide………

Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ………………………
36
Hình 3.8. Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử API
ZYM………………………………….………………………………………
37
Hình 3.9. Khả năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phƣơng pháp
khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E. coli (a). Vi khuẩn
Shigella sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ………………………………………

38
Hình 3.10. Khả năng sinh trƣởng trên các môi trƣờng khác nhau (a, b) và hoạt
độ xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi nuôi cấy trên 10 loại môi
trƣờng ở các giờ khác nhau………………………………….……………….
39 Hình 3.11. Hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) khi nuôi cấy
trên môi trƣờng có bổ sung CMC và glucose và môi trƣờng NA dịch thể tại
các giờ khác nhau………………………………….…………………………
39
Hình 3.12. Hoạt tính amylase và protease của chủng SP 1901 trên môi trƣờng
có bổ sung CMC và glucose và môi trƣờng NA dịch thể……………………
40
Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….……………
41
Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………….…………
42
Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BSA Bovine serum albumin
CMC Carboxymethyl cellulose
DNA Deoxyribonucleic axít
DNS Dinitrosalicylic
IAA Indole-3-acetic axít
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucleic axít
SDS Sodium dodecyl sulfate
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở
nên rất phổ biến. Con ngƣời đã và đang khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh
vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con ngƣời
đã tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm nhƣ vacxin, kháng sinh, hormone,
vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con ngƣời. Trong nông
nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã đƣợc sản xuất để
diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong công nghiệp thực phẩm,
con ngƣời đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế
phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. Ngoài ra, vi sinh vật
còn đƣợc ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nƣớc thải trong sản xuất công

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis
[45]. B. subtilis đƣợc Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên
của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là ―Vibrio subtilis‖. Năm 1872, nhà sinh học
ngƣời Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis.

nhóm vi khuẩn B. subtilis [45].
Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học
đã sử dụng phƣơng pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn đến
cấp độ loài và dƣới loài [25]. Đặc biệt trong nhóm B. subtilis, bằng phƣơng pháp
phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong
nhóm này đã đƣợc phân tách thành các loài phụ nhƣ B. subtilis đƣợc phân thành B.
subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp.
inaquosorum; B. amyloliquefaciens đƣợc phân thành B. amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [42].
Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens
nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phƣơng pháp phân loại hiện đại. Hiện
nay ở Việt Nam hầu nhƣ chƣa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một
loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dƣới loài dựa trên việc
phân tích trình tự đa gen.
1.1.2. Lịch sử phát hiện
B. amyloliquefaciens đƣợc Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng
sinh α-amylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chƣa đƣợc xếp loại
trong bảng Danh pháp Vi khuẩn. Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ
luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B. amyloliquefaciens mới đƣợc công
bố [43].
Thời gian đầu, loài vi khuẩn này đƣợc xem là dòng khác của B. subtilis hay
loài phụ B. subtilis subsp. amyoliquefaciens. B. amyloliquefaciens mang rất nhiều
đặc điểm tƣơng đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng
các phƣơng pháp phân loại thông thƣờng rất khó để phân biệt giữa chúng. Đến năm
1987, B. amyloliquefaciens mới đƣợc tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả
lai DNA lần lƣợt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B.
pumilus [43].
Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh
thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã đƣợc công bố. Năm 2010, Borriss và
cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng

nhiều đặc tính quý nhƣ khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền
nhiệt. Do đó, enzyme từ B. amyloliquefaciens đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công
nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp
sản xuất chất tẩy rửa [21].
6

Bên cạnh đó, nhóm B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh rễ cây thực vật
có khả năng sinh phytase đã đƣợc công bố và gen mã hóa phytase của chúng đã
đƣợc biểu hiện thành công trên chủng B. subtilis MU331 [31]. Phytase là enzyme
phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myo-inositol và các
dạng phosphate hòa tan dễ hấp thụ trong hệ tiêu hóa động vật. Vì vậy, phytase đã
đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho
nhóm động vật dạ dầy đơn và làm giảm nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng do hàm lƣợng
phosphate dƣ thừa thải ra môi trƣờng nƣớc [29].
1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh
Các loài thuộc nhóm B. subtilis đã đƣợc biết đến nhờ khả năng sinh các chất
kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi
bậc hai khác nhƣ chất kháng virus, chất kháng ung thƣ và chất ức chế miễn dịch
[47]. Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide đƣợc tổng hợp qua
ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics). Lantibiotics có phổ kháng khuẩn
hẹp và thƣờng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nhiều chất kháng sinh có bản
chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã đƣợc công bố từ loài B.
amyloliquefaciens nhƣ bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và
bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [18] [38].
Bacylicin là chất dipeptide đƣợc tạo nên từ L-analine và một amino axít hiếm L-
anticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây bệnh
cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động nhƣ chất tẩy rửa trên màng tế bào. Chất
này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm. Iturin, fengycin và
bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây. Nghiên cứu
gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B. amyloliquefaciens có khả

̀
ng ruô
̣
t , qua đo
́
ngăn ngƣ
̀
a va
̀
pho
̀
ng chống ca
́
c bê
̣
nh
tiêu cha
̉
y thƣơ
̀
ng gă
̣
p . Ngoài ra , vi sinh vật trong probiotics co
̀
n tăng cƣơ
̀
ng kha
̉

năng chuyển hóa lactose, điều ho
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme
xylanolytic [34].
Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylosyl đƣợc nối với nhau bằng liên
kết β-1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm các
monomer D-xylose nối với nhau bằng liên kết β-1,3. Thông thƣờng, xylan chiếm
khoảng 15-30% trọng lƣợng khô của cây hạt kín và khoảng 7-15% của cây hạt trần.
Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lƣợng khô của chúng
[35].
Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải có
hệ thống enzyme xylanolytic. Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tƣơng
hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đƣờng [34].
1.3.1.2. Nguồn sản sinh xylanase
Xylanase đƣợc sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật
nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi
khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57].
Các loại xylanase đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ƣa kiềm có khả năng
chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn
trong công nghiệp [39].
1.3.1.3. Đặc tính hoạt động của xylanase
Axít glutamic là axít amin quyết định sự hoạt động của xylanase [10]. Sự
thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống
enzyme xylanolytic (hình 1.1.).

9

Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể nhƣ
sau:
 β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase

70
o
C) nên có thể ngăn chặn đƣợc sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nƣớc hoa quả ở
nhiệt độ cao [27].
Xylanase còn đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ trong công
nghệ sản xuất bánh nƣớng, hỗ trợ quá trình đƣờng hóa lignocellulose (một
polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật). Xylanase còn đƣợc sử
dụng để loại lignin khỏi bột giấy.
Trong công nghiệp sản xuất giấy và vải sợi, xylanase tham gia vào quá trình
tách xylan và lignin để thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ dàng. Xylanase
giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11].
Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức
ăn chăn nuôi. Vì thế việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gia súc và gia cầm
sẽ giúp chúng dễ tiêu hóa và dễ hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần làm giảm ô
nhiễm môi trƣờng.
1.3.2. α-amylase
1.3.2.1. Cấu tạo tinh bột và glycogen
Cơ chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen. Tinh bột là nhóm
carbohydrate ở thực vật. Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt nhƣ khoai
lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau
đều có cấu tạo từ 20-30% amylose và 70-80% amylopectin.
Amylose đƣợc cấu tạo từ 200-1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên
kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh. Amylopectin đƣợc
cấu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và
α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh.
Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh
bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đƣờng hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị
thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất
này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
Dƣới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose.
Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,
maltotriose và maltose.
Sau phản ứng, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87%
maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tƣơng tự nhƣng vì
không phân cắt đƣợc liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đƣờng
nói trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose [1].
1.3.2.4. Ứng dụng của α-amylase
Với khả năng thủy phân tinh bột nên α-amylase đã đƣợc con ngƣời sử dụng
từ rất sớm. Trong công nghiệp thực phẩm, ngƣời ta thƣờng bổ sung α-amylase vào
bột chế biến trong quá trình sản xuất bánh kẹo. Hoạt động của α-amylase sẽ làm
tăng lƣợng đƣờng khử, lƣợng đƣờng khử này sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa
khử. Kết quả của quá trình đó sẽ tạo cho bánh kẹo có mùi vị và màu hấp dẫn [2].
Cả α-amylase và β-amylase đều đƣợc sử dụng trong sản xuất bánh mì. Các
loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đƣờng, nhờ đó nấm men
Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn và CO
2
, làm
tăng thể tích, tạo ra màu sắc và mùi vị tốt cho bánh [2].
Trong sản xuất bia, các nhà sản xuất thƣờng sử dụng α-amylase có trong
mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có sẵn trong đó. Cồn công nghiệp đƣợc sản

endopeptidase. Exopeptidase là những enzyme có khả năng phân cắt từ hai đầu tận
14

cùng của chuỗi polypeptide. Endopeptidase là những enzyme có khả năng phân cắt
liên kết peptid nằm phía trong phân tử protein [44].
1.3.3.3. Ứng dụng của protease
Trong công nghiệp chế biến thủy sản, đồ hộp và đồ đông lạnh, protease đƣợc
dùng làm mềm thịt nhờ khả năng thủy phân một phần protein có trong thịt. Hoàn
toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân [3].
Trong công nghệ chế biến sữa, protease tham gia vào quá trình thủy phân
protein trong sữa tạo thành các sản phẩm nhƣ pepton, axít amin. Protease có mặt tự
nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ
76-78
o
C. Trƣơng Thị Hòa và cộng sự (1994) đã thử nghiệm sử dụng protease đƣợc
tách chiết từ Aspergillus oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều
kiện xử lý bia tốt hơn [7].
Trong công nghiệp thuộc da, trƣớc khi bị xử lý da thƣờng bị cứng do có
nhiều collagen. Protease đƣợc sử dụng làm mềm da nhờ khả năng thủy phân
collagen. Quá trình đó đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm
dẻo nhất định.
Ngoài ra, protease còn đƣợc phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme
đƣợc bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng tiêu hóa cao , có ý nghĩa lớn
trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.

NA nhƣng không có thạch).
 Môi trƣờng nuôi cấy: Môi trƣờng khoáng (g/l): CaCl
2
-0,5; NH
4
NO
3
-5; KCl-
0,5; MgSO
4
.7H
2
O-0,25; FeSO
4
.7H
2
O-0,01; MnSO
4
.H
2
O-0,01; KH
2
PO
4
-1
[33] có bổ sung một trong số các nguồn carbon: D-glucose, tinh bột tan,
casein, CMC, xylan, chitin, tributyrin và pectin.

16


trong 50-100 l nƣớc MQ hoặc đệm TAE.
2.3.2.2. Phản ứng khuếch đại DNA
Thành phần phản ứng khuếch đại DNA bao gồm 10 µl đệm PCR 10x, 10 µl
dNTP 2 mM, 2 µl mồi xuôi, 2 µl mồi ngƣợc, 2 µl tag polymerase, 1-2 µl DNA
khuôn và bổ sung H
2
O đến thể tích tổng là 25 µl.
Trình tự cặp mồi đã sử dụng (xem phụ lục B).
Chu trình nhiệt của của phản ứng này bao gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3
bƣớc: (i) gây biến tính DNA bằng cách đun hỗn hợp ở 95
o
C trong 30 giây, (ii) sau
đó gắn mồi bằng cách hạ nhiệt độ xuống 56
o
C trong 15 giây, (iii) tiếp theo để DNA
polymerase kéo dài chuỗi thì nhiệt độ tiếp tục đƣợc nâng lên 72
o
C trong 1 phút.

17

2.3.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kit QIAgen (Đức) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Các bƣớc đƣợc
thực hiện nhƣ sau: đầu tiên, bổ sung dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 và
trộn đều, chuyển hỗn hợp mẫu vào cột rồi ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút sau đó đổ
bỏ lớp dịch phía dƣới cột.
Bổ sung 750 µl đệm PE lên cột. Ly tâm cột 10.000 v/p trong 1 phút sau đó
đổ bỏ dịch dƣới cột. Cột đƣợc ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút. Chuyển cột sang
ống eppendorf mới sau đó thêm 30 µl nƣớc. Hỗn hợp đƣợc để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút sau đó đem ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút. Phần dịch phía dƣới đƣợc

Sử dụng kit Bigdye® terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) theo hƣớng
dẫn của nhà sản xuất để giải trình tự DNA. Trình tự DNA của các gen đƣợc đọc trên
máy giải trình tự 3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng POP - 6 polymer. Sắc đồ